本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領(lǐng)域中一種定位慢性脊髓損傷瘢痕組織的方法。
背景技術(shù)：
：脊髓是中樞神經(jīng)的重要組成部分，主要功能是傳送腦與外周神經(jīng)之間的神經(jīng)信息，同時也是許多簡單反射活動的低級中樞。脊髓損傷多為創(chuàng)傷性，常見于交通事故、砸傷、摔傷、運動性損傷和一些如地震、礦難等自然災難。脊髓損傷后，由于損傷及其繼發(fā)的一系列的病理生理反應，包括缺血缺氧以及機體免疫反應等，導致軸突和髓鞘分解，甚至神經(jīng)元胞體死亡，致使?jié)u進性的神經(jīng)組織丟失。同時，損傷區(qū)的星型膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞以及成纖維細胞等活化、增殖并分泌細胞外基質(zhì)成份，形成瘢痕組織，這些瘢痕組織在損傷區(qū)域邊緣形成屏障。這些瘢痕組織在損傷不同時期具有不同的作用。在損傷的急性期，這些瘢痕組織可以抑制損傷的進一步擴散；而在損傷的急性期后(數(shù)周至數(shù)月)瘢痕組織反而抑制神經(jīng)的修復，不僅其本身可作為一種物理屏障阻礙神經(jīng)纖維再生，而且其包含的細胞外基質(zhì)成份硫酸軟骨素蛋白聚糖(chondroitinsulfateproteoglycan,CSPG)可作為一種軸突再生抑制分子抑制神經(jīng)的再生。在脊髓損傷后，瘢痕組織與周圍正常的神經(jīng)組織相連接，因此如何判定瘢痕組織，從而安全的切除瘢痕組織，是重建有利于脊髓損傷修復的微環(huán)境促進脊髓損傷修復面臨的重要問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何定位慢性脊髓損傷處的瘢痕組織。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了動物脊髓損傷處瘢痕組織的定位方法。本發(fā)明所提供的動物脊髓損傷處瘢痕組織的定位方法，包括如下1)和2)：1)結(jié)合如下性狀對動物脊髓損傷處瘢痕組織進行大體定位：所述動物脊髓損傷處的正常脊髓組織呈豆腐狀，具有正常的脊髓結(jié)構(gòu)；所述動物脊髓損傷處的瘢痕組織周圍質(zhì)地致密偏硬，瘢痕組織中間或有壞死組織或空洞；2)利用電生理檢測儀對所述動物脊髓損傷處瘢痕組織的近頭端進行定位和對所述動物脊髓損傷處瘢痕組織的近尾端進行定位，從而確定動物脊髓損傷處瘢痕組織與脊髓組織的界限，完成動物脊髓損傷處瘢痕組織的定位；所述對動物脊髓損傷處瘢痕組織的近頭端進行定位包括：將接收電極置于所述動物的頭部，將刺激電極置于所述動物脊髓損傷處并沿向所述動物頭部的方向移動所述刺激電極，通過體感誘發(fā)電位的有無判斷脊髓組織與瘢痕組織的界限，如果出現(xiàn)體感誘發(fā)電位，所述刺激電極處的組織為正常脊髓組織，如果沒有體感誘發(fā)電位，所述刺 激電極處的組織為瘢痕組織；所述對動物脊髓損傷處瘢痕組織的近尾端進行定位包括：將接收電極置于所述動物的下肢肌肉或肛門括約肌處，將刺激電極置于所述動物脊髓損傷處并沿向所述動物下肢的方向移動所述刺激電極，通過運動誘發(fā)電位的有無判斷脊髓組織與瘢痕組織的界限，如果出現(xiàn)運動誘發(fā)電位，所述刺激電極處的組織為正常脊髓組織，如果沒有運動誘發(fā)電位，所述刺激電極處的組織為瘢痕組織。上述方法中，所述電生理檢測儀可為肌電儀。所述肌電儀具體可為北京維迪康宏醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品，型號為Keypoint9033A07。上述方法中，所述動物可為哺乳動物。所述哺乳動物可為犬或人。所述犬可為比格犬。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了動物脊髓損傷瘢痕組織的切除方法。本發(fā)明所提供的動物脊髓損傷瘢痕組織的切除方法，包括利用所述動物脊髓損傷瘢痕組織的定位方法確定動物脊髓損傷瘢痕組織的邊界，利用手術(shù)的方法切除所述動物脊髓損傷瘢痕組織。上述動物脊髓損傷瘢痕組織的切除方法中，所述動物可為哺乳動物。所述哺乳動物可為犬或人。所述犬可為比格犬。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述電生理檢測儀在制備用于定位動物脊髓損傷處瘢痕組織的裝置中的應用。上述電生理檢測儀在制備用于定位動物脊髓損傷處瘢痕組織的裝置中的應用中，所述裝置還包括記載有以下內(nèi)容的載體：動物脊髓損傷處瘢痕組織的定位方法包括對動物脊髓損傷處瘢痕組織的近頭端進行定位和對動物脊髓損傷處瘢痕組織的近尾端進行定位，從而確定動物脊髓損傷處瘢痕組織與脊髓組織的界限，完成動物脊髓損傷處瘢痕組織的定位；所述對動物脊髓損傷處瘢痕組織的近頭端進行定位包括：將接收電極置于所述動物的頭部，將刺激電極置于所述動物脊髓損傷處并沿向所述動物頭部的方向移動所述刺激電極，通過體感誘發(fā)電位的有無判斷脊髓組織與瘢痕組織的界限，如果出現(xiàn)體感誘發(fā)電位，所述刺激電極處的組織為正常脊髓組織，如果沒有體感誘發(fā)電位，所述刺激電極處的組織為瘢痕組織；所述對動物脊髓損傷處瘢痕組織的近尾端進行定位包括：將接收電極置于所述動物的下肢肌肉或肛門括約肌處，將刺激電極置于所述動物脊髓損傷處并沿向所述動物下肢的方向移動所述刺激電極，通過運動誘發(fā)電位的有無判斷脊髓組織與瘢痕組織的界限，如果出現(xiàn)運動誘發(fā)電位，所述刺激電極處的組織為正常脊髓組織，如果沒有運動誘發(fā)電位，所述刺激電極處的組織為瘢痕組織。實驗證明，利用本發(fā)明的動物脊髓損傷處瘢痕組織的定位方法對動物的瘢痕組織進行定位并進行瘢痕組織的切除后，與瘢痕組織切除前動物的行為學沒有變化，感覺和運動平面均未變化，表明瘢痕組織的切除手術(shù)未切除正常的脊髓組織，也未對正常的脊髓組織造成損傷，未對比格犬造成不良影響，說明成功進行了瘢痕組織的切除手術(shù)。并且切除的瘢痕組織中瘢痕組織的標志物CSPG陽性，表明切除的瘢痕組織為瘢痕組織；而神經(jīng)絲NF染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)切除的瘢痕組織中未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)絲NF染色，表明切除的瘢痕組織中不含有神經(jīng)絲。實驗證明，利用本發(fā)明的動物脊髓損傷處瘢痕組織的定位方法可以對動物的瘢痕組織進行成功的定位，并可根據(jù)該定位結(jié)果進行瘢痕組織的切除。附圖說明圖1為比格犬瘢痕組織的切除手術(shù)中切除的瘢痕組織的CSPG檢測結(jié)果。圖2為比格犬瘢痕組織的切除手術(shù)中切除的瘢痕組織的NF染色結(jié)果。圖3為人瘢痕組織的切除手術(shù)中切除的瘢痕組織的CSPG檢測結(jié)果。圖4為人瘢痕組織的切除手術(shù)中切除的瘢痕組織的NF染色結(jié)果。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的比格犬為南京安立默科技有限公司公司產(chǎn)品。實施例1、比格犬脊髓損傷處瘢痕組織的定位和切除選用13只1-1.5周歲雌性比格犬，體重7-9kg。一、瘢痕組織的切除將比格犬麻醉后，打開T7-T9椎板暴露脊髓組織，將T8段比格犬的脊髓切除2-3mm(由于脊髓回縮，兩斷端之間的長度約為5mm)，得到犬急性脊髓全橫斷損傷模型。將進行脊髓全橫斷損傷手術(shù)的當天記為手術(shù)0天。術(shù)后進行抗菌消炎常規(guī)護理，凈化間內(nèi)飼養(yǎng)。手術(shù)2個月后，進行瘢痕組織的定位及切除手術(shù)，具體方法如下：將比格犬麻醉，打開T7-T9椎板暴露脊髓組織，利用肉眼對動物脊髓損傷瘢痕組織進行大體的定位，脊髓組織呈豆腐狀，顏色泛白，具有正常的脊髓結(jié)構(gòu)；瘢痕組織周圍質(zhì)地致密偏硬，瘢痕組織中間或有壞死組織或空洞，顏色偏紅。而后利用肌電儀(北京維迪康宏醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品，型號為Keypoint9033A07)對瘢痕組織進行進一步的定位：對比 格犬脊髓損傷處瘢痕組織的近頭端進行定位包括：將接收電極置于比格犬的頭部，將刺激電極置于比格犬脊髓損傷處并沿向比格犬頭部的方向移動刺激電極，通過體感誘發(fā)電位的有無判斷脊髓組織與瘢痕組織的界限，如果出現(xiàn)體感誘發(fā)電位，刺激電極處的組織為脊髓組織，如果沒有體感誘發(fā)電位，刺激電極處的組織為瘢痕組織；對比格犬脊髓損傷處瘢痕組織的近尾端進行定位包括：將接收電極置于比格犬的下肢肌肉處，將刺激電極置于比格犬脊髓損傷處并沿向比格犬下肢的方向移動刺激電極，通過運動誘發(fā)電位的有無判斷脊髓組織與瘢痕組織的界限，如果出現(xiàn)運動誘發(fā)電位，刺激電極處的組織為脊髓組織，如果沒有運動誘發(fā)電位，刺激電極處的組織為瘢痕組織。二、瘢痕組織切除的檢測1、比格犬行為學評分為進一步確定瘢痕組織的切除是否對比格犬造成創(chuàng)傷，在比格犬瘢痕組織切除手術(shù)前1天和手術(shù)后7天分別進行比格犬行為學評分。在評估過程中，比格犬在一個開放的環(huán)境中自由移動，由兩名觀察者評分。觀察者熟悉評分細則但不知各比格犬的手術(shù)情況。評分分為0-14級，14分為功能正常，0分為功能完全喪失。Olby評分標準如表1，評分結(jié)果如表2。表1、Olby評分標準分數(shù)行為0無任何后肢運動或深度疼痛2無任何后肢運動，但尾部自發(fā)運動3后肢不能承重，僅有一個關(guān)節(jié)(髖關(guān)節(jié))運動4后肢不能承重，多于一個關(guān)節(jié)運動，運動時間小于50％5后肢不能承重，多于一個關(guān)節(jié)運動，運動時間大于50％6后肢能承重，但承重時間小于10％7后肢能承重，但承重時間在10-50％之間8后肢能承重，承重時間大于50％9后肢100％承重，但肌力沒有完全恢復，步態(tài)錯誤時間大于90％10后肢100％承重，但肌力沒有完全恢復，步態(tài)錯時間在50-90％之間11后肢100％承重，但肌力沒有完全恢復，步態(tài)錯誤時間小于50％12肌力正常，但后肢步態(tài)混亂，錯誤時間大于50％13肌力正常，但后肢步態(tài)混亂，錯誤時間小于50％14正常步態(tài)表2、Olby評分結(jié)果比格犬編號術(shù)前評分術(shù)后評分1332333334445336337338339331033114412331333行為學評分結(jié)果顯示切除瘢痕前后，犬的行為學沒有變化，表明瘢痕組織的切除手術(shù)未切除正常的脊髓組織，也未對正常的脊髓組織造成損傷，未對比格犬造成不良影響，說明成功進行了瘢痕組織的切除手術(shù)。2、瘢痕組織的組織學染色將步驟一手術(shù)中切除的瘢痕組織4％多聚甲醛中固定48小時。石蠟包埋，切片，厚度5μm，使用Poly-D-lysine處理過的玻片粘片，烘干，得到瘢痕組織切片，然后分別進行瘢痕組織的標志物CSPG的檢測和神經(jīng)絲NF染色。瘢痕組織的標志物CSPG的檢測方法如下：(1)將瘢痕組織切片用PBS洗一遍后，用山羊血清(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，貨號為ZLI-9021)封閉液封閉20-40min；(2)吸去山羊血清，PBS洗兩遍，將切片周圍的水用吸水紙擦凈；(3)加入200μL混合了來源于小鼠的anti-CSPG抗體(1:200)(Abcam,ab11570)于切片組織上，使液體完全覆蓋脊髓組織；(4)4℃下孵育過夜；(5)PBS洗凈兩三遍；(6)按照二抗說明書稀釋的熒光二抗(invitrogen公司的Alexa488DonkeyAnti-MouseIgG(H+L)，貨號為CA21202s)，室溫孵育1小時，注意避光操作；(7)PBS洗兩遍，避光自然晾干；(8)滴加含DAPI的封片劑后，封上蓋玻片，顯微鏡下觀察，照相。神經(jīng)絲NF染色方法如下：(1)將瘢痕組織切片用PBS洗一遍后，用山羊血清(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，貨號為ZLI-9021)封閉液封閉20-40min；(2)吸去山羊血清，PBS洗兩遍，將切片周圍的水用吸水紙擦凈；(3)加入200μL來源于鼠的anti-NF(1:200)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，貨號為ZM-0198)于切片組織上，使液體完全覆蓋脊髓組織；(4)4℃下孵育過夜；(5)PBS洗凈兩三遍；(6)按照二抗說明書稀釋的熒光二抗(invitrogen公司的Alexa594DonkeyAnti-RabbitIgG(H+L)，貨號為A21207)，室溫孵育1小時，注意避光操作；(7)PBS洗兩遍，避光自然晾干；(8)滴加含DAPI的封片劑后，封上蓋玻片，顯微鏡下觀察，照相。結(jié)果表明，切除的瘢痕組織中瘢痕組織的標志物CSPG陽性(圖1)，表明切除的瘢痕組織為瘢痕組織；而神經(jīng)絲NF染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)切除的瘢痕組織中未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)絲NF染色(圖2)，表明切除的瘢痕組織中不含有神經(jīng)絲。實施例2、人的慢性脊髓損傷瘢痕切除按照《醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)開展臨床研究項目管理辦法》等政策開展臨床研究。選取5名全橫斷脊髓損傷患者，5名全橫斷脊髓損傷患者損傷節(jié)段范圍頸6到胸12，損傷距離0.5cm-4.5cm，損傷時間為2個月-32個月，未有其它嚴重的合并癥。這5名全橫斷脊髓損傷患者簽署知情同意書后按照實施例1步驟一的方法進行脊髓損傷處瘢痕組織的切除手術(shù)。脊髓損傷瘢痕切除手術(shù)后7天采用國際標準的ASIA評分方法進行評分，發(fā)現(xiàn)5名患者術(shù)前和術(shù)后感覺和運動平面均未變化，說明切除組織為瘢痕組織，脊髓損傷瘢痕切除手術(shù)中未切除正常的脊髓組織，也未對正常的脊髓組織造成損傷。將脊髓損傷瘢痕切除手術(shù)切除的瘢痕組織4％多聚甲醛中固定48小時。石蠟包埋，切片，厚度5μm，使用Poly-D-lysine處理過的玻片粘片，烘干，得到瘢痕組織切片，然后按照實施例1步驟二的方法分別進行瘢痕組織的標志物CSPG的檢測和神經(jīng)絲NF染色。結(jié)果表明，結(jié)果表明，切除的瘢痕組織中瘢痕組織的標志物CSPG陽性(圖3)，表明切除的瘢痕組織為瘢痕組織；而神經(jīng)絲NF染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)切除的瘢痕組織中未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)絲NF染色(圖4)，表明切除的瘢痕組織中不含有神經(jīng)絲。當前第1頁1 2 3