本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)和藥物領(lǐng)域，具體涉及小檗堿在制備增強(qiáng)炎癥小體活化藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

小檗堿(Berberine)又稱黃連素，是一種常見的異喹啉生物堿，分子式C₂₀H₁₈NO₄。它存在于小檗科等四個(gè)科十個(gè)屬的許多植物中，可從黃連、黃柏、三顆針等植物中提取。小檗堿為黃色針狀晶體，熔點(diǎn)145℃，難溶于水，能溶于苯、乙醚和氯仿。常用藥物形式為鹽酸小檗堿(結(jié)構(gòu)式如下所示)，在水中的溶解度都比較小。小檗堿對(duì)痢疾桿菌、結(jié)核桿菌、肺炎球菌、傷寒桿菌等多種細(xì)菌都有抑制作用，其中對(duì)痢疾桿菌作用最強(qiáng)。臨床主要用于治療細(xì)菌性痢疾和腸胃炎。小檗堿在治療腸胃炎方面的用途，可見公開專利文件(申請(qǐng)?zhí)朇N201210474880.7)。

鹽酸小檗堿(分子量371.81g/mol)

激活炎癥小體是機(jī)體最重要的固有免疫防御機(jī)制之一，包括：激活caspase-1/caspase-11，促進(jìn)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等炎癥介質(zhì)成熟、釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。正常情況下，上述機(jī)制有利于增強(qiáng)感染部位的局部炎癥反應(yīng)，募集更多的中性粒細(xì)胞等吞噬殺傷細(xì)胞，促進(jìn)病原微生物的清除，最終加速炎癥的緩解和疾病的痊愈。具體而言，細(xì)胞焦亡在機(jī)體抗感染免疫中有如下作用：首先，研究表明caspase-1/caspase-11的表達(dá)及其介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，有利于抑制感染(包括葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠急性腸炎)，加快組織修復(fù)，而焦亡缺陷(caspase-1/caspase-11雙敲除)的小鼠，易受感染而死亡。其次，細(xì)胞焦亡有利于胞內(nèi)致病菌的釋放，并被其他吞噬細(xì)胞所吞噬、殺傷而清除，防止致病菌在胞內(nèi)的繁殖和持續(xù)存在。結(jié)核分枝桿菌、HIV等導(dǎo)致人類重大疾病的病原微生物，都進(jìn)化了一套完整的免疫逃逸機(jī)制；促進(jìn)細(xì)胞焦亡可能是清除此類病原微生物的一個(gè)潛在策略。第三，細(xì)胞焦亡是活化巨噬細(xì)胞的重要退出機(jī)制之一：如果巨噬細(xì)胞持續(xù)激活而不發(fā)生焦亡，其免疫代謝通路已經(jīng)發(fā)生改變，導(dǎo)致脂類沉積，成為泡沫細(xì)胞或脂肪巨噬細(xì)胞，這些細(xì)胞持續(xù)不斷地分泌炎癥因子(內(nèi)源性熱原)和趨化因子，募集其他免疫細(xì)胞至病灶組織，將增加動(dòng)脈粥樣硬化和肥胖癥等慢性炎癥性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。因此，增強(qiáng)感染部位的炎癥小體的活化和感染細(xì)胞(或被激活細(xì)胞)的焦亡，促進(jìn)成熟IL-1β分泌，可能有利于加強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)，加速清除病原微生物、促進(jìn)損傷組織的修復(fù)和疾病的痊愈。

鑒于炎癥小體通路在固有免疫防御中的重要作用，通過(guò)增強(qiáng)炎癥小體的活化，將有助于增強(qiáng)宿主的固有免疫細(xì)胞功能，提高抗感染能力，為細(xì)菌性感染等相關(guān)疾病的治療提供新的途徑。

目前，尚未有關(guān)于小檗堿在增強(qiáng)炎癥小體活化的功能的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供小檗堿在制備增強(qiáng)炎癥小體活化藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

小檗堿在制備增強(qiáng)炎癥小體活化藥物中的應(yīng)用。

所述增強(qiáng)炎癥小體活化的表現(xiàn)包括如下方面：激活caspase-1，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子分泌、成熟、釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。

所述的炎癥細(xì)胞因子為白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)。

所述的增強(qiáng)炎癥小體活化藥物具有增強(qiáng)固有免疫細(xì)胞功能。

所述的增強(qiáng)炎癥小體活化藥物在制備治療系統(tǒng)性細(xì)菌感染藥物中的應(yīng)用。

所述的增強(qiáng)炎癥小體活化藥物在制備治療慢性炎癥性疾病藥物中的應(yīng)用。

所述的增強(qiáng)炎癥小體活化藥物包含可接受的輔料。

所述的輔料優(yōu)選為緩釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、吸附載體、表面活性劑或潤(rùn)滑劑。

所述的增強(qiáng)炎癥小體活化藥物還包含其他起配伍協(xié)同作用的有效成分。

所述的增強(qiáng)炎癥小體活化藥物可為片劑、顆粒劑、膠囊、滴丸、緩釋劑、口服液、注射劑。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：本發(fā)明是基于本發(fā)明的發(fā)明人首先發(fā)現(xiàn)小檗堿具有促進(jìn)IL-1β分泌和增強(qiáng)固有免疫細(xì)胞功能的作用所提出的發(fā)明創(chuàng)造。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)：小檗堿可顯著促進(jìn)ATP誘導(dǎo)LPS激活的巨噬細(xì)胞釋放促炎癥因子IL-1β和危險(xiǎn)信號(hào)分子HMGB1，增強(qiáng)其殺傷胞內(nèi)細(xì)菌的能力，有效降低腹腔細(xì)菌感染引起的死亡。小檗堿的上述新的活性與用途，尚未見公開文獻(xiàn)報(bào)道。小檗堿通過(guò)增強(qiáng)炎癥小體活化，提高IL-1β分泌，從而增強(qiáng)固有免疫細(xì)胞的功能，對(duì)臨床治療系統(tǒng)性細(xì)菌感染和慢性炎癥性疾病等具有重要意義，可用于相關(guān)藥物開發(fā)。

附圖說(shuō)明

圖1是小檗堿(BBR)對(duì)LPS+ATP誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1炎癥小體激活情況的免疫印跡分析圖。

圖2是小檗堿(BBR)對(duì)LPS+ATP誘導(dǎo)的小鼠巰基乙酸鹽(TG)誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞炎癥小體激活情況的免疫印跡分析圖。

圖3是小檗堿(BBR)對(duì)LPS+ATP誘導(dǎo)的小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(BMDM)炎癥小體激活情況的免疫印跡分析圖。

圖4是小檗堿(BBR)促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1細(xì)胞對(duì)吞噬細(xì)菌的殺傷作用的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；*表示P<0.05。

圖5為小檗堿(BBR)降低腹腔細(xì)菌感染小鼠的死亡率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；***表示P<0.001。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

鹽酸小檗堿(純度>98％)(產(chǎn)品編號(hào)B3251)、脂多糖(LPS)(產(chǎn)品名稱Lipopolysaccharides from Escherichia coli 0111:B4，目錄號(hào):L4391)、ATP(目錄號(hào)：A6419)、二甲基亞砜(DMSO)(目錄號(hào)：D8418)、Tween-80(目錄號(hào)：P8074)均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)小檗堿溶于DMSO，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)小檗堿(5mg/mL)溶于含2％(v/v)Tween-80的PBS溶液(pH＝7.4)。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清(FBS)等細(xì)胞培養(yǎng)用物質(zhì)均為Thermo/Gibco公司產(chǎn)品。所用IL-1β抗體(目錄號(hào)：#12242)、HMGB1抗體(目錄號(hào)：#3935)、β-微管蛋白(tubulin)抗體(目錄號(hào)：#2128)均為Cell Signaling Technologies公司產(chǎn)品?？筩aspase-1p10抗體(目錄號(hào)：sc-514)為Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品

實(shí)施例1

(1)細(xì)胞培養(yǎng)和處理

小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于含10％(v/v)胎牛血清和含100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM(完全培養(yǎng)基)中。待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種于6孔板中，細(xì)胞密度為2.5×10⁵/孔(2mL培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24小時(shí)。然后換液，加入含500ng/mL LPS的完全培養(yǎng)基(2mL)，預(yù)處理4小時(shí)，激活J774A.1細(xì)胞，再經(jīng)含不同濃度的小檗堿(1.5、3、6μmol/L)和0.1％(v/v)FBS的DMEM培養(yǎng)基(1.2mL)處理1小時(shí)，最后補(bǔ)加含ATP的DMEM培養(yǎng)基(ATP終濃度為3mmol/L)0.8mL處理1小時(shí)。

(2)上清中caspase-1和HMGB1的檢測(cè)方法

細(xì)胞經(jīng)上述處理后，吸取培養(yǎng)上清，經(jīng)200×g離心5分鐘，上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，先后分別加入脫氧膽酸鈉(使其終濃度為0.15％(w/v))和三氯乙酸(TCA)(使其終濃度為7.2％(v/v))混合均勻后，在4℃沉淀蛋白過(guò)夜。然后經(jīng)14000×g離心30分鐘，棄上清。沉淀加入700μL冷丙酮(-20℃)，充分懸浮、清洗沉淀中的TCA。離心后，棄上清；使沉淀中殘余的丙酮在常溫下?lián)]發(fā)，最后用蛋白電泳樣品液溶解。煮沸5分鐘，經(jīng)上述處理后的蛋白，用免疫印跡方法檢測(cè)。

(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

炎癥小體激活程度以pro-caspase-1(45kDa)和HMGB1釋放反映。結(jié)果如圖1所示，細(xì)胞培養(yǎng)上清中pro-caspase-1和HMGB1的表達(dá)水平隨BBR的劑量增加而升高，小檗堿(BBR)劑量依賴性地促進(jìn)LPS+ATP誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1細(xì)胞炎癥小體活化。

實(shí)施例2

(1)細(xì)胞培養(yǎng)和處理

C57BL/6小鼠，雌性，6-8周齡，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)性養(yǎng)殖一周后，經(jīng)1mL含3％(w/v)巰基乙酸鹽(Thioglycollate，TG)的PBS溶液腹腔注射刺激4天后，頸椎脫臼處死，用PBS溶液洗出其腹腔游離細(xì)胞。培養(yǎng)于含10％FBS和含100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基的6孔板中，細(xì)胞密度為2.5×10⁶/孔(2mL培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24小時(shí)。然后換液，加入含500ng/mL LPS的完全培養(yǎng)基(2mL)預(yù)處理4小時(shí)，激活腹腔巨噬細(xì)胞，再經(jīng)含不同濃度的小檗堿(0.75、1.5、3.0μmol/L)的培養(yǎng)基(1.2mL)處理1小時(shí)，最后補(bǔ)加ATP(使其終濃度為2mmol/L)處理30分鐘。

(2)上清中caspase-1和IL-1β的檢測(cè)方法

細(xì)胞經(jīng)上述處理后，吸取培養(yǎng)上清1.2mL，經(jīng)200×g離心5分鐘，上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，先加入21μL的10％(w/v)脫氧膽酸鈉溶液(終濃度為0.15％(w/v))，搖勻后，再加入94μL的100％三氯乙酸(終濃度為7.2％(v/v))混合均勻后，在4℃沉淀蛋白過(guò)夜。然后經(jīng)14000×g離心30分鐘，棄上清。沉淀加入700μL冷丙酮(-20℃)，洗去沉淀中的三氯乙酸；14000×g離心5分鐘。棄上清，用上述冷丙酮(-20℃)重復(fù)洗兩次。最后一次洗滌離心后，棄上清；使沉淀中殘余的丙酮在常溫下?lián)]發(fā)，最后用蛋白電泳樣品液溶解。煮沸5分鐘，經(jīng)上述處理后的蛋白，用免疫印跡方法檢測(cè)。

(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

炎癥小體激活程度以caspase-1(p10片段)活化水平和IL-1β釋放反映。結(jié)果如圖2所示，細(xì)胞培養(yǎng)上清中活化caspase-1(p10)和IL-1β的表達(dá)水平隨BBR的劑量增加而升高，小檗堿(BBR)劑量依賴性地促進(jìn)LPS+ATP誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥小體活化。

實(shí)施例3

(1)細(xì)胞培養(yǎng)和處理

小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)方法參照Monack實(shí)驗(yàn)室的操作程序(Stanford)，將1×10⁸個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)于底面積為500cm²的三層培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為DMEM完全培養(yǎng)基(200mL)。

小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞(BMDM)的培養(yǎng)方法：C57BL/6小鼠，6-8周，雌性，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。經(jīng)頸椎脫臼處死后，取其大腿骨，用注射器將骨髓細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基沖出。得到的細(xì)胞用BM-Mac培養(yǎng)基(80％(v/v)DMEM完全培養(yǎng)基+20％(v/v)L929細(xì)胞培養(yǎng)上清)，培養(yǎng)于細(xì)菌培養(yǎng)皿(密度為5×10⁶個(gè)細(xì)胞/皿，培養(yǎng)基體積為8-10mL)。培養(yǎng)3天，添加10mL新的培養(yǎng)基；培養(yǎng)第5天，替換為上述新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)第7天，收集細(xì)胞，培養(yǎng)于含10％(v/v)FBS和含100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM(完全培養(yǎng)基)的6孔板中，細(xì)胞密度為2.3×10⁶個(gè)/孔(2mL培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24小時(shí)。然后換液，加入含500ng/mL LPS的完全培養(yǎng)基(2mL)預(yù)處理4小時(shí)，激活BMDM細(xì)胞，再經(jīng)含不同濃度的小檗堿(0.75、1.5、3.0μmol/L)的培養(yǎng)基(1.2mL)處理1小時(shí)，最后補(bǔ)加ATP，使ATP在培養(yǎng)基的終濃度為2mmol/L，處理30分鐘。

(2)上清中caspase-1和IL-1β的檢測(cè)方法

細(xì)胞經(jīng)上述處理后，吸取培養(yǎng)上清1.2mL，經(jīng)200×g離心5分鐘，上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，先加入21μL的10％脫氧膽酸鈉溶液(終濃度為0.15％(w/v))，搖勻后，再加入94μL的100％三氯乙酸(終濃度為7.2％(v/v))混合均勻后，在4℃沉淀蛋白過(guò)夜。然后經(jīng)14000×g離心30分鐘，棄上清。沉淀加入700μL冷丙酮，洗去沉淀中的三氯乙酸；14000×g離心5min，棄上清，用上述冷丙酮重復(fù)洗兩次。最后一次洗滌離心后，棄上清；使沉淀中殘余的丙酮在常溫下?lián)]發(fā)，最后用蛋白電泳樣品液溶解。煮沸5分鐘，經(jīng)上述處理后的蛋白，用免疫印跡方法檢測(cè)。

(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

炎癥小體激活程度以caspase-1(p10片段)活化水平和IL-1β釋放反映。結(jié)果如圖3所示，細(xì)胞培養(yǎng)上清中活化caspase-1(p10)和IL-1β的表達(dá)水平隨BBR的劑量增加而升高，小檗堿(BBR)劑量依賴性地促進(jìn)LPS+ATP誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥小體活化。

實(shí)施例4

(1)細(xì)菌培養(yǎng)

大腸桿菌(DH5α)在Luria Broth(LB)培養(yǎng)基中搖菌過(guò)夜(37℃)，次日按10％菌液在新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)搖菌擴(kuò)增3小時(shí)(37℃)。擴(kuò)增后的菌液在1824×g離心力下離心10分鐘，PBS洗滌后，重懸于PBS溶液備用。細(xì)菌密度用微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000；Thermo Scientific)測(cè)定；對(duì)應(yīng)的菌落形成單位(colony forming units,CFU)由傳統(tǒng)LB瓊脂糖平板涂布培養(yǎng)確定。

(2)細(xì)菌殺傷

小鼠單核巨噬細(xì)胞J774A.1細(xì)胞培養(yǎng)于含10％FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中。待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，種于24孔板中，細(xì)胞密度為3.5×10⁴/孔(500μL培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24小時(shí)。換液并用DMEM進(jìn)行洗滌兩次后，在無(wú)抗生素的培養(yǎng)液中加入2.8×10⁵CFU的活大腸桿菌，使細(xì)胞吞噬細(xì)菌2小時(shí)；將不同濃度的小檗堿(BBR，1.5、3、6、12μmol/L))配制于含抗生素的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后，換液并用前述不含抗生素的DMEM進(jìn)行洗滌兩次；最后，以200μL濃度為0.5％(v/v)Triton X-100，常溫下裂解細(xì)胞5分鐘，由此得到的細(xì)胞裂解液以PBS稀釋10倍后，取100μL進(jìn)行LB瓊脂板涂布，置于37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24小時(shí)后對(duì)長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。各組間菌落數(shù)的差異分析采用方差分析和Tukey檢驗(yàn)，P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

(3)結(jié)果

結(jié)果如圖4所示，小檗堿(BBR)可促進(jìn)J774A.1細(xì)胞對(duì)吞噬細(xì)菌的殺傷作用。*表示P<0.05。

實(shí)施例5

(1)細(xì)菌培養(yǎng)

大腸桿菌DH5α在Luria Broth(LB)培養(yǎng)基中搖菌過(guò)夜(37℃)，次日按10％菌液在新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)搖菌擴(kuò)增3小時(shí)(37℃)。擴(kuò)增后的菌液在1824×g離心力下離心10分鐘，PBS洗滌后，重懸于PBS溶液備用。細(xì)菌密度用微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000；Thermo Scientific)測(cè)定；對(duì)應(yīng)的菌落形成單位(CFU)由傳統(tǒng)LB瓊脂糖平板涂布培養(yǎng)確定。

(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

C57BL/6小鼠(購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，在本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性養(yǎng)殖一周后，按100mg/kg體重的劑量將含小檗堿的PBS溶液預(yù)灌胃3天(每天一次)后，腹腔接種大腸桿菌(2×10⁹CFU/只)，在接下來(lái)的96小時(shí)內(nèi)，每6小時(shí)觀察記錄小鼠存活情況，并繪制小鼠Kaplan-Meier生存曲線分析存活率。小鼠存活率的差異分析采用Long-rank檢驗(yàn)，P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果如圖5所示，大腸桿菌感染可導(dǎo)致小鼠因感染而死亡；而小檗堿(BBR)可有效降低腹腔細(xì)菌感染小鼠的死亡率。***表示P<0.001。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。