本發(fā)明屬于婦產(chǎn)科學(xué)領(lǐng)域，其涉及用于預(yù)防宮腔粘連及修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的細(xì)胞制劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

宮腔粘連(intrauterine adhesions，IUA)又稱Asherman綜合征，是指由創(chuàng)傷、感染等因素造成的子宮內(nèi)膜基底層細(xì)胞的損傷導(dǎo)致子宮腔內(nèi)粘連組織形成，引起宮腔變形甚至宮腔完全消失，使患者出現(xiàn)月經(jīng)異常(閉經(jīng)或月經(jīng)量減少等)、不孕、流產(chǎn)、早產(chǎn)及周期性腹痛等異常情況。近年來(lái)由于頻繁的宮腔操作及宮腔鏡手術(shù)的普及，子宮粘連的發(fā)病率和檢出率逐漸上升，而且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)，已成為女性繼發(fā)不孕的第二大病因。盡管臨床醫(yī)生不斷尋求新的治療方案，子宮粘連的治愈率和妊娠率仍無(wú)明顯改善，且復(fù)發(fā)率較高(輕度IUA患者治療后復(fù)發(fā)率為33.3％，重度IUA患者治療后復(fù)發(fā)率更是高達(dá)66.7％)，由此引起的不孕以及反復(fù)流產(chǎn)、早產(chǎn)、前置胎盤(pán)、胎盤(pán)粘連或植入等產(chǎn)科并發(fā)癥嚴(yán)重威脅著女性的生殖健康。目前臨床上針對(duì)IUA的治療主要是采用宮腔鏡下宮腔粘連分離術(shù)、術(shù)后放置宮內(nèi)節(jié)育器或防粘連材料(主要為透明質(zhì)酸鈉凝膠)以及術(shù)后應(yīng)用雌孕激素治療，但是以上方法存在著治療周期長(zhǎng)、治愈率低下、粘連易復(fù)發(fā)、妊娠率低、大劑量雌激素應(yīng)用會(huì)增加患者乳腺和子宮內(nèi)膜腫瘤風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題。此外，對(duì)于嚴(yán)重的子宮內(nèi)膜損傷，該治療方法并不能解決內(nèi)膜疤痕問(wèn)題，且無(wú)法實(shí)現(xiàn)子宮內(nèi)膜功能性修復(fù)及生育功能的恢復(fù)。研究報(bào)道采用人羊膜植入治療IUA可促進(jìn)子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)，抑制纖維化瘢痕的形成，可同樣對(duì)于重度子宮內(nèi)膜損傷患者來(lái)說(shuō)，該方法也無(wú)法實(shí)現(xiàn)子宮內(nèi)膜功能性修復(fù)。子宮腔灌注粒細(xì)胞集落刺激因子可使部分內(nèi)膜薄患者內(nèi)膜厚度增加，但該方法存在作用時(shí)間短，局部療效差，且無(wú)法促進(jìn)疤痕內(nèi)膜生長(zhǎng)等缺陷。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療宮腔粘連，可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜組織再生，實(shí)現(xiàn)子宮內(nèi)膜功能性修復(fù)，但是單一應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存在難于局部定位以及修復(fù)不穩(wěn)定、不徹底等問(wèn)題。膠原支架復(fù)合骨髓或臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可以治療嚴(yán)重子宮內(nèi)膜損傷，促進(jìn)疤痕子宮內(nèi)膜修復(fù)，恢復(fù)患者生育功能，但是此法也存在的一定的局限性，比如細(xì)胞制劑制備方法復(fù)雜，細(xì)胞獲取不方便，細(xì)胞獲取或細(xì)胞制劑應(yīng)用時(shí)對(duì)患者造成的痛苦大及創(chuàng)傷大等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中細(xì)胞獲取不便、對(duì)患者造成的痛苦大、創(chuàng)傷大及采用單一干細(xì)胞存在難于局部定位、修復(fù)不穩(wěn)定、不徹底以及傳統(tǒng)宮腔粘連及子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)嚴(yán)重子宮內(nèi)膜再生修復(fù)、子宮內(nèi)膜功能性恢復(fù)或作用時(shí)間短，局部療效差等問(wèn)題，提供一種能夠高效預(yù)防宮腔粘連及修復(fù)嚴(yán)重子宮內(nèi)膜損傷的混合干細(xì)胞制劑及其制備方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種用于預(yù)防宮腔粘連及修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的細(xì)胞制劑，所述的細(xì)胞制劑由間充質(zhì)干細(xì)胞、人重組基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(rhSDF-1α)和用于承載間充質(zhì)干細(xì)胞及rhSDF-1α的透明質(zhì)酸鈉凝膠組成，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞或胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞。

所述的間充質(zhì)干細(xì)胞的來(lái)源為人臍帶或胎盤(pán)；

所述的細(xì)胞制劑中，間充質(zhì)干細(xì)胞的濃度為5×10⁶～2×10⁸個(gè)/mL；

所述的間充質(zhì)干細(xì)胞為原代-第10代的間充質(zhì)干細(xì)胞；優(yōu)選地，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞為原代-第3代的間充質(zhì)干細(xì)胞。

所述的細(xì)胞制劑中，rhSDF-1α的質(zhì)量濃度為10-150ng/mL；

所述的細(xì)胞制劑中，透明質(zhì)酸鈉凝膠的質(zhì)量濃度為10-100mg/mL；

所述的透明質(zhì)酸鈉凝膠的分子量為400000-1000000；

所述的透明質(zhì)酸鈉凝膠為醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠。

所述的細(xì)胞制劑為混懸液。

所述的細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)制備臍帶或胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞；

2)將所述臍帶或胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞與rhSDF-1α和透明質(zhì)酸鈉凝膠按比例混合，制得。

所述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：

1)取志愿、健康合格孕婦的足月剖宮產(chǎn)的新生兒臍帶，充分洗滌去除臍動(dòng)靜脈中的血管；

2)將臍帶組織剪成塊狀，加入膠原酶消化液，37℃恒溫?fù)u床中振蕩消化，完全培養(yǎng)基(DMEM)和10％胎牛血清(FBS)終止消化；

3)50目篩網(wǎng)過(guò)濾人臍帶組織消化后的產(chǎn)物；

4)將收集的過(guò)濾液離心、分離獲得單個(gè)核細(xì)胞；

5)將離心后獲得單個(gè)核細(xì)胞重懸于完全培養(yǎng)基(DMEM+10％FBS)，接種于培養(yǎng)皿中，在37℃，體積分?jǐn)?shù)為5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

6)待細(xì)胞生長(zhǎng)至80-90％融合度時(shí)，用胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)，即得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；必要時(shí)進(jìn)行凍存待用。

所述的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：

1)取志愿、健康合格孕婦的足月剖宮產(chǎn)胎兒的胎盤(pán)，PBS反復(fù)沖洗去除胎盤(pán)血；

2)將胎盤(pán)組織剪成塊狀，加入膠原酶消化液，37℃恒溫?fù)u床中振蕩消化，完全培養(yǎng)基(DMEM+10％FBS)終止消化；

3)50目篩網(wǎng)過(guò)濾人胎盤(pán)組織消化后的產(chǎn)物；

4)將收集的過(guò)濾液離心、分離獲得單個(gè)核細(xì)胞；

5)將離心后獲得單個(gè)核細(xì)胞重懸于完全培養(yǎng)基(DMEM+10％FBS)，接種于培養(yǎng)皿中，在37℃，體積分?jǐn)?shù)為5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

6)待細(xì)胞生長(zhǎng)至80-90％融合度時(shí)，用胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)，即得胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞；必要時(shí)進(jìn)行凍存待用。

本發(fā)明提供的用于預(yù)防宮腔粘連及子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)的細(xì)胞制劑中，所述細(xì)胞制劑中，透明質(zhì)酸鈉凝膠為醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠，是經(jīng)CFDA批準(zhǔn)可應(yīng)用于臨床婦科及骨科等手術(shù)中預(yù)防肌腱或?qū)m腔粘連的明質(zhì)酸鈉凝膠。

本發(fā)明提供的細(xì)胞制劑可局部注射，制劑經(jīng)注射至病灶部位后，透明質(zhì)酸鈉凝膠可為間充質(zhì)干細(xì)胞提供定植點(diǎn)，且具有緩釋作用，聯(lián)合rhSDF-1α的趨化作用，間充質(zhì)干細(xì)胞制劑可在宮腔內(nèi)或病灶區(qū)緩釋、定植和生長(zhǎng)，利用三者的協(xié)同作用可以發(fā)揮更好的療效。

本發(fā)明提供的細(xì)胞制劑可局部注射，局部注射部位可為子宮宮底、宮腔內(nèi)、盤(pán)腔內(nèi)及子宮肌瘤剝除術(shù)、剖腹產(chǎn)術(shù)以及輸卵管復(fù)通等術(shù)后的吻合口部位。

本發(fā)明提供的細(xì)胞制劑可用于修復(fù)由于各種原因造成的子宮內(nèi)膜過(guò)度損傷，可用于子宮內(nèi)膜功能性修復(fù)和解決內(nèi)膜疤痕問(wèn)題以及可用于人流手術(shù)、宮腹腔聯(lián)合手術(shù)、剖宮產(chǎn)術(shù)及刮宮手術(shù)等術(shù)后宮腔粘連的預(yù)防。

本發(fā)明具有如下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

1)透明質(zhì)酸鈉凝膠是由N-乙酰葡萄糖醛酸反復(fù)交替而形成的一種高分子多糖體生物材料，具有高度的黏彈性、可塑性、可降解性以及良好的生物相容性，在預(yù)防粘連及修復(fù)軟組織方面具有明顯的作用，其作為間充質(zhì)干細(xì)胞及rhSDF-1α延時(shí)緩釋載體，不僅為干細(xì)胞提供定植點(diǎn)，同時(shí)可為干細(xì)胞的生長(zhǎng)提供合適的三維空間結(jié)構(gòu)及適宜的維環(huán)境，在一定程度上可促進(jìn)干細(xì)胞的生長(zhǎng)和分泌。此外，透明質(zhì)酸鈉凝膠還具有抗炎、防粘連作用，而且能抑制纖維細(xì)胞的滲出，術(shù)后宮腔內(nèi)注入透明質(zhì)酸鈉凝膠，可以起到潤(rùn)滑作用及生物屏障功能，促進(jìn)組織生理性修復(fù)，抑制疤痕形成，從而防止術(shù)后再次粘連。

2)rhSDF-1α，其具有趨化作用，可通過(guò)其受體CXCR4發(fā)揮細(xì)胞募集作用。研究表明rhSDF-1α可以動(dòng)員組織自身干細(xì)胞以及外源干細(xì)胞歸巢，提高損傷部位干細(xì)胞濃度，延長(zhǎng)干細(xì)胞的作用時(shí)間，從而達(dá)到促進(jìn)受損子宮內(nèi)膜再生修復(fù)，提高局部療效。此外，rhSDF-1α可誘導(dǎo)損傷部位血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)促進(jìn)新生血管生成，而新生的血管可使局部血液灌流增加，改善移植細(xì)胞的生存環(huán)境，提高干細(xì)胞的存活，干細(xì)胞的存活又能提高其旁分泌作用。

3)臍帶或胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞作為預(yù)防宮腔粘連及修復(fù)嚴(yán)重子宮內(nèi)膜損傷的活性成分，其不僅獲取方便，且具有組織再生修復(fù)能力及強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能，能分泌多種生長(zhǎng)因子改善局部微環(huán)境，促進(jìn)疤痕子宮內(nèi)膜再生修復(fù)，增加內(nèi)膜厚度以及局部血管密度等。

4)因此，利用臍帶或胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞、rhSDF-1α及透明質(zhì)酸鈉凝膠三者的協(xié)同作用，可以更好的使干細(xì)胞定植在子宮內(nèi)膜損傷部位，提高干細(xì)胞的在損傷部位的濃度，延長(zhǎng)干細(xì)胞的作用時(shí)間，提高局部療效。三者的協(xié)同作用可有效促進(jìn)疤痕子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)，防止術(shù)后宮腔再次粘連。

附圖說(shuō)明

圖1(a1)為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)圖；

圖1(a2)為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至第三代形態(tài)圖；

圖2(b1-b6)為第三代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果；

圖3(c1)為胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)圖；

圖3(c2)為胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至第三代形態(tài)圖；

圖4(d1-d6)為第三代胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果；

圖5為臍帶和胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化結(jié)果；其中a1為(臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞誘導(dǎo)前茜素紅染色圖)，a2為(臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后茜素紅染色圖)，b1為(臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)前油紅O染色圖)，b2為(臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后油紅O染色圖)，c1為(臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)前番紅O染色圖)，c2為(臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后番紅O染色圖))，d1為(胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞誘導(dǎo)前茜素紅染色圖)，d2為(胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后茜素紅染色圖)，e1為(胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)前油紅O染色圖)，e2為(胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后油紅O染色圖)，f1為(胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)前番紅O染色圖)，f2為(胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后番紅O染色圖)；

圖6A為臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞制劑用于小鼠子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)后子宮內(nèi)膜纖維化面積比變化分析結(jié)果；

圖6B為胎盤(pán)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞制劑用于小鼠子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)后子宮內(nèi)膜纖維化面積比變化分析結(jié)果；

圖7A為臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞制劑用于小鼠子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)后子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量變化分析結(jié)果。

圖7B為胎盤(pán)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞制劑用于小鼠子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)后子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量變化分析結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1制備用于預(yù)防宮腔粘連及子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)的細(xì)胞制劑

本實(shí)施例的用于預(yù)防宮腔粘連及子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)的細(xì)胞制劑是由第三代臍帶或胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞與rhSDF-1α及醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠所組成的混懸液，且該混懸液中各成分的濃度為臍帶或胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞的終濃度為5×10⁶個(gè)/mL，rhSDF-1α的質(zhì)量濃度為10ng/mL，透明質(zhì)酸鈉凝膠的質(zhì)量濃度為10mg/mL，透明質(zhì)酸鈉凝膠的分子量為400000。

其中，上述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是由以下方法制備得到：

取志愿、健康合格孕婦的足月剖宮產(chǎn)的新生兒臍帶，PBS反復(fù)洗滌后去除臍動(dòng)靜脈中的血管，將臍帶組織剪成塊狀，加入膠原酶消化液，37℃恒溫?fù)u床中振蕩消化60min后，加入完全培養(yǎng)基(DMEM+10％胎牛血清)終止消化，采用50目篩網(wǎng)過(guò)濾人臍帶組織消化后的產(chǎn)物，收集過(guò)濾液離心、分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，將獲得的單個(gè)核細(xì)胞重懸于完全培養(yǎng)基(DMEM+10％胎牛血清)，接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80-90％融合度時(shí)，用胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)，即得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，凍存待用。

其中，上述胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞是由以下方法制備得到：

取志愿、健康合格孕婦的足月剖宮產(chǎn)胎兒的胎盤(pán)，PBS反復(fù)沖洗去除胎盤(pán)血，剔除底蛻膜及松散絨毛組織后，將胎盤(pán)組織剪成塊狀，加入膠原酶消化液，37℃恒溫?fù)u床中振蕩消化60min后，加入完全培養(yǎng)基(DMEM+10％胎牛血清)終止消化，采用50目篩網(wǎng)過(guò)濾人胎盤(pán)組織消化后的產(chǎn)物，收集過(guò)濾液離心、分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，將獲得的單個(gè)核細(xì)胞重懸于完全培養(yǎng)基(DMEM+10％胎牛血清)，接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80-90％融合度時(shí)，用胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)，即得胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞，凍存待用。

實(shí)施例2制備用于預(yù)防宮腔粘連及子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)的細(xì)胞制劑

本實(shí)施例的用于預(yù)防宮腔粘連及子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)的細(xì)胞制劑是由第三代臍帶或胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞與rhSDF-1α及醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠所組成的混懸液，且該混懸液中各成分的濃度為臍帶或胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞的終濃度1×10⁷個(gè)/mL，rhSDF-1α的質(zhì)量濃度為80ng/mL，透明質(zhì)酸鈉凝膠的質(zhì)量濃度為55mg/mL，透明質(zhì)酸鈉凝膠的分子量為700000。

其中，上述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法與實(shí)施例1相同。

其中，上述胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法與實(shí)施例1相同。

實(shí)施例3制備用于預(yù)防宮腔粘連及子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)的細(xì)胞制劑

本實(shí)施例的用于預(yù)防宮腔粘連及子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)的細(xì)胞制劑是由第三代臍帶或胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞與rhSDF-1α及醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠所組成的混懸液，且該混懸液中各成分的濃度為臍帶或胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞的終濃度為2×10⁸個(gè)/mL，rhSDF-1α的質(zhì)量濃度為150ng/mL，透明質(zhì)酸鈉凝膠的質(zhì)量濃度為100mg/mL，透明質(zhì)酸鈉凝膠的分子量為1000000。

其中，上述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法與實(shí)施例1相同。

其中，上述胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法與實(shí)施例1相同。

實(shí)施例4臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定及體外誘導(dǎo)分化

1)采用倒置顯微鏡分別觀察上述實(shí)施例提取培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)和培養(yǎng)至第三代的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)附圖，其中，圖1(a1)為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)圖，圖1(a2)為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至第三代形態(tài)圖，圖3(c1)為胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)圖，圖3(c2)為胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至第三代形態(tài)圖。

2)將培養(yǎng)至第三代的臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤(pán)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞分別進(jìn)行表面標(biāo)志檢測(cè)，臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果如圖2(b1-b6)所示，胎盤(pán)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果如圖4(d1-d6)所示。

對(duì)于臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞，其表面抗原CD29(99.88％，見(jiàn)圖2(b1))，CD34(0.99％，見(jiàn)圖2(b2))，CD71(1.17％，見(jiàn)圖2(b3))，CD90(47.10％，見(jiàn)圖2(b4))，陰性對(duì)照PE(0.56％，見(jiàn)圖2(b5))，F(xiàn)ITC(1.14％，見(jiàn)圖2(b6))。

對(duì)于胎盤(pán)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞，其表面抗原CD29(99.90％，見(jiàn)圖4(d1))，CD34(1.29％，見(jiàn)圖4(d2))，CD71(1.21％，見(jiàn)圖4(d3))，CD90(80.45％，見(jiàn)圖4(d4))，陰性對(duì)照PE(0.97％，見(jiàn)圖4(d5))，F(xiàn)ITC(0.71％，見(jiàn)圖4(d6))。

3)臍帶、胎盤(pán)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的體外定向誘導(dǎo)分化結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明臍帶或胎盤(pán)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞可以向成骨細(xì)胞(a2，d2)，成脂肪細(xì)胞(b2，e2)，成軟骨細(xì)胞(c2，f2)分化。

實(shí)施例5

為了進(jìn)一步證明本發(fā)明提供的用于預(yù)防宮腔粘連及子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)的細(xì)胞制劑的顯著效果，將通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行具體說(shuō)明。

(1)動(dòng)物子宮內(nèi)膜損傷模型的構(gòu)建

取120只8周齡大的雌性小鼠分為10組，采用雙重(感染+機(jī)械)損傷法構(gòu)建子宮內(nèi)膜損傷模型，即小鼠麻醉后，取下腹部正中長(zhǎng)約2cm縱切口進(jìn)腹，于子宮中下1/3處作0.5cm縱行切口，采用子宮內(nèi)膜刮勺搔刮中上段子宮腔，當(dāng)刮勺進(jìn)出子宮凹凸感消失，四壁感覺(jué)粗糙時(shí)，停止刮宮，刮宮后宮腔留置脂多糖棉線，縫合腹部切口，48h后取出脂多糖棉線。建模完成后，分別將2mL本發(fā)明實(shí)施例1-實(shí)施例3制備的細(xì)胞制劑注射至子宮宮腔內(nèi)。設(shè)置空白對(duì)照組(假手術(shù)組)，僅注射生理鹽水(模型)組；僅注射透明質(zhì)酸鈉凝膠組以及僅注射rhSDF-1α組。在小鼠動(dòng)情3個(gè)周期后將小鼠與雄性小鼠進(jìn)行交配。1個(gè)月后取材行HE染色和Masson染色進(jìn)行子宮內(nèi)膜組織功能學(xué)評(píng)估，3個(gè)月后行小鼠妊娠結(jié)果評(píng)估。

結(jié)果：術(shù)后1個(gè)月組織功能學(xué)評(píng)估顯示，與各對(duì)照組相比，臍帶或胎盤(pán)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合rhSDF-1α和透明質(zhì)酸鈉凝膠治療組的纖維化程度明顯減少(圖6(A)和(B))；與各對(duì)照組相比，實(shí)施例1-3的實(shí)施例中的細(xì)胞制劑，臍帶或胎盤(pán)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合rhSDF-1α和透明質(zhì)酸鈉凝膠治療組的腺體數(shù)量均高于各對(duì)照組(圖7(A)和(B))。妊娠結(jié)果評(píng)估顯示，臍帶或胎盤(pán)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合rhSDF-1α和透明質(zhì)酸鈉凝膠組的妊娠率高于各對(duì)照組，結(jié)果如表1所示。

表1各組小鼠妊娠結(jié)果分析