本發(fā)明涉及一種可永久栓塞的藥物載體的制備方法，涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種可載藥聚乙烯醇洗脫微球的制備方法。

背景技術(shù)：

原發(fā)性肝癌是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均較高，全球肝癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。我國是全球肝癌發(fā)病率最高和病死數(shù)最多的國家，肝癌的發(fā)病率成為死亡率僅次于胃癌、肺癌的第三大惡性腫瘤。該病嚴(yán)重威脅人們的身體健康,常見的治療腫瘤方案是采用手術(shù)切除法，但是對于中晚期的腫瘤患者來說,介入療法(ranscatheter arterial chemoembolization,TACE)是比較理想的治療方案。介入治療指的是經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞術(shù)，即經(jīng)導(dǎo)管將含藥微球輸入靶組織,阻斷腫瘤的供血動脈并緩慢釋放藥物,從而提高化療藥物的局部濃度,降低了全身的毒副作用。一系列臨床分析顯示TACE能有效地控制腫瘤生長，延長患者生存期。對于不能手術(shù)切除的中晚期肝癌患者，TACE是首選的非手術(shù)治療方法。

聚乙烯醇(PVA)是一種水溶性高分子聚合物，攜帶官能基團(tuán)單一(只有羥基)又可以大量人工合成，被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)生活中多個領(lǐng)域，是一種非常安全的大分子有機(jī)物。它對人體無毒、無副作用，且具有良好的生物相容性，在醫(yī)療領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，例如PVA水凝膠應(yīng)用在傷口敷料、人工關(guān)節(jié)和眼科；PVA薄膜應(yīng)用在人工腎膜、藥用膜等方面；針對癌癥的治療，由PVA制備的血管栓塞劑已應(yīng)用在醫(yī)學(xué)臨床上。目前，以PVA作為原料制備栓塞微球已有一些報(bào)道，但是PVA用來制備載藥微球尚有缺陷:一是傳統(tǒng)的PVA微球只能起著機(jī)械栓塞的作用，無法負(fù)載藥物；二是雖然近些年有人對PVA微球進(jìn)行表面改性，試圖接枝上載藥基團(tuán)，但接枝率低，使得微球的載藥率低，藥物易突釋。另外純PVA分子中氫鍵較多，鏈段之間相互作用強(qiáng)，形成的微球由于高結(jié)晶性而溶脹差，彈性不足，作為血管栓塞劑的材料柔軟性不夠。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述缺陷，本文首先將2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(AMPS)加入到聚乙烯醇溶液中，在引發(fā)劑作用下，對聚乙烯醇進(jìn)行改性，使其接枝上大量的磺酸基團(tuán)，同時，以N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)做交聯(lián)劑，在反相微懸浮條件下，制備出含有磺酸基團(tuán)的聚乙烯微球。由于2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸分子中的磺酸基是強(qiáng)電離基團(tuán)，親水性極強(qiáng)，將該基團(tuán)引入到聚乙烯醇分子上，可以大大提高聚乙烯醇糖微球?qū)λ幬锇⒚顾氐呢?fù)載率；另一方面聚乙烯醇進(jìn)行改性后，鏈段結(jié)構(gòu)規(guī)整性破壞，減弱了結(jié)晶性，可以改善聚乙烯醇微球的溶脹性和柔順性，更有利于微球在血管中的靶向栓塞。且含有磺酸基團(tuán)的聚乙烯醇微球具有無細(xì)胞毒性、生物相容性好、原料來源廣泛等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明提供制備一種可載藥聚乙烯醇洗脫微球作為藥物載體的技術(shù)方案，依次包括以下步驟：

1)配制聚乙烯醇混合液，將聚乙烯醇、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸按一定比例溶解在蒸餾水中，完全溶解后，加入N,N-亞甲基雙丙烯酰胺溶液，常溫下磁力攪拌，混合均勻；然后再加入計(jì)量的過硫酸鉀，攪拌數(shù)分鐘。

2)改性聚乙烯醇微球的制備，將上述聚乙烯醇混合液滴入到油相里，完成乳化后，加入計(jì)量的的亞硫酸氫鈉，采用反相微懸浮交聯(lián)方法，在40℃條件下攪拌反應(yīng)8小時后，加入少量鹽酸和戊二醛，反應(yīng)2小時，固化成球，最后用大量乙醇清洗數(shù)次、蒸餾水浸泡洗滌數(shù)次，真空干燥，得到粒徑在100～700um含有磺酸基團(tuán)的改性聚乙烯醇微球，即可載藥聚乙烯醇洗脫微球。

具體的，所述步驟1)中，聚乙烯醇規(guī)格為1788型，聚乙烯醇混合液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％～15％，2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸的用量占聚乙烯醇質(zhì)量的1～2倍，N,N-亞甲基雙丙烯酰胺占聚乙烯醇質(zhì)量的1％～10％，其方法是先將N,N-亞甲基雙丙烯酰胺溶解在其質(zhì)量6倍的N,N-二甲基乙酰胺中形成溶液，再將此溶液加入到聚乙烯醇溶液中。

具體的，所述步驟1)中，引發(fā)劑為過硫酸鉀與亞硫酸氫鈉的氧化-還原引發(fā)體系，過硫酸鉀的用量占聚乙烯醇質(zhì)量的1％，亞硫酸氫鈉的用量是過硫酸鉀質(zhì)量的五分之一。

具體的，所述步驟2)中,油相為正庚烷、正辛烷、石蠟油或大豆油，油相與水相的體積比為4:1～8:1。

具體的，所述步驟2)中，乳化劑為司班80與吐溫60按重量比4:1的復(fù)配物，其總用量占油相質(zhì)量的1％～5％。

具體的，所述步驟2)中，將上述聚乙烯醇混合液逐漸滴入到油相里，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，完成乳化后，加入計(jì)量的亞硫酸氫鈉水溶液，接著升溫至40℃，并控制攪拌速度為300～500rad/min，反應(yīng)8h后，加入戊二醛，在濃度36％的鹽酸催化下，固化成球，鹽酸用量占聚乙烯醇質(zhì)量的10％，戊二醛用量占聚乙烯醇質(zhì)量的5％～20％。

本發(fā)明還提供一種可載藥聚乙烯醇洗脫微球在制備藥物載體中的應(yīng)用方法，其特征是首先根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備可載藥聚乙烯醇洗脫微球，選擇其中任何一微球品種0.5g，經(jīng)過真空干燥，浸泡在飽和濃度的鹽酸阿霉素水溶液中,在8℃溫度下攪拌3小時，過濾出載藥微球，用去離子水沖洗微球表面殘留藥物，真空干燥微球后密封保存，可在pH 7.4的磷酸緩沖液介質(zhì)中釋放藥物。

可載藥的洗脫微球在靶向?qū)蚰[瘤組織的動脈中，不僅阻斷對腫瘤組織的營養(yǎng)供給，還可以釋放抗腫瘤藥物，隨著腫瘤組織中抗癌藥物濃度的升高，對病變部位起到抑制的作用。

借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.使用一種新的制備方法，先在聚乙烯醇分子接枝上磺酸基團(tuán)，再形成微球，使得微球中含有大量的磺酸基團(tuán)，從而提高微球的載藥率；

2.改善了微球的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，提高了微球的溶脹性和柔軟性，更有利于微球在血管中的靶向栓塞；

3.由于該微球含有磺酸基團(tuán)，通過電荷吸附藥物分子，大大消除了微球表面物理吸附而引起的突釋，起到了緩釋藥物的目的；

4.制備出的洗脫微球無毒、細(xì)胞相容性較好，符合人體使用的安全性標(biāo)準(zhǔn)；在人體內(nèi)可永久栓塞；

5.通過反相微懸浮聚合方法合成的洗脫微球，方法簡單、條件溫和，無副產(chǎn)物產(chǎn)生，反應(yīng)完全，產(chǎn)物純凈。

上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下是本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說明如后。

附圖說明

圖1為可載藥聚乙烯醇洗脫微球的合成路線。

圖2為改性前后聚乙烯醇的紅外譜圖，其中a：未改性聚乙烯醇；b：改性后聚乙烯醇微球。

圖3為本發(fā)明中可載藥聚乙烯醇洗脫微球的超景深顯微鏡照片。

圖4為本發(fā)明中可載藥聚乙烯醇洗脫微球在pH 7.4的磷酸緩沖液中的累計(jì)釋放率曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

1)可載藥聚乙烯醇洗脫微球的制備：

實(shí)施例1.

將1.1g聚乙烯醇和2.2g,2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸加入到8.9g蒸餾水中，常溫下，磁力攪拌至完全溶解，然后加入0.314g,14％MBA溶液，混合均勻后，再加入計(jì)量0.275g,4％過硫酸鉀溶液，攪拌數(shù)分鐘。量取50ml正庚烷，放入到250ml三口燒瓶中，加入0.68g(占油相質(zhì)量的2％)乳化劑，其中司班80為0.544g，吐溫60為0.134g(司班80與吐溫60質(zhì)量比為4:1)，常溫下機(jī)械攪拌，轉(zhuǎn)速為350rad/min，通氮?dú)獗Ｗo(hù)。完成乳化后，用微量注射器逐滴加入0.22g,1％亞硫酸氫鈉溶液，然后升溫至40℃，反應(yīng)8h后，加入0.3ml鹽酸和0.5g,25％戊二醛溶液，2h后，用大量乙醇破乳、清洗微球，反復(fù)洗滌數(shù)次，最后將微球放入35℃真空干燥箱中干燥24小時，得到粒徑在100～700um的改性聚乙烯醇微球。

實(shí)施例2.

將1.1g聚乙烯醇和2.2g,2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸加入到8.06g蒸餾水中，常溫下，磁力攪拌至完全溶解。其他合成過程和實(shí)施例1相同。

實(shí)施例3.

將1.1g聚乙烯醇和2.2g,2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸加入到9.90g蒸餾水中，常溫下，磁力攪拌至完全溶解。其他合成過程和實(shí)施例1相同。

實(shí)施例4

將1.1g聚乙烯醇和2.2g,2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸加入到11.12g蒸餾水中，常溫下，磁力攪拌至完全溶解。其他合成過程和實(shí)施例1相同。

表1不同濃度的聚乙烯醇濃度對制備微球的影響

實(shí)施例5

將1.1g聚乙烯醇和2.2g,2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸加入到8.9g蒸餾水中，常溫下，磁力攪拌至完全溶解，然后加入0.314g,14％MBA溶液，混合均勻后，再加入計(jì)量0.275g,4％過硫酸鉀溶液，攪拌數(shù)分鐘。量取50ml石蠟油，放入到250ml三口燒瓶中，加入0.80g司班80(占油相質(zhì)量2％)，常溫下機(jī)械攪拌，轉(zhuǎn)速為400rad/min，通氮?dú)獗Ｗo(hù)。完成乳化后，用微量注射器逐滴加入0.22g,1％亞硫酸氫鈉溶液，然后升溫至40℃，反應(yīng)8h后，加入0.3ml鹽酸和0.5g,25％戊二醛溶液，2h后，用大量正己烷、異丙醇清洗微球，反復(fù)洗滌數(shù)次，最后將微球放入35℃真空干燥箱中干燥24小時，得到粒徑在100～700um的改性聚乙烯醇微球。

實(shí)施例6

稱取上述實(shí)施例1改性聚乙烯醇微球25mg,放入10ml,2mg/ml的阿霉素溶液中。室溫下，緩慢震蕩,通過使用紫外分光光度計(jì)，在不同時間段，檢測波長在483nm處阿霉素溶液的濃度，計(jì)算微球的載藥率，按照下列公式計(jì)算微球的載藥率(LR)：

LR(％)＝W_D/W_S×100

式中W_D——微球中藥物的質(zhì)量，mg

W_S——投入微球的質(zhì)量，mg

通過計(jì)算，改性后聚乙烯醇微球載藥率達(dá)到23.5％。

實(shí)施例7

表面功能化可載藥洗脫微球的合成路線圖。如圖1。

實(shí)施例8

分別取少量未改性聚乙烯醇和改性后的聚乙烯醇微球，使用全反射傅里葉紅外光譜儀，在4000～500cm^-1的波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行紅外吸收掃描，得到紅外譜圖。圖2為改性前后聚乙烯醇的紅外譜圖，其中a：未改性聚乙烯醇；b：改性后的聚乙烯醇微球。

實(shí)施例9

選取粒徑在400～500um的改性后聚乙烯醇微球,分別在超景深顯微鏡下觀察微球形貌。圖3為本發(fā)明中可載藥聚乙烯醇洗脫微球的超景深顯微鏡照片。

實(shí)施例10

選取粒徑均在400～500um的改性載藥微球和未改性載藥微球，各稱取25mg,放入PBS(pH 7.4)緩沖溶液中，然后將其置于恒溫水浴振蕩器中，溫度控制在37±0.5℃，定點(diǎn)量取5mL上清液，并及時補(bǔ)充相同體積的新鮮介質(zhì)，通過紫外分光光度計(jì)檢測緩沖液中藥物含量，重復(fù)操作3次取平均值，計(jì)算不同時間段在PBS(pH 7.4)介質(zhì)中的累計(jì)釋放率，并繪制相應(yīng)曲線。

圖4為本發(fā)明中載藥微球在PBS(pH 7.4)介質(zhì)中的累計(jì)釋放率曲線。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。