本發(fā)明屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種仿生人工骨支架及其制備方法。

背景技術(shù)：

全世界每年骨缺損患者數(shù)以千萬計(jì)，使得骨修復(fù)支架材料成為臨床上需求量最大的生物醫(yī)用材料之一。長(zhǎng)期以來，研制和開發(fā)理想的人工骨支架來治療骨缺損一直是科學(xué)工作者們的熱點(diǎn)研究課題。

目前臨床上使用的人工骨修復(fù)材料，有以金屬、陶瓷或高分子制造的不同類型，它們?cè)谏锘钚?、生物相容性、生物可降解性、力學(xué)性能和使用壽命等方面具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。然而，現(xiàn)有人工骨支架普遍存在的問題是，雖然種植體與骨界面可形成一定的骨性結(jié)合，但由于新骨生長(zhǎng)受局部微環(huán)境的限制，爬行替代緩慢，在治療大范圍骨缺損時(shí)，成骨僅限于植體邊緣區(qū)域，難以實(shí)現(xiàn)支架與骨的整合以及缺損區(qū)的完整修復(fù)和重建。

研究證實(shí)，即使支架材料具有較高孔隙率和孔間貫通性，受植區(qū)的成骨量也十分有限，新骨組織長(zhǎng)入材料的深度至多能達(dá)到其表面孔徑的10倍。(Davies JE,et al.Topographic scale-range synergy at the functional bone/implant interface.Biomaterials 2014(35):25-35)對(duì)于生物可降解性材料而言，如果材料與宿主骨不能完全融合，其內(nèi)部累積的降解產(chǎn)物難以參與人體正常生理代謝，容易出現(xiàn)無菌性炎癥而導(dǎo)致手術(shù)失敗。

骨缺損修復(fù)和再生需要適宜的外界微環(huán)境，如果材料的內(nèi)部框架結(jié)構(gòu)不能模擬自然骨細(xì)胞外基質(zhì)形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，不利于細(xì)胞相互之間的聯(lián)系及信息傳遞，參與骨修復(fù)的細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移受限，難以實(shí)現(xiàn)骨整合。要從根本上解決植入體與宿主骨組織的整合問題，需通過調(diào)控支架材料的構(gòu)成組分和微觀結(jié)構(gòu)來優(yōu)化其性能。從材料學(xué)的角度看，自然骨是一種從納米尺度到宏觀水平分級(jí)排列精密構(gòu)建的膠原纖維-磷灰石復(fù)合生物材料。骨組織中的基本結(jié)構(gòu)單元—骨單位(Osteons)由同心圓排列的哈佛骨板(Haversian lamella)構(gòu)成，直徑為100～500μm，中央管內(nèi)為血管神經(jīng)，外圍骨板中的膠原纖維呈螺旋狀走行，相鄰骨板的纖維方向互成直角，骨細(xì)胞取向分布于礦化的三維網(wǎng)絡(luò)矩陣中。自然狀態(tài)的骨微環(huán)境為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了極為有利的條件，均衡的營(yíng)養(yǎng)和物質(zhì)能量交換，促進(jìn)了細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。在體外如何構(gòu)建這一微環(huán)境，實(shí)際上要解決納米纖維從構(gòu)成組分到形貌尺寸、表面紋理、取向度及精密空間排布的協(xié)同調(diào)控，以利于不同細(xì)胞的粘附和長(zhǎng)期生長(zhǎng)，使支架、細(xì)胞和外基質(zhì)形成一個(gè)有機(jī)的結(jié)合體并最終形成功能化組織。

靜電紡絲制備的纖維直徑與細(xì)胞外基質(zhì)中的微絲相當(dāng)，加之彼此連通的微小孔隙結(jié)構(gòu)，能夠很好地模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供理想微環(huán)境，通過改變靜電紡絲供液和接收裝置的形式，還可得到具有特殊取向結(jié)構(gòu)的納米纖維，以滿足不同的細(xì)胞生長(zhǎng)需求。美國(guó)Clemson大學(xué)生物工程研究院設(shè)計(jì)了一種新型靜電紡絲收集裝置，采用兩條平行傳送帶接收納米纖維。這種裝置能控制納米纖維取向排列并避免其相互粘連，得到稀疏層疊排列的三維支架，使細(xì)胞較好地粘附并穿透纖維支架內(nèi)部生長(zhǎng)。但該方法制備的納米纖維支架力學(xué)強(qiáng)度欠佳，限制了其在人工骨替代材料方面的應(yīng)用。(Beachley V,et al.A novel method to precisely assemble loose nanofiber structures for regenerative medicine applications.Adv.Healthc.Mater.2013(2):343-51)近期上海東華大學(xué)聯(lián)合美國(guó)Cornell大學(xué)報(bào)道了一種各向異性的編織型納米纖維支架，通過對(duì)兩組供液針頭施加相反的電壓，以使帶相反電荷的聚合物溶液噴射流(各自從針頭拉出)向中間區(qū)域聚集，再結(jié)合電子提花和環(huán)錠捻線工藝構(gòu)建出不同花紋的納米纖維平面編織網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。將人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞(HAVIC)和人主動(dòng)脈根部平滑肌細(xì)胞(HASMC)包封在水凝膠/編織型納米纖維復(fù)合材料中，構(gòu)成了類心臟瓣膜細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境并顯示出各向異性的生物力學(xué)特性。這種支架具有優(yōu)異的力學(xué)性能，但其微觀結(jié)構(gòu)與骨單位中膠原纖維的螺旋取向空間排布還有較大差異，不適用于骨組織缺損的修復(fù)重建。(Wu S,et al.Fabrication of aligned nanofiberpolymer yarn networks for anisotropic soft tissue scaffolds.ACS Appl.Mater.Interfaces 2016(8):16950-60)迄今為止，尚未見以靜電紡納米纖維按照分層交錯(cuò)螺旋的方式構(gòu)建仿生人工骨支架用于骨缺損修復(fù)治療的文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于：(1)提供一種仿生人工骨支架的制備方法；(2)提供一種仿生人工骨支架。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

1、一種仿生人工骨支架的制備方法，包括如下步驟：

(1)將I型膠原和生物可降解高分子溶于溶劑中，制得材料溶液A；

(2)將納米羥基磷灰石加入步驟(1)中制得的溶液A中，制得材料溶液B；

(3)利用靜電紡絲法以步驟(1)中材料溶液A為原料紡制支架的中心通道層，再以步驟(2)中材料溶液B為原料在制得的中心通道層上紡制支架的外圍柱體層。

進(jìn)一步，步驟(1)中，所述I型膠原和生物可降解高分子的質(zhì)量比為99～50:1～50。

進(jìn)一步，步驟(1)中，所述生物可降解高分子為殼聚糖、透明質(zhì)酸、海藻酸鈉、聚氧化乙烯、聚丙交酯-乙交酯、聚乙烯醇、聚己內(nèi)酯或聚乳酸中的一種或多種。

進(jìn)一步，步驟(1)中，所述溶劑為水、乙酸、六氟異丙醇、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜中的一種或多種。

進(jìn)一步，步驟(1)中，所述材料溶液A還包含VEGF、b-FGF、Ang-1,2、TGF-β或EGF中的一種或多種，在所述材料溶液A中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.00001～0.01％。

進(jìn)一步，步驟(2)中，所述材料溶液B還包含BMP-2,7、OGP、PDGF、TGF-β、SGF或IGF-1,2中的一種或多種，在所述材料溶液B中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.00001～0.01％。

進(jìn)一步，步驟(2)中，所述材料溶液B中納米羥基磷灰石的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10～80％；所述納米羥基磷灰石由鈣鹽和磷酸或鈣鹽和磷酸鹽按鈣/磷摩爾配比1.67:1在pH為10～14條件下反應(yīng)合成；所述鈣鹽為Ca(NO₃)₂、CaCl₂、Ca(OH)₂、Ca(CH₃COO)₂或CaCO₃中的一種；所述磷酸鹽為(NH₄)₂HPO₄、NH₄H₂PO₄、Na₃PO₄、Na₂HPO₄或NaH₂PO₄中的一種。

進(jìn)一步，步驟(3)中，所述支架的中心通道層和外圍柱體層具體由以下方法制得：

1)將所述材料溶液A和材料溶液B分別注入推注器至各推注器內(nèi)無空氣；

2)利用靜電紡絲法，首先將步驟1)中的推注器安裝在靜電紡絲裝置中平移裝置的移動(dòng)滑塊上，調(diào)整推進(jìn)擋板位置，設(shè)置靜電紡絲參數(shù)，然后推注所述材料溶液A，調(diào)整電壓至推注器噴頭液滴形成穩(wěn)定噴射流，推注過程中所述移動(dòng)滑塊始終保持同向移動(dòng)，待接收裝置上形成所述中心通道層后，開始推注所述材料溶液B，同時(shí)停止推注所述材料溶液A，此推注過程中所述移動(dòng)滑塊移動(dòng)方向交替變換，最終形成所述支架外圍柱體層。

進(jìn)一步，步驟2)中，所述靜電紡絲參數(shù)具體為：溫度20～60℃，濕度40～80％，所述推注器噴頭與接收裝置之間電勢(shì)差為5～20V，電極間距10～20cm，推注速度0.01～0.60mm/min，平移速度0～500mm/min，平移行程0～100mm，接收裝置轉(zhuǎn)速1000～3000rpm。

2、由所述的一種仿生人工骨支架的制備方法制得的仿生人工骨支架，其特征在于，所述仿生人工骨支架包括中心通道層和套設(shè)在所述中心通道層上的外圍柱體層；所述中心通道層和外圍柱體層均由若干個(gè)納米纖維層同軸設(shè)置，所述中心通道層中的相鄰兩個(gè)所述納米纖維層的纖維螺旋方向相同；所述外圍柱體層中的相鄰兩個(gè)所述納米纖維層的纖維螺旋方向相反；所述納米纖維層由纖維沿其軸向螺旋排列組成。

進(jìn)一步，所述納米纖維層中纖維直徑為10～800nm，纖維間孔徑為0.01～100μm。

進(jìn)一步，其特征在于，所述支架的高度為0.1～10cm；所述納米纖維層的厚度為1～100μm；所述中心通道層的厚度為1～500μm；所述外圍柱體層的厚度為10μm～25mm。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供一種仿生人工骨支架及其制備方法，所述方法操作簡(jiǎn)便，條件溫和易控，使用原料來源廣泛，運(yùn)用靜電紡絲制備裝置，通過裝置中的微型桿狀收集裝置，聯(lián)合輔助電極和平移裝置，并通過對(duì)溫度、濕度、電壓、電極間距、推注速度、接收轉(zhuǎn)速等參數(shù)設(shè)置，可協(xié)同調(diào)控納米纖維層中纖維的空間排列方式，排列的角度和間隙可根據(jù)實(shí)際應(yīng)用需求進(jìn)行靈活調(diào)控，構(gòu)建出精致模擬骨單位結(jié)構(gòu)的中空?qǐng)A柱狀、具有中心通道層和套設(shè)在所述中心通道層上的外圍柱體層的仿生人工骨支架，其中，所述中心通道層中的相鄰兩個(gè)所述納米纖維層的纖維螺旋方向相同；所述外圍柱體層中的相鄰兩個(gè)所述納米纖維層的纖維螺旋方向相反，這種納米纖維交錯(cuò)取向能夠極大地增強(qiáng)支架的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，為骨缺損部位提供有效的力學(xué)支撐，實(shí)現(xiàn)缺損位與正常骨組織間的力學(xué)傳遞，交錯(cuò)取向的納米纖維構(gòu)成互通的特殊網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，既能保持孔隙的貫通性，有利于細(xì)胞滲透生長(zhǎng)及血管和神經(jīng)長(zhǎng)入，也便于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳遞和細(xì)胞代謝廢物排出。同時(shí)，在支架中分層添加不同生長(zhǎng)因子可為種子細(xì)胞BMSCs提供差異化誘導(dǎo)環(huán)境，仿生構(gòu)建出中心通道層血管化組織、外圍柱體層骨組織的人工骨支架，能夠增強(qiáng)人工骨材料修復(fù)骨缺損的能力，為大范圍骨缺損修復(fù)提供有效的治療策略，且該支架在體內(nèi)可吸收降解，其降解產(chǎn)物無毒副作用，生物安全性高，在生物醫(yī)學(xué)材料及組織工程領(lǐng)域中具有理想的推廣和應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說明：

圖1為仿生人工骨支架的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為仿生人工骨支架的制備裝置示意圖；

圖3為實(shí)施例4仿生人工骨支架的實(shí)物圖；

圖4為實(shí)施例4仿生人工骨支架中納米纖維層的掃描電鏡圖和偏角分布分析圖；

圖5為實(shí)施例4中細(xì)胞沿著仿生人工骨支架取向生長(zhǎng)的熒光顯微鏡圖。

其中，圖1中A為仿生人工骨支架示意圖，a為支架的中心通道層，b為支架的外圍柱體層；B為多個(gè)仿生人工骨支架平行并列組裝形成的類哈佛系統(tǒng)組合式結(jié)構(gòu)體；C為中心通道層上BMSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化示意圖；D為外圍柱體層上BMSCs向成骨細(xì)胞分化示意圖；

圖2中，仿生人工骨支架的制備裝置包括推注器1、平移裝置2、移動(dòng)滑塊201、導(dǎo)軌202、加緊裝置203、高壓電源3、收集裝置4、固定夾401、接收桿402、導(dǎo)向器403和輔助電極5；

圖4中，A圖為中心通道層中納米纖維層的掃描電鏡圖；B圖為中心通道層中納米纖維層的偏角分布分析圖；C圖為外圍柱體層中納米纖維層的掃描電鏡圖；D圖為外圍柱體層中納米纖維層的偏角分布分析圖；

圖5中，A圖為鬼筆環(huán)肽熒光染色圖，B圖為DAPI染色圖，C圖為Merge合成圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。

采用如圖2所示的制備裝置制備仿生人工骨支架。

實(shí)施例1

(1)將I型膠原與生物可降解高分子按質(zhì)量比99:1溶于六氟異丙醇和二甲基甲酰胺的復(fù)合溶劑中(六氟異丙醇與二甲基甲酰胺的體積比為2:1)中，并加入細(xì)胞生長(zhǎng)因子，制得材料溶液A，其中，可降解高分子為聚丙交酯-乙交酯；細(xì)胞生長(zhǎng)因子為VEGF和b-FGF，在材料溶液A中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.001％和0.00001％；

(2)將納米羥基磷灰石(n-HA)加入步驟(1)中制得的I型膠原/聚丙交酯-乙交酯混合溶液中，并加入細(xì)胞生長(zhǎng)因子，制得材料溶液B，其中，n-HA由Ca(OH)₂和磷酸按鈣/磷摩爾配比1.67:1在pH為10的條件下反應(yīng)合成，在材料溶液B中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％；細(xì)胞生長(zhǎng)因子為BMP-7和OGP，在材料溶液B中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.005％和0.00002％；

(3)利用靜電紡絲法以步驟(1)中材料溶液A為原料紡制支架的中心通道層，再以步驟(2)中材料溶液B為原料在制得的中心通道層上紡制支架的外圍柱體層，具體步驟如下：

1)將所述材料溶液A和材料溶液B分別注入推注器至各推注器內(nèi)無空氣；

2)利用靜電紡絲法，首先將步驟1)中的推注器安裝在靜電紡絲裝置中的進(jìn)樣泵上，調(diào)整推進(jìn)擋板位置，選用直徑0.1mm，長(zhǎng)度2cm的微型接收桿為接收器，制備中心通道層時(shí)靜電紡絲參數(shù)設(shè)置為：溫度50℃，濕度60％，所述推注器噴頭與接收裝置之間電勢(shì)差為5V，電極間距10cm，推注速度0.01mm/min，平移速度0mm/min，平移行程0mm，接收裝置轉(zhuǎn)速1000rpm，制備外圍柱體層時(shí)靜電紡絲參數(shù)設(shè)置為：溫度50℃，濕度60％，所述推注器噴頭與接收裝置之間電勢(shì)差為7V，電極間距10cm，推注速度0.01mm/min，平移速度200mm/min，平移行程10mm，接收裝置轉(zhuǎn)速1800rpm，然后推注所述材料溶液A，調(diào)整電壓至推注器噴頭液滴形成穩(wěn)定噴射流，推注過程中固定有推注器的移動(dòng)滑塊位于平移裝置中部且保持不動(dòng)，待接收裝置上形成厚度為1μm的中心通道層后，開始推注所述材料溶液B，同時(shí)停止推注所述材料溶液A，此推注過程中固定有推注器的移動(dòng)滑塊的移動(dòng)方向交替變換，具體移動(dòng)方式為：所述移動(dòng)滑塊由平移裝置中心向一個(gè)方向移動(dòng)后返回中心位置，再往另一個(gè)方向移動(dòng)后再次返回中心位置，如此往復(fù)運(yùn)動(dòng)，最終形成厚度為10μm的支架外圍柱體層，制得的人工支架高度為2cm。

(4)將制得的仿生人工支架從接收桿上取下，用75％乙醇或環(huán)氧乙烷滅菌后浸泡于培養(yǎng)基中，按照5×10⁴個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種BMSCs，采用細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行體外培養(yǎng)，促使細(xì)胞沿納米纖維框架網(wǎng)孔滲透生長(zhǎng)和定向分化，最后將長(zhǎng)有細(xì)胞的支架植入骨缺損處用以引導(dǎo)新骨再生重建。

實(shí)施例2

(1)將I型膠原與生物可降解高分子按質(zhì)量比80:20溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的乙酸溶液中，并加入細(xì)胞生長(zhǎng)因子，制得材料溶液A，其中，可降解高分子為殼聚糖和透明質(zhì)酸的混合物(殼聚糖和透明質(zhì)酸的質(zhì)量比為7:3)；細(xì)胞生長(zhǎng)因子為VEGF、Ang-1和Ang-2，在材料溶液A中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.001％、0.0001％和0.0001％；

(2)將納米羥基磷灰石(n-HA)加入步驟(1)中制得的I型膠原/殼聚糖/透明質(zhì)酸混合溶液中，并加入細(xì)胞生長(zhǎng)因子，制得材料溶液B，其中，n-HA由Ca(NO₃)₂和(NH₄)₂HPO₄按鈣/磷摩爾配比1.67:1在pH為11的條件下反應(yīng)合成，在材料溶液B中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60％；細(xì)胞生長(zhǎng)因子為BMP-2和TGF-β，在材料溶液B中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.003％和0.0001％；

(3)利用靜電紡絲法以步驟(1)中材料溶液A為原料紡制支架的中心通道層，再以步驟(2)中材料溶液B為原料在制得的中心通道層上紡制支架的外圍柱體層，具體步驟如下：

1)將所述材料溶液A和材料溶液B分別注入推注器至各推注器內(nèi)無空氣；

2)利用靜電紡絲法，首先將步驟1)中的推注器安裝在靜電紡絲裝置中的進(jìn)樣泵上，調(diào)整推進(jìn)擋板位置，選用直徑0.3mm，長(zhǎng)度5cm的微型接收桿為接收器，制備中心通道層時(shí)靜電紡絲參數(shù)設(shè)置為：溫度30℃，濕度70％，所述推注器噴頭與接收裝置之間電勢(shì)差為8V，電極間距14cm，推注速度0.1mm/min，平移速度4mm/min，平移行程50mm，接收裝置轉(zhuǎn)速1500rpm，制備外圍柱體層時(shí)靜電紡絲參數(shù)設(shè)置為：溫度30℃，濕度70％，所述推注器噴頭與接收裝置之間電勢(shì)差為10V，電極間距14cm，推注速度0.1mm/min，平移速度300mm/min，平移行程25mm，接收裝置轉(zhuǎn)速2200rpm，然后推注所述材料溶液A，調(diào)整電壓至推注器噴頭液滴形成穩(wěn)定噴射流，推注過程中固定有推注器的移動(dòng)滑塊位于平移裝置一端，且始終保持同向移動(dòng)，待接收裝置上形成厚度為50μm的中心通道層后，開始推注所述材料溶液B，同時(shí)停止推注所述材料溶液A，此推注過程中固定有推注器的移動(dòng)滑塊位于平移裝置的中心，且移動(dòng)方向交替變換，具體移動(dòng)方式為：所述移動(dòng)滑塊由平移裝置中心向一個(gè)方向移動(dòng)后返回中心位置，再往另一個(gè)方向移動(dòng)后再次返回中心位置，如此往復(fù)運(yùn)動(dòng)，最終形成厚度為1mm的支架外圍柱體層，制得的人工支架高度為5cm。

(4)將制得的仿生人工支架從接收桿上取下，用75％乙醇或環(huán)氧乙烷滅菌后浸泡于培養(yǎng)基中，按照5×10⁴個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種BMSCs，采用細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行體外培養(yǎng)，促使細(xì)胞沿納米纖維框架網(wǎng)孔滲透生長(zhǎng)和定向分化，最后將長(zhǎng)有細(xì)胞的支架植入骨缺損處用以引導(dǎo)新骨再生重建。

實(shí)施例3

(1)將I型膠原與生物可降解高分子按質(zhì)量比70:30溶于二甲基亞砜中，并加入細(xì)胞生長(zhǎng)因子，制得材料溶液A，其中，可降解高分子為聚乳酸和聚乙烯醇的混合物(聚乳酸和聚乙烯醇的質(zhì)量比為1:1)；細(xì)胞生長(zhǎng)因子為VEGF、TGF-β和b-FGF，在材料溶液A中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.002％、0.002％和0.001％；

(2)將納米羥基磷灰石(n-HA)加入步驟(1)中制得的I型膠原/聚乳酸/聚乙烯醇混合溶液中，并加入細(xì)胞生長(zhǎng)因子，制得材料溶液B，其中，n-HA由CaCl₂和Na₃PO₄按鈣/磷摩爾配比1.67:1在pH為12的條件下反應(yīng)合成，在材料溶液B中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40％；細(xì)胞生長(zhǎng)因子為BMP-7和PDGF的混合物，在材料溶液B中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.004％和0.001％；

(3)利用靜電紡絲法以步驟(1)中材料溶液A為原料紡制支架的中心通道層，再以步驟(2)中材料溶液B為原料在制得的中心通道層上紡制支架的外圍柱體層，具體步驟如下：

1)將所述材料溶液A和材料溶液B分別注入推注器至各推注器內(nèi)無空氣；

2)利用靜電紡絲法，首先將步驟1)中的推注器安裝在靜電紡絲裝置中的進(jìn)樣泵上，調(diào)整推進(jìn)擋板位置，選用直徑6.0mm，長(zhǎng)度8cm的微型接收桿為接收器，制備中心通道層時(shí)靜電紡絲參數(shù)設(shè)置為：溫度40℃，濕度80％，所述推注器噴頭與接收裝置之間電勢(shì)差為15V，電極間距16cm，推注速度0.4mm/min，平移速度8mm/min，平移行程80mm，接收裝置轉(zhuǎn)速1800rpm，制備外圍柱體層時(shí)靜電紡絲參數(shù)設(shè)置為：溫度40℃，濕度80％，所述推注器噴頭與接收裝置之間電勢(shì)差為17V，電極間距16cm，推注速度0.4mm/min，平移速度300mm/min，平移行程40mm，接收裝置轉(zhuǎn)速2400rpm，然后推注所述材料溶液A，調(diào)整電壓至推注器噴頭液滴形成穩(wěn)定噴射流，推注過程中固定有推注器的移動(dòng)滑塊位于平移裝置一端，且始終保持同向移動(dòng)，待接收裝置上形成厚度為100μm的中心通道層后，開始推注所述材料溶液B，同時(shí)停止推注所述材料溶液A，此推注過程中固定有推注器的移動(dòng)滑塊位于平移裝置的中心，且移動(dòng)方向交替變換，具體移動(dòng)方式為：所述移動(dòng)滑塊由平移裝置中心向一個(gè)方向移動(dòng)后返回中心位置，再往另一個(gè)方向移動(dòng)后再次返回中心位置，如此往復(fù)運(yùn)動(dòng)，最終形成厚度為10mm的支架外圍柱體層，制得的人工支架高度為8cm。

(4)將制得的仿生人工支架從接收桿上取下，用75％乙醇或環(huán)氧乙烷滅菌后浸泡于培養(yǎng)基中，按照5×10⁴個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種BMSCs，采用細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行體外培養(yǎng)，促使細(xì)胞沿納米纖維框架網(wǎng)孔滲透生長(zhǎng)和定向分化，最后將長(zhǎng)有細(xì)胞的支架植入骨缺損處用以引導(dǎo)新骨再生重建。

實(shí)施例4

(1)將I型膠原與生物可降解高分子按質(zhì)量比60:40溶于四氫呋喃和二甲基甲酰胺的復(fù)合溶液中(四氫呋喃與二甲基甲酰胺的體積比為1:1)中，并加入細(xì)胞生長(zhǎng)因子，制得材料溶液A，其中，可降解高分子為聚己內(nèi)酯、聚丙交酯-乙交酯(聚己內(nèi)酯與聚丙交酯-乙交酯質(zhì)量比為1:2)；細(xì)胞生長(zhǎng)因子為VEGF，在材料溶液A中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.002％；

(2)將納米羥基磷灰石(n-HA)加入步驟(1)中制得的I型膠原/聚己內(nèi)酯/聚丙交酯-乙交酯混合溶液中，并加入細(xì)胞生長(zhǎng)因子，制得材料溶液B，其中，n-HA由Ca(CH₃COO)₂和NaH₂PO₄按鈣/磷摩爾配比1.67:1在pH為13的條件下反應(yīng)合成，在材料溶液B中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％；細(xì)胞生長(zhǎng)因子為BMP-2和PDGF，在材料溶液B中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.004％和0.002％；

(3)利用靜電紡絲法以步驟(1)中材料溶液A為原料紡制支架的中心通道層，再以步驟(2)中材料溶液B為原料在制得的中心通道層上紡制支架的外圍柱體層，具體步驟如下：

1)將所述材料溶液A和材料溶液B分別注入推注器至各推注器內(nèi)無空氣；

2)利用靜電紡絲法，首先將步驟1)中的推注器安裝在靜電紡絲裝置中的進(jìn)樣泵上，調(diào)整推進(jìn)擋板位置，選用直徑0.5mm，長(zhǎng)度2cm的微型接收桿為接收器，制備中心通道層時(shí)靜電紡絲參數(shù)設(shè)置為：溫度30℃，濕度40％，所述推注器噴頭與接收裝置之間電勢(shì)差為13V，電極間距15cm，推注速度0.2mm/min，平移速度10mm/min，平移行程20mm，接收裝置轉(zhuǎn)速2000rpm，制備外圍柱體層時(shí)靜電紡絲參數(shù)設(shè)置為：溫度30℃，濕度40％，所述推注器噴頭與接收裝置之間電勢(shì)差為15V，電極間距15cm，推注速度0.2mm/min，平移速度240mm/min，平移行程10mm，接收裝置轉(zhuǎn)速2800rpm，然后推注所述材料溶液A，調(diào)整電壓至推注器噴頭液滴形成穩(wěn)定噴射流，推注過程中固定有推注器的移動(dòng)滑塊位于平移裝置一端，且始終保持同向移動(dòng)，待接收裝置上形成厚度為200μm的中心通道層后，開始推注所述材料溶液B，同時(shí)停止推注所述材料溶液A，此推注過程中固定有推注器的移動(dòng)滑塊位于平移裝置的中心，且移動(dòng)方向交替變換，具體移動(dòng)方式為：所述移動(dòng)滑塊由平移裝置中心向一個(gè)方向移動(dòng)后返回中心位置，再往另一個(gè)方向移動(dòng)后再次返回中心位置，如此往復(fù)運(yùn)動(dòng)，最終形成厚度為2.5mm的支架外圍柱體層，制得的人工支架高度為2cm。

(4)將制得的仿生人工支架從接收桿上取下，用75％乙醇或環(huán)氧乙烷滅菌后浸泡于培養(yǎng)基中，按照5×10⁴個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種BMSCs，采用細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行體外培養(yǎng)，促使細(xì)胞沿納米纖維框架網(wǎng)孔滲透生長(zhǎng)和定向分化，最后將長(zhǎng)有細(xì)胞的支架植入骨缺損處用以引導(dǎo)新骨再生重建。

實(shí)施例5

(1)將I型膠原與生物可降解高分子按質(zhì)量比50:50溶于水中，并加入細(xì)胞生長(zhǎng)因子，制得材料溶液A，其中，可降解高分子為海藻酸鈉和聚氧化乙烯的混合物(海藻酸鈉和聚氧化乙烯的質(zhì)量比為4:1)；細(xì)胞生長(zhǎng)因子為VEGF和EGF，在材料溶液A中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.008％和0.002％；

(2)將納米羥基磷灰石(n-HA)加入步驟(1)中制得的溶液A中，并加入細(xì)胞生長(zhǎng)因子，制得材料溶液B，其中，n-HA由CaCO₃和Na₂HPO₄按鈣/磷摩爾配比1.67:1在pH為14的條件下反應(yīng)合成，在材料溶液B中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80％；細(xì)胞生長(zhǎng)因子為SGF、IGF-1和IGF-2，在材料溶液B中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.005％、0.003％和0.002％；

(3)利用靜電紡絲法以步驟(1)中材料溶液A為原料紡制支架的中心通道層，再以步驟(2)中材料溶液B為原料在制得的中心通道層上紡制支架的外圍柱體層，具體步驟如下：

1)將所述材料溶液A和材料溶液B分別注入推注器至各推注器內(nèi)無空氣；

2)利用靜電紡絲法，首先將步驟1)中的推注器安裝在靜電紡絲裝置中的進(jìn)樣泵上，調(diào)整推進(jìn)擋板位置，選用直徑2.0mm，長(zhǎng)度6cm的微型接收桿為接收器，制備中心通道層時(shí)靜電紡絲參數(shù)設(shè)置為：溫度40℃，濕度60％，所述推注器噴頭與接收裝置之間電勢(shì)差為19V，電極間距20cm，推注速度0.6mm/min，平移速度12mm/min，平移行程60mm，接收裝置轉(zhuǎn)速2200rpm，制備外圍柱體層時(shí)靜電紡絲參數(shù)設(shè)置為：溫度60℃，濕度90％，所述推注器噴頭與接收裝置之間電勢(shì)差為20V，電極間距20cm，推注速度0.6mm/min，平移速度500mm/min，平移行程30mm，接收裝置轉(zhuǎn)速3000rpm，然后推注所述材料溶液A，調(diào)整電壓至推注器噴頭液滴形成穩(wěn)定噴射流，推注過程中固定有推注器的移動(dòng)滑塊位于平移裝置一端，且始終保持同向移動(dòng)，待接收裝置上形成500μm的中心通道層后，開始推注所述材料溶液B，同時(shí)停止推注所述材料溶液A，此推注過程中固定有推注器的移動(dòng)滑塊位于平移裝置的中心，且移動(dòng)方向交替變換，具體移動(dòng)方式為：所述移動(dòng)滑塊由平移裝置中心向一個(gè)方向移動(dòng)后返回中心位置，再往另一個(gè)方向移動(dòng)后再次返回中心位置，如此往復(fù)運(yùn)動(dòng)，最終形成25mm的支架外圍柱體層，制得的人工支架高度為6cm。

(4)將制得的仿生人工支架從接收桿上取下，用75％乙醇或環(huán)氧乙烷滅菌后浸泡于培養(yǎng)基中，按照5×10⁴個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種BMSCs，采用細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行體外培養(yǎng)，促使細(xì)胞沿納米纖維框架網(wǎng)孔滲透生長(zhǎng)和定向分化，最后將長(zhǎng)有細(xì)胞的支架植入骨缺損處用以引導(dǎo)新骨再生重建。

圖1為仿生人工骨支架的結(jié)構(gòu)示意圖，由圖1A可知，本發(fā)明中的仿生人工骨支架包括中心通道層a和套設(shè)在所述中心通道層上的外圍柱體層b，所述中心通道層a和外圍柱體層b均由若干個(gè)納米纖維層同軸設(shè)置，所述中心通道層中的相鄰兩個(gè)所述納米纖維層的纖維螺旋方向相同，所述外圍柱體層中的相鄰兩個(gè)所述納米纖維層的纖維螺旋方向相反；所述納米纖維層由纖維沿其軸向螺旋排列組成，且多個(gè)人工仿生人工骨支架可平行并列組裝形成類哈佛系統(tǒng)組合式結(jié)構(gòu)體(如圖1B所示)；中心通道層上BMSCs沿著納米纖維取向排列延伸，并向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化(如圖1C所示)，外圍柱體層中不同層面的BMSCs沿著纖維粘附鋪展并向成骨細(xì)胞分化，交錯(cuò)取向分布于支架的三維網(wǎng)絡(luò)框架中(如圖1D所示)，構(gòu)建出與天然骨相類似的微環(huán)境。

圖2為仿生人工骨支架的制備裝置示意圖，包括推注器1、平移裝置2、高壓電源3、收集裝置4和輔助電極5，所述平移裝置2包括導(dǎo)軌202和設(shè)置在導(dǎo)軌上可沿導(dǎo)軌往復(fù)運(yùn)動(dòng)的移動(dòng)滑塊201，所述移動(dòng)滑塊201上設(shè)置有可固定推注器1的加緊裝置203；所述高壓電源3的一端與助推器1的噴嘴相連，另一端與收集裝置4相連；所述收集裝置4包括固定夾401、接收桿402和導(dǎo)向器403，所述固定夾401的孔徑可調(diào)節(jié)，用于固定不同尺寸的接收桿402，并通過電機(jī)帶動(dòng)接收桿402沿軸心旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，所述接收桿402的直徑為0.1～8.0mm，長(zhǎng)度為2～10cm，所述導(dǎo)向器403套設(shè)在接收桿402外圍末端，用于控制接收桿402的方向，防止其在高速旋轉(zhuǎn)時(shí)劇烈晃動(dòng)，根據(jù)接收桿402的直徑大小來選擇與之匹配尺寸的導(dǎo)向器403；所述輔助電極5包含兩個(gè)極板，所述收集裝置4設(shè)置在所述兩個(gè)極板之間。

圖3為由實(shí)施例4中的方法制備得到的仿生人工骨支架的實(shí)物圖。

圖4中，A圖和C圖分別為仿生人工骨支架中心通道層和外圍柱體層中納米纖維層的掃描電鏡圖，由圖4A可以看出，納米纖維表面光滑，直徑在200～300nm，孔徑為0.8～2.2μm，圖4C中的納米纖維由于加入了羥基磷灰石成分，表面比圖4A中的納米纖維略為粗糙，其直徑在240～360nm，孔徑為0.8～3.0μm，兩組納米纖維的微觀尺寸均勻，具有良好的分散性，呈取向排列。根據(jù)材料溶液成分和所選擇溶劑的不同，以及靜電紡絲條件參數(shù)(包括溫度、濕度、電壓、電極間距、推注速度、平移速度、接收裝置轉(zhuǎn)速等)的改變，納米纖維支架的直徑和孔徑會(huì)隨之發(fā)生變化，其直徑范圍為10～800nm，纖維間孔徑范圍為0.01～100μm；B圖和D圖分別為仿生人工骨支架中心通道層和外圍柱體層中納米纖維層的偏角分布分析圖，由圖4B可以看出，纖維取向分布主要集中在偏角為70°～110°，其中偏角分布在85°～90°的概率最高，由圖4D可以看出，纖維取向分布主要集中在偏角為95°～135°，其中偏角分布在110°～115°的概率最高，兩組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布。

圖5為實(shí)施例4中細(xì)胞沿著仿生人工骨支架取向生長(zhǎng)的熒光顯微鏡圖，由圖5可見，細(xì)胞在納米纖維上粘附良好并沿著纖維取向延伸，大部分細(xì)胞呈梭形鋪展，延伸進(jìn)入纖維間隙中，呈三維生長(zhǎng)。由于納米纖維的空間排列方式，可以影響細(xì)胞的粘附、遷移、增殖和分化行為，取向排列的仿生人工骨支架，能夠引導(dǎo)細(xì)胞沿其三維網(wǎng)絡(luò)框架結(jié)構(gòu)取向生長(zhǎng)，隨著材料的降解和細(xì)胞外基質(zhì)的堆積，細(xì)胞將會(huì)自組裝出一種具有組織形態(tài)的構(gòu)造體，有望實(shí)現(xiàn)材料與骨組織的整合以及缺損區(qū)的完整修復(fù)和重建。

最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。