本發(fā)明涉及龍膽苦苷在防治胃潰瘍疾病中的應(yīng)用。

技術(shù)背景

胃潰瘍是一種胃部潰瘍性疾病，發(fā)病率在世界各個(gè)國(guó)家非常常見(jiàn)。當(dāng)該疾病發(fā)作時(shí)，胃粘膜可出現(xiàn)明顯的充血、糜爛，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致胃穿孔，威脅生命。雖然目前胃潰瘍的具體發(fā)病機(jī)制尚未清楚，但被大家認(rèn)可的是胃潰瘍的發(fā)生發(fā)展及嚴(yán)重程度，與胃粘膜組織中如MDA、MPO、TNF-α、IL-6等異常的升高，同時(shí)抗氧化應(yīng)激水平相對(duì)較低密切相關(guān)。在胃潰瘍防治藥物評(píng)價(jià)中，高濃度乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍小鼠模型，是一種常見(jiàn)的用于研究受試藥物在胃潰瘍疾病中的作用效果的基本模型，當(dāng)給予小鼠灌胃高濃度乙醇后，可迅速引起小鼠胃部粘膜點(diǎn)狀或條形糜爛，以及充血。

秦艽是我國(guó)傳統(tǒng)的一味中藥，其藥用部位為根，其80%乙醇提取物經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂D-101處理后，獲得的龍膽總苷，現(xiàn)已成為市售藥品，主要用于功能性消化不良屬肝胃郁熱證者，癥見(jiàn)胃脘飽脹，脘部燒灼，該藥中龍膽苦苷含量達(dá)50%以上（中國(guó)專利ZL97108434.3）。而將龍膽總苷經(jīng)過(guò)重結(jié)晶獲得龍膽苦苷，作為肌肉和靜脈注射的龍膽苦苷粉針劑（中國(guó)專利ZL 03114558.2），及在抑制肝炎病毒藥物中的應(yīng)用（中國(guó)專利 ZL 200410073488.7）已獲得國(guó)家專利授權(quán)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供龍膽苦苷的新用途，具體涉及在防治胃潰瘍疾病中的應(yīng)用。

解決上述問(wèn)題的技術(shù)方案：從秦艽藥材中制備出龍膽苦苷（含量大于98%），此制備的龍膽苦苷制成片劑、膠囊劑、糖漿劑、顆粒劑等口服制劑，用于防治胃潰瘍疾病。

龍膽苦苷的制備工藝：

（1）秦艽藥材粉碎后，過(guò)100目篩，取藥材粉末，以藥材比水1：10煎煮3次，每次15分鐘，合并煎煮液，離心取上清液；

（2）取上清液上D101大孔吸附樹(shù)脂柱，每克樹(shù)脂上50 mL藥液，大孔樹(shù)脂柱用2 ~ 4倍量的水洗液洗脫，棄掉此水洗液，再用3 ~ 10倍的30%乙醇洗脫樹(shù)脂柱，收集30%乙醇洗脫液，減壓抽干，得含龍膽苦苷約70%殘留物；

（3）將此殘留物用水溶解再上大孔吸附樹(shù)脂柱D101，用30%乙醇洗脫，回收洗脫液，所得殘留物溶于2 ~ 5倍的95%乙醇中，過(guò)濾，回收乙醇并抽干，再用95%乙醇溶解，放置，析出結(jié)晶，過(guò)濾，得含量大于98%龍膽苦苷。

龍膽苦苷防治胃潰瘍，以常用制劑的形式來(lái)使用：所述的常規(guī)藥物用制劑含作為活性成分在制劑中與藥學(xué)上可接受的載體賦形劑混合，該藥用制劑可以是固體形式如片劑，膠囊劑，顆粒劑，也可以是液體形式如糖漿劑等口服制劑。

上述制劑中可含有輔助物質(zhì)、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑和其它常用的添加劑：乳糖、檸檬酸、酒石酸、硬脂酸、硬脂酸鎂、石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明膠、瓊脂、果膠、花生油、橄欖油、可可脂、乙二醇、抗壞血酸、甘露醇等。

上述的制劑可按照各種制劑常規(guī)的制備工藝制成。

本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了：龍膽苦苷能抑制胃粘膜組織中MDA, MPO, TNF-α, IL-6的分泌，同時(shí)升高胃粘膜組織SOD，GSH的水平，提高抗氧化應(yīng)激能力，減少小鼠胃粘膜糜爛性損傷的程度，達(dá)到了防治胃潰瘍的目的，龍膽苦苷具有良好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用于胃潰瘍疾病防治的價(jià)值。

說(shuō)明書(shū)附圖

圖1. (A) 小鼠胃粘膜損傷的情況；(B) 潰瘍指數(shù)評(píng)估。 ^###P ≤ 0.01 與正常對(duì)照組比較, ^**P ≤ 0.01 和^***P ≤ 0.001 模型組比較，⁺P ≤ 0.05與西咪替丁組比較；

圖2. (A) 在70%誘導(dǎo)的小鼠胃潰瘍中，龍膽苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)對(duì)TNF-α的作用；(B) 在70%誘導(dǎo)的小鼠胃潰瘍中，龍膽苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)對(duì)IL-6的作用. ^###P ≤ 0.01 與正常對(duì)照組比較, ^**P ≤ 0.01 和^***P ≤ 0.001 模型組比較；

圖3. 在70%誘導(dǎo)的小鼠胃潰瘍中，龍膽苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)對(duì)MPO的作用. ^#P ≤ 0.05 和^###P ≤ 0.01 正常對(duì)照組比較, ^**P ≤ 0.01 和 ^***P ≤ 0.001 模型組比較, 以及 ⁺⁺⁺P ≤ 0.01 與西咪替丁組比較；

圖4. 在70%誘導(dǎo)的小鼠胃潰瘍中，龍膽苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100 mg/kg)對(duì)MPO的作用. ^#P ≤ 0.05 和 ^##P ≤ 0.01 正常對(duì)照組, ^*P ≤ 0.05, ^***P ≤ 0.01 和 ^***P ≤ 0.001 與模型組比較, and ⁺⁺⁺P ≤ 0.01 西咪替丁組比較；

圖5. (A) 在70%誘導(dǎo)的小鼠胃潰瘍中，龍膽苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)對(duì)SOD的作用；(B) 在70%誘導(dǎo)的小鼠胃潰瘍中，龍膽苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)對(duì)GSH的作用. ^#P ≤ 0.05, ^###P ≤ 0.01 和 ^###P ≤ 0.001 正常對(duì)照組比較, ^***P ≤ 0.001 與模型組比較, 以及 ⁺⁺⁺P ≤ 0.01西咪替丁組比較。

具體實(shí)施方式

下面發(fā)明人給出了用龍膽苦苷防治胃潰瘍疾病的實(shí)施實(shí)例。

實(shí)施例1

藥用龍膽苦苷制備成片劑，以生產(chǎn)片劑產(chǎn)品1000片為例，所用原料和輔料及其重量配比如下：

龍膽苦苷 200 g

淀粉 100 g

其制備工藝按制劑學(xué)片劑的常規(guī)工藝進(jìn)行，每片重0.3 g，每片含龍膽苦苷200 mg。

用法用量：口服，每次1片，一日1次，小兒酌減，15天一個(gè)療程。

實(shí)施例2

藥用龍膽苦苷制備成膠囊劑，以生產(chǎn)膠囊劑產(chǎn)品1000例為例，所用原料和輔料及其重量配比如下：

龍膽苦苷 200 g

淀粉 100 g

其制備工藝按制劑學(xué)膠囊劑的常規(guī)工藝進(jìn)行，每片重0.3 g，每片含龍膽苦苷200 mg。

用法用量：口服，每次1粒，一日1次，小兒酌減，15天一個(gè)療程。

實(shí)施例3

藥用龍膽苦苷制備成顆粒劑，以生產(chǎn)顆粒劑產(chǎn)品1000例為例，所用原料和輔料及其重量配比如下：

龍膽苦苷 200 g

蔗糖 400 g

糊精 400 g

其制備工藝按制劑學(xué)顆粒劑的常規(guī)工藝進(jìn)行，每袋重1 g，1 g含龍膽苦苷200 mg。

用法用量：口服，每次1袋，一日1次，小兒酌減，15天一個(gè)療程。

實(shí)施例4

藥用龍膽苦苷制備成糖漿劑，以生產(chǎn)糖漿劑產(chǎn)品1000 mL例為例，所用原料和輔料及其重量配比如下：

龍膽苦苷 200 g

蔗糖 600 g

蒸餾水 1000 mL

其制備工藝按制劑學(xué)糖漿劑的常規(guī)工藝進(jìn)行，每瓶重10 mL，1 mL含龍膽苦苷20 mg。

用法用量：口服，每次1瓶，一日1次，小兒酌減，15天一個(gè)療程。

實(shí)施例 5 藥效評(píng)價(jià)試驗(yàn)

為更好的理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面將用龍膽苦苷在70%乙醇誘導(dǎo)的小鼠胃潰瘍模型中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)說(shuō)明它在制藥領(lǐng)域中的新用途。

受試藥物

龍膽苦苷（含量大于98%），味苦，無(wú)色至微黃色固體粉末。

受試動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠，雄鼠，健康適齡，體重22 ~ 28g，購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(陜）2007-001，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(陜）2010-001.

3.實(shí)驗(yàn)試劑

無(wú)水乙醇，蒸餾水，70%乙醇由無(wú)水乙醇用蒸餾水稀釋而成。

試驗(yàn)方法

4.1供試藥品的配制

龍膽苦苷用蒸餾水分別配制成濃度為20 mg/kg，40 mg/kg，80 mg/kg的水溶液，4℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

龍膽苦苷對(duì)70%乙醇所致的急性胃潰瘍的防治作用

昆明種小鼠60只，在SPF條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，然后隨機(jī)將小鼠分成6組，每組10只，即空白對(duì)照組，70%乙醇控制組（模型組），70%乙醇+西咪替丁100 mg/kg控制組（西咪替丁組），70%乙醇+龍膽苦苷20 mg/kg控制組（龍膽苦苷20 mg/kg劑量組），70%乙醇+龍膽苦苷40 mg/kg控制組（龍膽苦苷40 mg/kg劑量組），70%乙醇+龍膽苦苷80 mg/kg控制組（龍膽苦苷80 mg/kg劑量組）。從第1天到第14天，空白組和70%乙醇控制組灌胃給予生理鹽水（0.01 mL/kg)，其余各組按劑量灌胃給予相應(yīng)的藥物，每天一次。第15天時(shí)，空白對(duì)照組和70%乙醇控制組灌胃給予生理鹽水，其余各組按劑量灌胃給予相應(yīng)的藥物，1小時(shí)后，空白組仍然給予生理鹽水，其余各組給予70%乙醇（0.01 mL/kg)，再過(guò)1小時(shí)后，所有動(dòng)物用麻醉后，眥取血液后，移除胃組織，沿胃大彎剪開(kāi)，用生理鹽水（4℃）洗去殘留物，于冰上展開(kāi)，然后觀察并記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算潰瘍指數(shù)。最后將所有小鼠胃組織儲(chǔ)藏于-80℃，用于胃粘膜組織中MDA, MPO, TNF-α, IL-6，SOD，GSH水平的測(cè)定。

小鼠胃粘膜潰瘍指數(shù)的評(píng)價(jià)得分方法如下：

0：沒(méi)有損傷；

1：粘膜充血；

2：針點(diǎn)狀糜爛(X < 1 mm)；

3：小的糜爛(1 mm < X)；

4：中等糜爛(1 mm ≤ X < 2 mm)；

5：大的糜爛( 2 mm≤ X <3 mm)；

6：大面積的糜爛(3 mm < X)。

胃潰瘍指數(shù)= 每組中總的得分/動(dòng)物個(gè)數(shù)

4.3. TNF-α、IL-6的測(cè)定

TNF-α, IL-6通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作，吸收波長(zhǎng)在450 um處進(jìn)行測(cè)定。

的測(cè)定

小鼠胃組織于磷酸二氫鉀緩沖液（pH= 6.5）中進(jìn)行勻漿，取部分組織勻漿液加入0.5%的十六烷基三甲基溴化胺溶液，渦旋10分鐘，然后在4 °C及20,000 × g下離心10分鐘，取上清液加入含有0.1 mM H₂O₂ 和 1.6 mM四甲基聯(lián)苯氨的溶液中，在37 °C進(jìn)行孵化。MPO的活性通過(guò)MPO測(cè)定試劑盒在450 nm下進(jìn)行測(cè)定。

的測(cè)定

小鼠胃組織于磷酸二氫鉀緩沖液（pH= 6.5）中進(jìn)行勻漿. 然后在4 °C及20,000 × g下離心10分鐘，取上清液. 于上清液中加入硫代巴比土酸進(jìn)行反應(yīng)后，在532 nm下測(cè)定MDA的濃度。

、GSH的測(cè)定

小鼠胃黏膜中SOD、GSH的測(cè)定用SOD 測(cè)定試劑盒和GSH 測(cè)定試劑盒來(lái)進(jìn)行測(cè)定，操作步驟嚴(yán)格按照測(cè)定試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以means ± S.E.M (standard error of mean)表示。其中模型組與空白對(duì)照組，以及龍膽苦苷三個(gè)不同的劑量組與西咪替丁組之間的顯著性分析通過(guò)Mann-Whitney U 進(jìn)行檢驗(yàn)。西咪替組和龍膽苦苷給藥組，與模型組之間的顯著性分析通過(guò)單因素方差分析中LSD-t 進(jìn)行檢驗(yàn)。P ≤ 0.05被認(rèn)為具有顯著性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6.1 胃粘膜潰瘍指數(shù)的評(píng)價(jià)

如圖1A, 正?？刂平M沒(méi)有出現(xiàn)明顯的胃粘膜糜爛性損傷，與模型組小鼠胃粘膜出現(xiàn)的嚴(yán)重性糜爛損傷相比，西咪替丁和龍膽苦苷預(yù)防性給藥減輕了胃粘膜損傷的程度。如圖1B, 從潰瘍指數(shù)評(píng)價(jià)得分結(jié)果來(lái)看，與模型組18.8 ± 3.809，龍膽苦苷(20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg)預(yù)防性給藥使?jié)冎笖?shù)評(píng)價(jià)得分分別降低到8.9 ± 1.709 (P ≤ 0.01), 2.6 ± 0.763 (P ≤ 0.001), 和 1.8 ± 0.853 (P ≤ 0.001)，并且預(yù)防性給以西咪替丁也是潰瘍指數(shù)評(píng)價(jià)得分降低到8.1 ± 1.929 (P ≤ 0.001)。同時(shí)龍膽苦苷大劑量組(80 mg/kg)，潰瘍指數(shù)評(píng)價(jià)得分低于西咪替丁給藥組。

胃粘膜中TNF-α, IL-6的評(píng)價(jià)

如圖2A，與模型組(683.07 ± 17.071)比較，龍膽苦苷(20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 預(yù)防性給藥分別將TNF-α 的水平降低到544.48 ± 15.546 pg/ml tissue (P ≤ 0.001), 478.74 ± 13.436 pg/ml tissue (P ≤ 0.001), 和 415.40 ± 10.475 pg/ml tissue (P ≤ 0.001)，而且 TNF-α 的水平在西咪替丁控制組也被降低到370.9 ± 11.501, P ≤ 0.001。如圖2B，與正?？刂平M(82.431 ± 3.429 pg/ml tissue)比較，IL-6水平在模型組升高到156.42 ± 2.905 pg/ml tissue (P ≤ 0.001)。而與7模型組比較，預(yù)防性給以龍膽苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg)，使IL-6的水平降低到 142.52 ± 2.905 pg/ml tissue (P ≤ 0.01), 122.25 ± 2.229 pg/ml tissue (P ≤ 0.001), and 113.04 ± 2.467 pg/ml tissue (P ≤ 0.001)，而且預(yù)防性給以西咪替丁使IL-6水平也降低到93.37 ± 2.432 pg/ml tissue (P ≤ 0.001)。

胃粘膜中MPO的評(píng)價(jià)

如圖3, 與模型組MPO水平(3.9 ± 0.044)比較, 預(yù)防性給以龍膽苦苷(20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)使MPO水平降低到3.49 ± 0.083 U/g tissue (P ≤ 0.01), 3.23 ± 0.043 U/g tissue (P ≤ 0.001), 2.74 ± 0.0519 U/g tissue (P ≤ 0.001), 和3.45 ± 0.064 (P ≤ 0.01)，并且龍膽苦苷80 mg/kg劑量組對(duì)MPO的降低程度優(yōu)于西咪替丁組(P ≤ 0.001)。

胃粘膜中MDA的評(píng)價(jià)

如圖4, 與模型組MDA水平(0.51 ± 0.028)比較, 預(yù)防性給以龍膽苦苷(20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)使MDA水平降低到0.41 ± 0.026 (P ≤ 0.05), 0.20 ± 0.013 (P ≤ 0.001), 0.33 ± 0.019 (P ≤ 0.001), and 0.37 ± 0.047 (P ≤ 0.01). 而且, 40 mg/kg 和 80 mg/kg 劑量組中MDA的水平明顯比西咪替丁組低(P ≤ 0.001)。

胃粘膜中SOD、GSH的評(píng)價(jià)

如圖5A和圖5B, 預(yù)防性給以龍膽苦苷和西咪替丁明顯升高了小鼠胃黏膜中SOD和GSH的水平。在給以龍膽苦苷20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg，SOD的水平分別達(dá)到7.65 ± 0.074 (P ≤ 0.001)、9.16 ± 0.134(P ≤ 0.001)、9.16 ± 0.1134(P ≤ 0.001)，GSH的水平分別達(dá)到7.65 ± 0.074 (P ≤ 0.001), 8.09 ± 0.134 (P ≤ 0.001), 9.16 ± 0.1134 (P ≤ 0.001)。而模型組的SOD、GSH水平為6.54 ± 0.120、6.54 ± 0.120. 與模型組SOD、GSH水平相比，給以西咪替丁(100mg/kg)也使SOD、GSH水平升高到8.16 ± 0.122(P ≤ 0.001)、8.16 ± 0.122 (P ≤ 0.001). 并且SOD和 GSH水平在龍膽苦苷大劑量組(80 mg/kg)都比西咪替丁組(100mg/kg)高(P ≤ 0.001).

7.結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在70%乙醇誘導(dǎo)的小鼠胃潰瘍模型中，龍膽苦苷能抑制胃粘膜組織中MDA, MPO, TNF-α, IL-6的分泌，同時(shí)升高胃粘膜組織SOD，GSH的水平，提高抗氧化應(yīng)激能力，減少小鼠胃粘膜糜爛性損傷的程度，達(dá)到了防治胃潰瘍的目的。并且龍膽苦苷80 mg/kg劑量對(duì)MDA, MPO降低的程度以及對(duì)SOD，GSH升高的程度優(yōu)于西咪替丁100 mg/kg的劑量，結(jié)合龍膽苦苷80 mg/kg劑量組和西咪替丁100 mg/kg劑量組的潰瘍指數(shù)評(píng)價(jià)得分結(jié)果，表明龍膽苦苷在80 mg/kg的劑量下，對(duì)胃潰瘍的防治效果優(yōu)于西咪替丁100 mg/kg的劑量，因此，說(shuō)明龍膽苦苷在胃潰瘍防治藥物中，具有良好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用于胃潰瘍疾病防治的價(jià)值。