本發(fā)明涉及一種多甲氧基黃酮在制備治療皮膚乳頭狀瘤的藥物上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在防御機(jī)制中，體內(nèi)適當(dāng)?shù)陌l(fā)炎反應(yīng)可以活化免疫系統(tǒng)，并啟動免疫與發(fā)炎反應(yīng)，清除外來物的傷害。當(dāng)外來物被清除及組織修補(bǔ)后，急性發(fā)炎即停止；若外來物清除不完全、免疫系統(tǒng)不全或解除發(fā)炎作用的信號傳遞失調(diào)等，就會形成慢性發(fā)炎反應(yīng)，正常細(xì)胞或組織受到發(fā)炎或免疫細(xì)胞產(chǎn)生的自由基的破壞，導(dǎo)致血管過度舒張、組織壞死，產(chǎn)生致癌性影響，其中包含引起DNA堿基突變及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)修飾，影響細(xì)胞膜功能或造成細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或酶的功能喪失。炎癥細(xì)胞開始轉(zhuǎn)變成腫瘤細(xì)胞并不斷增生[Allavena,P.,Garlanda,C.,Borrello,M.G.,Sica,A.,andMantovani,A.(2008)Pathwaysconnectinginflammationandcancer.Curr.Opin.Genet.Dev.,18,3-10.]?；瘜W(xué)致癌作用通常是在化合物的作用下，誘發(fā)腫瘤形成。早在1947年，Bernblum及Shubik的研究結(jié)果就證實(shí)，在小鼠皮膚表面局部涂抹化學(xué)致癌藥物，會使相應(yīng)部位皮膚形成乳頭狀腫瘤[Berenblum,I.andShubik,P.(1949)Thepersistenceoflatenttumourcellsinducedinthemouse'sskinbyasingleapplicationof9:10-dimethyl-1:2-benzanthracene.Br.J.Cancer,3,384-386.]。這種處理方法能夠縮短長期致癌實(shí)驗(yàn)的時(shí)間，涂抹過程中可以清楚觀察到腫瘤生長的動態(tài)，有助于了解致癌物在腫瘤發(fā)生與發(fā)展的不同階段，對腫瘤形成與發(fā)展的作用機(jī)制[Mueller,M.M.(2006)Inflammationinepithelialskintumours:oldstoriesandnewideas.Eur.J.Cancer,42,735-744.]?；瘜W(xué)致癌作用較常使用的化學(xué)致癌劑包括二甲基苯并蒽(7,12-dimethylbenzanthraene,DMBA)和三(2-吡啶甲基)胺(12-O-Tetradecanoyl-phorbol13-Acetate,TPA)。作為一種多環(huán)的芳香烴基類多潛能致癌物，DMBA經(jīng)皮膚吸收后進(jìn)入生物體內(nèi)，能誘發(fā)DNA的多位點(diǎn)突變，影響一系列癌基因和抑癌基因的表達(dá)，啟動細(xì)胞的癌變。在小鼠皮膚的局部涂抹TPA會造成氧化自由基的增加，導(dǎo)致氧化壓力上升及局部發(fā)炎的現(xiàn)象。TPA將造成細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)失衡，使腫瘤組織維持在發(fā)炎的微環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生癌變。在發(fā)炎反應(yīng)中，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)及其產(chǎn)物一氧化氮(NitrogenMonoxide,NO)的含量要高于正常組織，會導(dǎo)致DNA損傷、破壞錯誤復(fù)制DNA的修復(fù)能力，導(dǎo)致所表達(dá)的蛋白質(zhì)發(fā)生變化，使其喪失原有的功能與活性；NO具有促進(jìn)血管新生、白細(xì)胞的黏附、浸潤與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。已有許多研究證實(shí)，在不同慢性炎癥性疾病和惡性腫瘤組織中，都具有較高含量的NO。在細(xì)胞外，NO極不穩(wěn)定，幾秒鐘后便轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，通常都通過測定亞硝酸鹽的含量來檢測細(xì)胞內(nèi)NO的含量[Moncada,S.,Palmer,R.M.,andHiggs,E.A.(1991)Nitricoxide:physiology,pathophysiology,andpharmacology.Pharmacol.Rev.,43,109-142.]。環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase,COX-2)是由前列腺素合成，COX-2的合成受到腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactoralpha,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及表皮生長因子(Epidermalgrowthfactor,EGF)的誘發(fā)，在發(fā)炎反應(yīng)時(shí)期，COX-2的表達(dá)會增加血管通透性，提升白血球與免疫細(xì)胞的趨化性，擴(kuò)大發(fā)炎反應(yīng)的范圍[Tsujii,M.,Kawano,S.,Tsuji,S.,Sawaoka,H.,Hori,M.,andDuBois,R.N.(1998)Cyclooxygenaseregulatesangiogenesisinducedbycoloncancercells.Cell,93,705-716.]；另有研究指出，在DMBA和TPA處理之前，用iNOS與COX-2抑制劑預(yù)處理小鼠皮膚后，能夠明顯降低DMBA和TPA所誘發(fā)的腫瘤發(fā)生率與形成腫瘤的數(shù)量[Chun,K.S.,Cha,H.H.,Shin,J.W.,Na,H.K.,Park,K.K.,Chung,W.Y.,andSurh,Y.J.(2004)Nitricoxideinducesexpressionofcyclooxygenase-2inmouseskinthroughactivationofNF-kappaB.Carcinogenesis,25,445-454.]。所以，從發(fā)炎的誘導(dǎo)到發(fā)展成腫瘤的過程中，iNOS與COX-2都起著重要作用。皮膚乳頭狀瘤是由于表皮乳頭樣結(jié)構(gòu)的上皮組織增生后形成的。皮膚乳頭狀瘤的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年增高及年輕化的趨勢，由于該病誘發(fā)因素較多，病因復(fù)雜，確切發(fā)病機(jī)理仍不清楚。在臨床治療上，皮膚乳頭狀瘤具有容易惡變成為皮膚癌、手術(shù)治療后容易復(fù)發(fā)、多發(fā)性和產(chǎn)生組織破壞等特點(diǎn)。目前，國內(nèi)外關(guān)于皮膚乳頭狀瘤治療方面的研究報(bào)道相對較少，如何有效控制該病的發(fā)生，提高治療效果，防止腫瘤的復(fù)發(fā)和惡變，具有非常重要的意義。近年來，眾多的研究結(jié)果證實(shí)，部分從植物中提取的天然物質(zhì)，具有較強(qiáng)的預(yù)防腫瘤細(xì)胞生長的活性。多甲氧基黃酮屬于黃酮類化合物，在柑橘果皮中具有較高的含量。此類化合物的C6-C3-C6骨架上接有兩個以上的甲氧取代基，因極性較低而具有較好的生物可利用率?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，多甲氧基黃酮類物質(zhì)具有抗發(fā)炎的生物活性[MiddletonEJr,Kandaswami,C.,andTheoharides,T.C.(2000)Theeffectsofplantflavonoidsonmammaliancells:implicationsforinflammation,heartdisease,andcancer.Pharmacol.Rev.,52,673-751.Manthey,J.A.,Grohmann,K.,andGuthrie,N.(2001)Biologicalpropertiesofcitrusflavonoidspertainingtocancerandinflammation.Curr.Med.Chem.,8,135-153.]。許多研究證實(shí)，多甲氧基黃酮具有和未被甲基化黃酮相似的活性，如抗癌、抗病毒等，并且生物可利用率高于未被甲基化的黃酮[Nielsen,S.E.,Breinholt,V.,Cornett,C.,andDragsted,L.O.(2000)Biotransformationofthecitrusflavonetangeretininrats.Identificationofmetaboliteswithintactflavanenucleus.FoodChem.Toxicol.,38,739-746.]。本發(fā)明所使用的多甲氧基黃酮化合物為以下三種：5,7,3’,4’-四甲氧基黃酮(3’,4’,5,7-Tetramethoxyflavone,4-PMF)、5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黃酮(5,7,3’,4’,5’-pentamethoxyflavones,5-PMF)以及5,6,7,3’,4’,5’-六甲氧基黃酮(5,6,7,3’,4’,5’-Hexamethoxyflavone,6-PMF)，三者都屬于多甲氧基黃酮，而4-PMF為月橘(Murrayapaniculata)與黑姜(Kaempferiaparviflora)中主要的多甲氧基黃酮之一，這些植物的提取物已被證實(shí)具有抗發(fā)炎、抗腫瘤以及抗氧化等生物活性[Kinoshita,T.andShimada,M.(2002)IsolationandstructureelucidationofanewprenylcoumarinfromMurrayapaniculatavar.omphalocarpa(Rutaceae).Chem.Pharm.Bull.(Tokyo),50,118-120.Yenjai,C.,Prasanphen,K.,Daodee,S.,Wongpanich,V.,andKittakoop,P.(2004)BioactiveflavonoidsfromKaempferiaparviflora.Fitoterapia,75,89-92.]。本專利為多甲氧基黃酮在制備治療皮膚乳頭狀瘤上的應(yīng)用，達(dá)到治療皮膚乳頭狀瘤的目的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對大多皮膚乳狀瘤具有易惡變?yōu)槠つw癌、術(shù)后易復(fù)發(fā)、多發(fā)性生長并易產(chǎn)生組織破壞的特點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種多甲氧基黃酮在制備治療皮膚乳頭狀瘤的藥物上的應(yīng)用。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該類化合物對皮膚乳頭狀瘤具有明顯的作用效果。所述的多甲基黃酮包括所有C6-C3-C6骨架上接有兩個以上的甲氧取代基的黃酮，包括，4-PMF(結(jié)構(gòu)式見圖1)、5-PMF(結(jié)構(gòu)式見圖1)以及6-PMF(結(jié)構(gòu)式見圖1)?；瘜W(xué)試劑的配制：DMBA：準(zhǔn)確稱取1.2815mgDMBA，用200μL丙酮溶解后，配制成1μmol/mL的DMBA溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。TPA：準(zhǔn)確稱取5mgTPA，用200μL丙酮溶解后配制成100nmol/200μL的TPA貯備液，使用前用丙酮稀釋成5nmol/200μL。4-PMF、5-PMF、6-PMF：準(zhǔn)確稱取0.0342g4-PMF、0.0372g5-PMF、0.0402g6-PMF，分別用200μL丙酮溶解后，配制成100μmol/200μL的儲備液，使用前用丙酮稀釋成所需要的濃度。該多甲氧基黃酮的使用濃度為2.5-40μmol/L。本發(fā)明所述的多甲氧基黃酮對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7生長抑制作用的使用方法為：將細(xì)胞培養(yǎng)在含100U/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素、10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37℃，二氧化碳濃度為5％的條件下，當(dāng)細(xì)胞生長到8分滿時(shí)，分別在DMEM培養(yǎng)基加入終濃度為100ng/mL的脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)和終濃度為2.5-10μmol/L以丙酮溶解的多甲氧基黃酮，培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液，測定亞硝酸鹽含量。本發(fā)明所述的多甲氧基黃酮對化學(xué)誘導(dǎo)ICR小鼠皮膚乳頭狀瘤生長抑制作用的使用方法為：將ICR小鼠按6只/籠隨機(jī)分配至各個籠子，二籠為一組(即一組共有12只)，共分為誘導(dǎo)組，對照組、5μmol/200μL4-PMF處理組、5μmol/200μL5-PMF處理組和5μmol/200μL6-PMF處理組。適應(yīng)飼養(yǎng)一周后，用小型剃刀將ICR小鼠背部靠近尾巴部位剔除一塊面積約2cm2區(qū)域的毛發(fā)。在剔除毛發(fā)部位涂抹200μL濃度為1μmol/mL的DMBA，2天后再在相同部位涂抹200μL相同濃度的DMBA。經(jīng)過DMBA處理一星期后，在剔除毛發(fā)部位，誘導(dǎo)組持續(xù)每星期用5nmol/200μL濃度的TPA涂抹2次；對照組持續(xù)每星期用200μL的丙酮涂抹2次；4-PMF處理組持續(xù)每星期用200μL濃度為5μmol/200μL的4-PMF涂抹2次；5-PMF處理組持續(xù)每星期用200μL濃度為5μmol/200μL的5-PMF涂抹2次；6-PMF處理組持續(xù)每星期用200μL濃度為5μmol/200μL的6-PMF涂抹2次，在第2次DMBA處理后，所有組再持續(xù)處理20周。每周記錄直徑大于1mm并持續(xù)存在2星期以上的腫瘤數(shù)量，并測量腫瘤大小。20周后處死小鼠，統(tǒng)計(jì)腫瘤數(shù)量、腫瘤發(fā)生率(％)及腫瘤大小。本發(fā)明具有的有益效果：本發(fā)明中所選用的多甲氧基黃酮，均能夠從植物中提取分離，屬于植物天然化合物，來源廣泛，也能夠直接從試劑公司購買。與誘導(dǎo)組相比，分別以5mol/L濃度的4-PMF、5-PMF或6-PMF處理后，小鼠皮膚腫瘤數(shù)量分別減少24.2％、42.5％與54.2％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多甲氧基黃酮對皮膚乳頭狀瘤的治療效果顯著。本發(fā)明可指導(dǎo)開發(fā)新的皮膚乳頭狀瘤治療方法，為今后開發(fā)利用多甲氧基黃酮類化合物提供了新的方向和策略。附圖說明圖1為4-PMF、5-PMF和6-PMF的分子結(jié)構(gòu)。圖2為RAW264.7細(xì)胞用100ng/ml的LPS和不同濃度多甲氧基黃酮處理24h后培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的含量。圖3為不同組ICR小鼠背部皮膚中iNOS和COX-2的表達(dá)情況。圖4為不同組ICR小鼠背部皮膚中DNMT1和DNMT3b的表達(dá)情況。圖5為不同組ICR小鼠背部皮膚中GPR55的表達(dá)情況。圖6為不同組ICR小鼠背部皮膚中p38和p-p38的表達(dá)情況。圖7為不同組ICR小鼠背部皮膚中p-PI3K和p-Akt的表達(dá)情況。圖8為多甲氧基黃酮對DMBA/TPA誘導(dǎo)的ICR小鼠皮膚腫瘤數(shù)量的作用。圖9為不同組ICR小鼠皮膚腫瘤誘導(dǎo)百分率。圖10為多甲氧基黃酮對DMBA/TPA誘導(dǎo)的ICR小鼠皮膚腫瘤的抑制作用。具體實(shí)施方式實(shí)施例1多甲氧基黃酮對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7亞硝酸鹽含量的影響所培養(yǎng)的細(xì)胞為小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，含有終濃度為100U/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素、體積比為10％的胎牛血清，培養(yǎng)溫度為37℃，二氧化碳濃度為5％。將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長到8分滿后，分別在不同孔中加入終濃度為100ng/mL的脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)和終濃度為2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L的4-PMF、5-PMF或6-PMF，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，分別取100μL上述各處理的培養(yǎng)基上清液至96孔板中，每孔加入100μL格里斯試劑(含有1％磺胺和0.1％鹽酸萘乙二胺的水溶液)混合均勻后，在波長570nm下，用酶標(biāo)儀檢測吸光値。吸光值檢測結(jié)果如圖2所示，與誘導(dǎo)組相比，4-PMF處理組的NO含量減少3.39～16.42％，抑制效果與誘導(dǎo)組相比并無顯著性差異；在濃度2.5、5及10M時(shí)，5-PMF處理組有明顯抑制NO合成的效果，NO含量分別減少30.96％、40.38％與35.75％；濃度為2.5、5、10、20和40M的6-PMF對NO合成的抑制率分別為0.11％、24.60％、31.12％、45.38％與45.76％，呈現(xiàn)劑量依賴的現(xiàn)象，且與誘導(dǎo)組相比具有顯著性差異。從上述結(jié)果得知，多甲氧基黃酮具有抑制NO合成的能力，且隨著甲氧基數(shù)量的增加，其抑制現(xiàn)象愈明顯，以6-PMF抑制能力最佳。實(shí)施例2多甲氧基黃酮對DMBA/TPA誘導(dǎo)ICR小鼠皮膚乳頭狀瘤生長的影響實(shí)驗(yàn)用ICR小鼠購自樂斯科生物科技股份有限公司，按6只/籠隨機(jī)分配至各個籠子，二籠為一組(即一組共有12只)，共分為誘導(dǎo)組，對照組、5μmol/200μL4-PMF處理組、5μmol/200μL5-PMF處理組和5μmol/200μL6-PMF處理組。飼養(yǎng)環(huán)境保持25℃恒溫，每天光照12小時(shí)/黑暗12小時(shí)，墊料及飲用水每周更換2次。適應(yīng)飼養(yǎng)一周后，用刀片將ICR小鼠背部靠近尾巴部位剔除一塊面積約為2cm2的毛發(fā)。在剔除毛發(fā)部位涂抹200μL濃度為1μmol/mL的DMBA，2天后再在相同部位涂抹200μL相同濃度的DMBA。經(jīng)過DMBA處理一星期后，在剔除毛發(fā)部位，各組按如下處理方法連續(xù)處理20周：誘導(dǎo)組持續(xù)每星期用5nmol/200μL濃度的TPA涂抹2次；對照組持續(xù)每星期用200μL的丙酮涂抹2次；4-PMF處理組持續(xù)每星期用200μL濃度為5μmol/200μL的4-PMF涂抹2次，每次涂完4-PMF30分鐘后，在相同部位涂抹5nmol/200μL的TPA；5-PMF處理組持續(xù)每星期用200μL濃度為5μmol/200μL的5-PMF涂抹2次，每次涂完5-PMF30分鐘后，在相同部位涂抹5nmol/200μL的TPA；6-PMF處理組持續(xù)每星期用200μL濃度為5μmol/200μL的6-PMF涂抹2次，每次涂完6-PMF30分鐘后，在相同部位涂抹5nmol/200μL的TPA。實(shí)驗(yàn)全程使用標(biāo)準(zhǔn)可滅菌飼料與單蒸水供實(shí)驗(yàn)動物食用。每周記錄直徑大于1mm并持續(xù)存在2星期以上腫瘤的數(shù)量并測量腫瘤大小。20周后，在最后一次TPA處理24小時(shí)后處死小鼠，統(tǒng)計(jì)腫瘤數(shù)量、腫瘤發(fā)生率(％)及腫瘤大小(圖3、圖4、圖10)。外觀變化：持續(xù)處理TPA20周后，誘導(dǎo)組每只小鼠的背部都有乳頭狀瘤生成；對照組則沒有腫瘤發(fā)生；預(yù)處理PMFs的組別中，4-PMF、5-PMF與6-PMF處理組都有抑制腫瘤數(shù)量與大小的現(xiàn)象(圖3、圖4、圖10)。腫瘤生長情形：實(shí)驗(yàn)20周后，各組小鼠腫瘤數(shù)量與發(fā)生率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3、圖4。實(shí)驗(yàn)過程中誘導(dǎo)組小鼠持續(xù)涂抹TPA至第7周后，即開始有乳頭狀瘤的生成，到第20周后，每只小鼠只腫瘤數(shù)量平均為21顆，腫瘤發(fā)生率達(dá)百分之百；對照組則直到實(shí)驗(yàn)20周結(jié)束都沒有形成乳頭狀瘤，表明該實(shí)驗(yàn)的腫瘤誘導(dǎo)模式是成立的；4-PMFs組每只小鼠腫瘤數(shù)量平均為12.0顆，腫瘤發(fā)生率為92％；5-PMF組每只小鼠腫瘤數(shù)量平均為9.1顆，腫瘤發(fā)生率為83％；6-PMF組每只小鼠腫瘤數(shù)量平均為4.7顆，腫瘤發(fā)生率為100％。腫瘤數(shù)量與大小分布：誘導(dǎo)組ICR小鼠皮膚腫瘤大小為：1-3mm3的有7.8±3.8顆；3-5mm3的有3.0±1.1顆；≧5mm3的有10.3±6.9顆。4-PMF組腫瘤大小為1-3mm3的有6.4±2.4顆；3-5mm3的有2.2±2.2顆；≧5mm3的有3.5±3.8顆。5-PMF組腫瘤大小為1-3mm3的有5.4±4.3顆；3-5mm3的有0.8±1.0顆；≧5mm3的有2.9±3.3顆。6-PMF組腫瘤大小為1-3mm3的有2.1±2.0顆；3-5mm3的有0.8±1.0顆；≧5mm3的有1.8±2.0顆。從上述結(jié)果得知，用濃度為5μmol/L的4-PMF、5-PMF或6-PMF處理后，實(shí)驗(yàn)小鼠的腫瘤數(shù)量均明顯減少，與誘導(dǎo)組相比，分別減少24.2％、42.5％與54.2％。據(jù)此，我們推論，隨著PMFs甲氧基數(shù)量的增加，PMF抑制DMBA/TPA所導(dǎo)致的腫瘤數(shù)量、大小的效果愈明顯，并且達(dá)到統(tǒng)計(jì)上的顯著性，但對于腫瘤發(fā)生率卻無法改善，其原因可能是因?yàn)镻MFs無法抑制第一周DMBA誘導(dǎo)過程中的基因突變，隨后，涂抹TPA持續(xù)刺激皮膚組織，氧化壓力逐漸增加，最終無法抑制乳頭狀瘤的發(fā)生。實(shí)施例3多甲氧基黃酮對DMBA/TPA誘導(dǎo)ICR小鼠基因表達(dá)的影響按實(shí)施例2的方法處理小鼠，處死后，收集處理部位的皮膚。把皮膚組織剪成細(xì)小的碎片后，按照每20mg皮膚組織加入150-250μL裂解液(含150mmol/L的NaCl、1mmol/L的EDTA、1g/mL的亮抑酶肽、1g/mL的抑蛋白酶肽、1g/mL的胃蛋白酶抑制劑和1mmol/L的PMSF)的比例加入組織裂解液，用玻璃勻漿器勻漿至充分裂解后，10,000rpm離心5分鐘，取上清。以2mg/mLBSA溶液為濃度標(biāo)準(zhǔn)液，用酶標(biāo)儀測定595nm處的吸光值，換算樣本內(nèi)蛋白濃度。蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、結(jié)合一抗、二抗后，檢測目的蛋白GPR55、phospho-p38、phospho-PI3K、phospho-Akt、DNMT1、DNMT3b、iNOS和COX-2表達(dá)水平的變化。每個樣品重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并分析各組間的差異，當(dāng)p值小于0.05時(shí)即表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組與對照組相比，GPR55的蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯增加，表明GPR55參與TPA誘使小鼠皮膚產(chǎn)生病變的過程；多甲氧基黃酮預(yù)處理組中，以5-PMF組與6-PMF組的抑制現(xiàn)象最為顯明，其中5-PMF的抑制效果優(yōu)于6-PMF(圖5)。由此可知，多甲氧基黃酮可通過降低TPA引致皮膚中GPR55的作用，進(jìn)而達(dá)到減輕發(fā)炎等現(xiàn)象的產(chǎn)生。誘導(dǎo)組小鼠皮膚中的phospho-p38蛋白表達(dá)量顯著高于對照組，而4-PMF、5-PMF與6-PMF處理組中，TPA誘導(dǎo)phospho-p38的表達(dá)作用都受到了一定的抑制，其中5-PMF處理組的抑制活性最強(qiáng)(圖6)；此外，誘導(dǎo)組的phospho-PI3K和phospho-Akt表達(dá)水平與對照組相比均有明顯增加，4-PMF、5-PMF與6-PMF處理組的phospho-PI3K、phospho-Akt的表達(dá)水平與對照組相比顯著降低，其中又以5-PMF與6-PMF處理組的抑制作用最為明顯(圖7)；由圖8可知，誘導(dǎo)組的兩個重要的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶：DNMT1和DNMT3b都沒有被活化，而多甲氧基黃酮處理組的DNMT1和DNMT3b表達(dá)水平都有增加，5-PMF處理組對DNMT1的表達(dá)水平最高，6-PMF處理組的DNMT3b的表達(dá)水平最高。綜合上述兩項(xiàng)結(jié)果可以推測，多甲氧基黃酮可通過調(diào)控DNMT1和DNMT3b的表達(dá)來調(diào)節(jié)iNOS的轉(zhuǎn)錄活性。由此可知，PMFs抑制發(fā)炎因子的表達(dá)可能是通過調(diào)控phospho-p38MAPK途徑與PI3K/Akt途徑，以抑制NF-κB轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)并轉(zhuǎn)錄出下游iNOS和COX-2(圖9)，進(jìn)而達(dá)到抑制發(fā)炎反應(yīng)的效果。實(shí)施例4多甲氧基黃酮對ICR小鼠的生物毒性評價(jià)按實(shí)施例2的方法處理小鼠，處死小鼠后，稱量各組ICR小鼠的體重、肝、脾、腎重量，以心臟采血方式采集血液，室溫放置1h后，4℃3000rpm離心10min，收集血清，儲存于-80℃冰箱中。以全自動生化分析儀檢測肝功能生化指數(shù)：天門冬酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartateaminotransferase，AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanineaminotransferase，ALT)、三酸甘油脂(triglyceride，TG)及總膽固醇(totalcholesterol，T-cho)，檢測結(jié)果見表1。從檢測結(jié)果可以看出，兩組數(shù)據(jù)間不存在顯著性差異，多甲氧基黃酮對ICR小鼠沒有表現(xiàn)出生物毒性。表1多甲氧基黃酮對ICR小鼠的生物毒性評價(jià)組別肝臟/體重腎臟/體重脾臟/體重GOT(Unit/L)GPT(Unit/L)TG(mg/dl)T-cho(mg/dl)誘導(dǎo)組3.91±0.250.85±0.070.25±0.0393.4±9.723.2±4.8113.7±28.978.9±4.24-PMF處理組3.95±0.350.89±0.020.23±0.0493.6±7.224.1±4.9112.4±28.976.5±4.15-PMF處理組3.92±0.280.83±0.070.24±0.0393.1±8.122.5±3.6114.3±15.676.2±3.66-PMF處理組3.99±0.310.88±0.040.26±0.0594.1±6.324.9±5.2113.1±20.379.3±4.7當(dāng)前第1頁1 2 3