本發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域，特別是涉及一種馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液及其制備方法。

背景技術(shù)：

青光眼(Glaucoma)是以視神經(jīng)病變、視覺功能喪失為特點的眼部疾病。眼壓升高是青光眼的主要致盲因素，藥物治療是最主要的治療方法。目前青光眼的臨床用藥以滴眼劑為主，包括β-受體拮抗劑、前列腺素類似物、碳酸酐酶抑制劑、腎上腺素能受體激動劑、膽堿受體激動劑和視神經(jīng)保護藥物等。盡管歐美及其他國家越來越多地把前列腺素類似物，如：拉坦前列素、貝美前列素和曲伏前列素，列為臨床一線藥物，但由于價格高昂，會增加長期用藥患者的經(jīng)濟負擔，限制了其在我國作為青光眼臨床一線藥物的使用。目前，我國臨床治療青光眼的藥物仍以價格較低且療效明確的β-受體拮抗劑為主，馬來酸噻嗎洛爾則是其中使用最廣泛的臨床用藥。

馬來酸噻嗎洛爾是一種非選擇性的β-腎上腺素受體阻滯劑，無明顯內(nèi)源性交感活性和局部麻醉作用，對心肌無直接抑制作用。馬來酸噻嗎洛爾滴眼液是治療青光眼最常用的藥物之一，對高眼壓患者和正常人均有降眼內(nèi)壓作用，適用于原發(fā)性開角型青光眼、繼發(fā)性青光眼、高眼壓癥及部分原發(fā)性碧角性青光眼。對于采用其他藥物或手術(shù)治療無效的青光眼，也可應(yīng)用本品進行治療。

馬來酸噻嗎洛爾滴眼劑的降眼壓作用起效快，給藥后20～30分鐘眼壓即開始下降，經(jīng)1～2小時達到最大效應(yīng)，降眼壓作用可持續(xù)較長時間。但由于眨眼及淚液分泌的影響，普通滴眼液給藥后在眼部的保留時間短，吸收的藥量通常僅占給藥劑量的極小部分，用藥劑量通常較高，一般需要反復(fù)給藥，容易產(chǎn)生明顯的全身性副作用，如心動過緩、心率失常、支氣管痙攣等，且患者順應(yīng)性較差。此外，高眼壓尤其是青光眼患者，通常需要長期用藥，而目前市售的馬來酸滴眼液中，均有防腐劑。大量研究表明，長期使用含有防腐劑的眼用制劑不可避免地會給眼睛帶來刺激性和危害。

美國FDA批準了默沙東公司的一種眼用噻嗎洛爾即型凝膠(Timoptic-XE，gel formingsolution)，其凝膠機制為離子型敏感性潔冷膠，且該產(chǎn)品中含有新潔爾滅(0.012％)作為防腐劑。另一種由愛爾康公司生產(chǎn)的眼用噻嗎洛爾即型凝膠(Timolast，gel formingsolution)，其凝膠基質(zhì)為蛋白敏感性黃原膠，處方中也含有新潔爾滅(0.012％)做防腐劑。中國專利CN101342176A公開了一種馬來酸噻嗎洛爾眼用即型凝膠，其凝膠基質(zhì)選自甲基纖維素、乙基纖維素、聚乙二醇、聚丙烯酸及聚丙烯酸納中的一種或多種，處方中含有防腐劑。中國專利CN101474146A公開了一種不含抑菌劑的馬來酸噻嗎洛爾滴眼液及其制備方法，但專利為溶液型滴眼劑，未解決藥物在眼部保留時間短這一問題?？傊?，現(xiàn)有噻嗎洛爾眼用產(chǎn)品和已公開的文獻均未能同時解決馬來酸噻嗎洛爾滴眼劑在眼部保留時間短及長期使用帶來的刺激性問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明提供了一種馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液。該馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液可顯著增加馬來酸噻嗎洛爾的角膜滲透量，可顯著而平穩(wěn)地降低眼內(nèi)壓，延長藥物在眼部的保留時間，且不添加防腐劑，可有效地解決現(xiàn)有技術(shù)存在的馬來酸噻嗎洛爾滴眼劑在眼部保留時間短及長期使用帶來的刺激性問題。

具體技術(shù)方案如下：

一種馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液，主要由以下重量份的組分制備而成：

所述液晶材料為甘油單油酸酯；所述表面活性劑為泊洛沙姆；所述液晶材料與表面活性劑的質(zhì)量比為2-15:1。

在其中一些實施例中，所述馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液主要由以下重量份的組分制備而成：

在其中一些實施例中，所述馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液主要由以下重量份的組分制備而成：

在其中一些實施例中，所述馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液主要由以下重量份的組分制備而成：

在其中一些實施例中，所述馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液主要由以下重量份的組分制備而成：

在其中一些實施例中，所述液晶材料與所述表面活性劑的質(zhì)量比為8.5-9.5:1。

在其中一些實施例中，所述泊洛沙姆為泊洛沙姆188和/或泊洛沙姆407。

在其中一些實施例中，所述泊洛沙姆為泊洛沙姆407。

本發(fā)明還提供了上述馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液的制備方法。

具體技術(shù)方案如下：

一種上述的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液的制備方法，包括以下步驟：

將液晶材料和表面活性劑加熱至熔融，得油相混合物；

將馬來酸噻嗎洛爾溶解于水中，攪伴均勻，得水相混合物；

將水相混合物置于高剪切均質(zhì)機內(nèi)，將油相混合物緩慢加入水相混合物中，進行高剪切分散，將所得混合物再轉(zhuǎn)入高壓均質(zhì)機內(nèi)，進行高壓均質(zhì)，即得所述馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液。

在其中一些實施例中，所述高剪切分散的轉(zhuǎn)速為9000rpm～11000rpm，時間為2～4分鐘。

在其中一些實施例中，所述高壓均質(zhì)的壓力為450～550MPa，均質(zhì)次數(shù)為4～6次。

在其中一些實施例中，所述將液晶材料和表面活性劑加熱至熔融的加熱溫度為60℃～70℃。

本發(fā)明的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液及其制備方法具有以下優(yōu)點和有益效果：

本發(fā)明首次將馬來酸噻嗎洛爾與特定種類和特定比例的液晶材料和表面活性劑制備成立方液晶納米粒滴眼液。發(fā)明人通過大量實驗研究從大量液晶材料以及表面活性劑中篩選得到：以甘油單油酸酯為液晶材料，泊洛沙姆(尤其是泊洛沙姆407)為表面活性劑，制備的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒，可顯著增加馬來酸噻嗎洛爾的角膜滲透量，延長藥物在眼部的保留時間。本發(fā)明的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米?？蓪⑺苄缘鸟R來酸噻嗎洛爾包載于其封閉的水通道中，具有脂雙層結(jié)構(gòu)的載藥立方液晶納米粒與角膜親和，可增加馬來酸噻嗎洛爾的角膜透過量，延長馬來酸噻嗎洛爾在眼部的滯留時間，持續(xù)釋放藥物，降眼內(nèi)壓的作用更為顯著、且迅速而平穩(wěn)，減少用藥劑量和給藥次數(shù)，減少因用藥劑量過大可能帶來的一系列不良反應(yīng)，提高用藥順應(yīng)性。另一方面，馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒含有與外界相連的水通道，在黏附角膜的同時，可一定程度保持角膜表面水分，對角膜無損傷、無刺激，減輕眼部不適感，緩解多次滴眼后引起的眼干癥狀，提高用藥順應(yīng)性。

本發(fā)明所用材料生物相容性良好，由于立方液晶納米粒對馬來酸噻嗎洛爾的包封作用，可起到對馬來酸噻嗎洛爾的保護作用，可提高馬來酸噻嗎洛爾的穩(wěn)定性，因此本發(fā)明的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒中沒有添加任何防腐劑，同樣可保證馬來酸噻嗎洛爾的藥物穩(wěn)定性，有效解決現(xiàn)有馬來酸噻嗎洛爾滴眼劑在長期使用過程中防腐劑引起的刺激性問題，與已有的馬來酸噻嗎洛爾滴眼劑相比，具有明顯的臨床應(yīng)用優(yōu)勢。

本發(fā)明的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液還具有流動性好，使用方便，粒徑小且均勻性好，眼部異物感小等特點，尤其適用于眼部局部給藥。

本發(fā)明的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液的制備方法工藝簡單，包封率高，使制備得到的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒粒徑小，且分布均勻，生產(chǎn)成本較低，有利于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是實施例7的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液粒徑分布圖；

圖2是實施例7的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液偏光顯微鏡圖；

圖3是實施例7的空白立方液晶納米粒與馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液小角X射線散射結(jié)果圖；

圖4是實施例7的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液透射電鏡圖；

圖5是實施例8的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液與市售對照藥的累積滲透圖；

圖6是實施例9的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液細胞毒性實驗結(jié)果；

圖7是實施例10的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液與市售對照藥的單次給藥兔房水中噻嗎洛爾濃度與時間變化圖；

圖8是實施例11的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液與市售對照藥的連續(xù)給藥一周后新西蘭兔眼壓變化圖；

圖9是實施例11的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液與市售對照藥的連續(xù)給藥一周后新西蘭兔裂隙燈檢查眼表圖(A：生理鹽水、B：市售滴眼液、C：實施例4的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液)；

圖10是實施例11中的生理鹽水組角膜組織切片圖；

圖11是實施例11中的市售馬來酸噻嗎洛爾滴眼液組角膜組織切片圖；

圖12是實施例11中的實施例4的馬來酸噻嗎洛爾納米粒滴眼液組角膜組織切片圖。

具體實施方式

以下通過具體實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制。

實施例1：馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液的制備

本實施例的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液由以下原料制備而成：

本實施例的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液的制備方法包括以下步驟：

精密稱取甘油單油酸酯和泊洛沙姆407，在65℃水浴中加熱至熔融，得油相混合物；另精密稱取馬來酸噻嗎洛爾，溶于100g水中，攪伴均勻，得水相混合物；將水相混合物置于高剪切均質(zhì)機內(nèi)，將油相混合物緩慢加入水相混合物中，在10000rpm下高剪切分散3分鐘；然后將所得混合物轉(zhuǎn)入高壓均質(zhì)機內(nèi)，在500MPa下高壓均質(zhì)5次，即得。

實施例2：馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液的制備

本實施例的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液由以下原料制備而成：

制備方法同實施例1。

實施例3：馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液的制備

本實施例的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液由以下原料制備而成：

制備方法同實施例1。

實施例4：馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液的制備

本實施例的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液由以下原料制備而成：

制備方法同實施例1。

實施例5：馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液的制備

本實施例的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液由以下原料制備而成：

制備方法同實施例1。

實施例6：馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液的制備

本實施例的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液由以下原料制備而成：

制備方法同實施例1。

對比例1

本對比例的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液由以下原料制備而成：

制備方法同實施例1。

對比例2

本對比例的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液由以下原料制備而成：

制備方法同實施例1。

對比例3

本對比例的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液由以下原料制備而成：

制備方法同實施例1。

實施例7：馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液的制劑表征

將實施例1～6所制備的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液，稀釋一定倍數(shù)，用馬爾文粒度儀(Zeta-sizer Nano-ZS90，英國馬爾文公司)測定其粒徑大小、多分散系數(shù)(PDI)和Zeta電位，結(jié)果見表1。實施例4所制備的馬來酸立方液晶滴眼液粒徑分布圖如圖1所示。

取實施例1～6所制備的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液1mL，置于超濾離心管內(nèi)管中，4000rpm離心10分鐘，取濾液稀釋一定倍數(shù)，于紫外分光光度計296nm下測定吸光度，按標準曲線方程求得出游離藥物量，按公式1計算包封率(Encapsulation efficiency，EE)，結(jié)果見表1。

包封率(％)＝(W總藥-W游離藥)/W總藥×100％公式(1)

W總藥為制備納米粒滴眼液投入的馬來酸噻嗎洛爾總藥量，W游離藥為紫外測定所得濾液中馬來酸噻嗎洛爾的量。

表1實施例1-6制備的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液的

粒徑和包封率測定結(jié)果

表1結(jié)果表明：

(1)GMO(甘油單油酸酯)和泊洛沙姆407用量對馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液的包封率、粒徑有重要影響。GMO和泊洛沙姆407總用量較少時，包封率較低，油相不足以包封水相中的馬來酸噻嗎洛爾，導(dǎo)致有較多的藥物游離在水中；GMO和泊洛沙姆407總用量增加，包封率增加，但用量增加到一定程度，包封率基本保持恒定；GMO用量過高(對比例2)，粒徑明顯增加，滴眼液的穩(wěn)定性變差，放置過夜后，馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液分層；泊洛沙姆用量過少(對比例3)，粒徑顯著增加，穩(wěn)定性變差，放置2h后，立方液晶納米粒滴眼液分層。

(2)GMO和泊洛沙姆407的質(zhì)量比對馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液的粒徑分布有重要影響。GMO和泊洛沙姆407的質(zhì)量比為9:1時，粒徑較小，且PDI較小，粒徑分布均勻，包封較大。泊洛沙姆407與GMO的質(zhì)量比過大或過小，均會導(dǎo)致液晶結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，不利于包封水溶性的噻嗎洛爾，且形成的納米粒粒徑和PDI變大。

(3)表面活性劑的種類對馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液的粒徑和包封率有重要影響。采用聚氧乙烯蓖麻油作為表面活性劑(對比例1)，馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液的粒徑太大，且粒徑分布較寬，包封率降低。

將實施例4所制備的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液滴于載玻片上，于偏光顯微鏡(MP41，明美光電技術(shù)有限公司)下觀察，初步推斷晶相結(jié)構(gòu)。偏光顯微鏡圖如圖2所示。結(jié)果表明：在偏光顯微鏡下，可觀察得馬來酸噻嗎洛爾納米粒為暗視野，無雙折射現(xiàn)象，可初步推斷樣品為立方液晶結(jié)構(gòu)。

采用的高通量SAXS以成像板作為檢測器，聯(lián)機進行準直測量。儀器在50kV和40mA條件下的X射線發(fā)射器產(chǎn)生波長為0.1542nm的CuKα射線。將實施例4所制備的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液進行小角X射線散射實驗，判斷其晶相結(jié)構(gòu)。小角X射線散射圖如圖3所示。結(jié)果顯示：空白納米粒和馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒的液晶結(jié)構(gòu)均為：的Pn3m立方液晶結(jié)構(gòu)。從出峰位置可知，載藥前后的納米粒的q值無顯著偏移，表明實施例4制備的馬來酸噻嗎洛爾納米粒為立方液晶結(jié)構(gòu)。

采用透射電鏡對實施例4所制備的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液進行形態(tài)學觀察。以負染色法制備樣品，取一滴樣品液于封口膜上，將銅網(wǎng)置于液滴上，吸附2min，用濾紙吸走多余樣品液，再在另一膜上滴加2％磷鎢酸一滴，將吸附完樣品的銅網(wǎng)置于其上，用濾紙吸走多余的磷鎢酸，置于透射電子顯微鏡下觀察納米粒的粒徑和形態(tài)，拍照記錄。透射電鏡圖如圖4所示。結(jié)果表明：馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒的形態(tài)為類球性粒子，粒徑與粒度儀所測結(jié)果一致，平均粒徑在142nm左右。

實施例8：馬來酸噻嗎洛爾立方液晶滴眼液離體角膜滲透實驗

離體角膜擴散實驗以谷胱甘肽-碳酸氫鈉緩沖溶液(GBR)作為介質(zhì)，以模擬眼球房水的生理環(huán)境。GBR溶液是由兩部分溶液混合組成：溶液一為氯化鈉6.2g、氯化鉀0.358g、一水磷酸二氫鈉0.103g和碳酸氫鈉2.454g，溶于500mL水。溶液二為二水氯化鈣0.115g、五水氯化鎂0.159g、葡萄糖0.9g、氧化型谷胱甘肽0.092g，溶于500mL水。置于5℃冰箱中冷藏，臨用前將溶液一與溶液二等量混合，即得GBR溶液。

離體角膜擴散實驗以新西蘭兔離體角膜為滲透膜，離體角膜滲透實驗在處死動物后20min內(nèi)開始。將新鮮離體角膜固定夾于改進的Franz立式擴散池的兩個半池之間，上皮層面向供給池，內(nèi)皮層面向接收池。接收池內(nèi)裝有一個攪拌子，且加滿GBR溶液，供給池內(nèi)加入0.5mL樣品，并用封口膜封嚴。將擴散池置于34±0.5℃的恒溫磁力攪拌器中，分別于30、60、120、180、240、360min時從接收池中取滲透介質(zhì)樣品0.5mL，同時補加等溫度體積的GBR溶液，樣品經(jīng)0.22μm微孔濾膜，過濾取續(xù)濾液20μL進樣，進行高效液相色譜HPLC分析測定，計算樣品中馬來酸噻嗎洛爾的累積透過量。

實施例4所制備的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液與市售對照藥(馬來酸噻嗎洛爾滴眼液，中山大學附屬眼科醫(yī)院)的離體角膜累積滲透結(jié)果如圖5所示，從0.5h至4h的釋藥過程中，馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液的藥物累積滲透量均大于市售對照藥。當離體角膜滲透實驗達6h時，市售對照藥的噻嗎洛爾累積滲透量為159.5μg，馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒的藥物累積滲透量為542.3μg，為前者的3.5倍。因此，馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液相較于市售馬來酸噻嗎洛爾滴眼液，促馬來酸噻嗎洛爾角膜滲透的效果更為明顯，證明本發(fā)明的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液能顯著提高馬來酸噻嗎洛爾的角膜滲透率。

角膜水化值是體外實驗評價物質(zhì)對角膜刺激性的重要指標，角膜水化值通常為76％～83％，超過83％的水化值即可判定角膜受到一定程度的損傷。將新鮮分離的新西蘭兔角膜或體外滲透實驗暴露于擴散介質(zhì)的角膜區(qū)域剪下，稱重，記為Wa，70℃干燥12h后再稱重，記為Wb。角膜水化值可按以下公式計算得到：角膜水化值HL(％)＝(1–Wb/Wa)×100％。結(jié)果表明：市售對照藥組與實施例4所制備的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液制劑組的角膜水化值均小于83％，表明兩組制劑均對兔離體角膜無損傷。兩組制劑的角膜水化值如表2所示。

表2：角膜水化值

實施例9：馬來酸噻嗎洛爾立方液晶滴眼液細胞毒性實驗

按實施例4所述的處方工藝制備空白立方液晶納米粒溶液、馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液，經(jīng)0.22μm無菌濾膜過濾除菌。

取新西蘭兔，分離出完整角膜，用完全培養(yǎng)基(含1％雙抗，20％胎牛血清)培養(yǎng)兔角膜上皮細胞，待原代培養(yǎng)的兔角膜上皮細胞生長至孔面積80％后，制備兔角膜上皮細胞完全貼壁的96孔板，將孔分為3組：PBS組、低濃度載藥制劑組(馬來酸噻嗎洛爾的濃度為12.5μg.mL^-1)、高濃度載藥制劑組(馬來酸噻嗎洛爾的濃度為25μg.mL^-1)。用完全培養(yǎng)基配制加入設(shè)定濃度的樣品后，每孔加入200μL，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，然后將培養(yǎng)液吸干，加入含10％的MTT培養(yǎng)基溶液，放回37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取出培養(yǎng)24h后的96孔板，避光下條件下，吸干MTT培養(yǎng)基溶液，每孔加入100μL的DMSO，置于搖床上混勻5min。在酶標儀490nm和630nm測定吸光度。細胞毒性結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明：當載藥制劑組的給藥量為12.5和25μg.mL^-1時，兩者的兔角膜上皮細胞存活率分別為108.6％和105.5％，與空白對照組(空白立方液晶納米粒溶液)無顯著性差異，說明馬本發(fā)明的來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液對兔角膜上皮細胞無毒性。

實施例10：馬來酸噻嗎洛爾立方液晶滴眼液藥動學實驗

本實驗采用新西蘭兔為動物模型，將新西蘭兔完全隨機分為2組，市售馬來酸噻嗎洛爾滴眼液(中山大學附屬眼科醫(yī)院)組為對照組，實施例4制備的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒組滴眼液為實驗組。

對照組新西蘭兔眼結(jié)膜囊內(nèi)滴50μL市售馬來酸噻嗎洛爾滴眼液(按噻嗎洛爾計，為5.0mg.mL^-1)，實驗組滴50μL實施例4制備的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液(按噻嗎洛爾計，為5.0mg.mL^-1)，閉合雙眼，輕壓鼻淚管30s。滴眼后分別在15，30，60，120，240，360min用1mL胰島素針抽取100μL房水，置于離心管中。精密吸取100μL房水樣品于離心管中，加入6％高氯酸-甲醇溶液100μL，渦旋混合1min，于4000rpm離心10min，取上清液進行HPLC測定，記錄色譜圖，以峰面積-外標法計算房水樣品的藥物濃度。采用WinNonlin藥動學軟件以非房室模型法計算實驗藥動學參數(shù)。

單次給藥后，馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液組與市售馬來酸噻嗎洛爾滴眼液組的房水噻嗎洛爾濃度隨時間變化曲線如圖7所示，藥動學參數(shù)如表3所示。

表3：馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液與市售馬來酸噻嗎洛爾滴眼液單次給藥后兔房水藥動學參數(shù)

藥動學結(jié)果表明：單次給藥后，馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液組在360min內(nèi)均可在房水中檢測到噻嗎洛爾藥物濃度，360min內(nèi)噻嗎洛爾血藥濃度-曲線下面積(AUC)為123.9μg.mL-1.min，其達峰時間(tmax)為30min，稍晚于市售制劑組，峰濃度(Cmax)為1.4μg.mL-1，小于市售制劑組，但噻嗎洛爾的半衰期(tmax)為71.5min，為市售制劑組的2.2倍，平均滯留時間(MRT)為86.6min，為市售制劑的2.0倍。

盡管納米粒組360min內(nèi)的AUC僅稍高于市售制劑，但從半衰期t1/2和平均滯留時間MRT數(shù)據(jù)均可得出，本發(fā)明的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液可較顯著延長馬來酸噻嗎洛爾在眼前節(jié)和房水的滯留時間與代謝時間，且360min內(nèi)的藥物濃度波動較市售制劑的小。由此，可進一步推斷馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒在眼表的滯留時間較長，并較緩慢地釋放噻嗎洛爾，避免給藥后短時間內(nèi)藥物濃度大幅度升高，使眼內(nèi)壓較平緩地下降，減少眼壓波動而帶來的不適，且降壓效果持續(xù)時間更長。

實施例11：馬來酸噻嗎洛爾立方液晶滴眼液藥效學實驗

本實驗采用新西蘭兔為動物模型，在單次給藥藥動學實驗后，繼續(xù)將新西蘭兔飼養(yǎng)一周，待藥物代謝完全，并分別用眼底鏡對眼底，裂隙燈對眼表進行檢查，確保無任何眼疾，即可進行藥效學實驗。

采用0.3％復(fù)方卡波姆造模劑建立青光眼高眼壓模型：用丙美卡因滴眼液對新西蘭兔眼進行局部麻醉，用胰島素針抽取兔眼房水0.1mL，而后注射0.3％復(fù)方卡波姆造模劑0.1mL(取適量卡波姆940和地塞米松，用生理鹽水配制成含0.3％卡波姆和0.025％地塞米松的復(fù)方卡波姆溶液)。造模后每天滴加妥布霉素地塞米松滴眼液，以防止炎癥反應(yīng)和眼部感染。

建模后，將實驗動物完全隨機分為3組，每組各5只：生理鹽水組(陰性對照組)，每次50μL，每天給藥一次；市售馬來酸噻嗎洛爾滴眼液組(中山大學附屬眼科醫(yī)院，陽性對照組)，每次50μL(含噻嗎洛爾250μg)，按市售馬來酸噻嗎洛爾滴眼液的使用說明，每天給藥兩次；實施例4制備的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液組(實驗組)，每次50μL(含噻嗎洛爾250μg)，每天給藥一次。3組新西蘭兔給藥后均閉目，輕壓鼻淚管30s，持續(xù)給藥一周，每天測量眼壓一次，記錄眼壓數(shù)據(jù)。

連續(xù)給藥一周后新西蘭兔眼壓變化結(jié)果如圖8所示，結(jié)果表明：生理鹽水組在一周內(nèi)仍維持高眼壓，甚至繼續(xù)升高，而馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液組的兔眼壓則在給藥后第一天即下降，且具有持續(xù)降壓的趨勢。市售馬來酸噻嗎洛爾滴眼液的降眼壓效果弱于馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液組，且波動較大。在連續(xù)給藥一周左右，馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液組已降壓至接近正常眼壓范圍，降眼壓效果較市售制劑組明顯。

給藥后角膜裂隙燈檢查結(jié)果：連續(xù)給藥一周后對兔眼進行裂隙燈檢查，結(jié)果如圖9所示，結(jié)果表明：生理鹽水組、馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液組、市售馬來酸噻嗎洛爾滴眼液組新西蘭兔眼在給藥一周后，角膜經(jīng)裂隙燈-鈷藍光檢查，均未發(fā)現(xiàn)黃綠色斑塊，說明均無明顯角膜損傷。

給藥后角膜病理學檢查：連續(xù)給藥一周后，對3組新西蘭兔以耳緣靜脈注射過量20％烏拉坦溶液致死，摘取眼球，立刻放到Davidson溶液中，浸泡24小時后，取出眼球置于4％多聚甲醛溶液中固定完全后，分離角膜得組織標本。標本經(jīng)自動脫水機脫水，包埋，石蠟切片，厚度約3μm，60℃烘箱過夜，用透明劑脫蠟，經(jīng)梯度酒精水化，蘇木素-伊紅染色，梯度酒精脫水，透明劑透明，中性樹膠封片。用LEICA DM5000B普通光學顯微鏡觀察。病理分級評判參考表如表4所示：

表4：組織病理病變分級標準

給藥后角膜病理學檢查結(jié)果如圖10、圖11、圖12所示，結(jié)果表明：

3組的角膜上皮細胞排列整齊，前彈力層，基質(zhì)層，厚彈力層，內(nèi)皮細胞層清晰可見，未見異常改變。由此說明本發(fā)明的馬來酸噻嗎洛爾立方液晶納米粒滴眼液在給藥一周后未對角膜造成損傷，生物相容性、安全性良好。

以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當認為是本說明書記載的范圍。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。