本發(fā)明涉及鉑納米晶材料制備領(lǐng)域，具體涉及一種鉑納米晶復(fù)合納米材料的制備方法及產(chǎn)品。

背景技術(shù)：

目前，盡管國(guó)內(nèi)外醫(yī)療水平不斷提高，但惡性腫瘤仍嚴(yán)重威脅人類的生命安全。世界衛(wèi)生組織(WHO)等權(quán)威機(jī)構(gòu)已發(fā)布統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，在肝、肺、食道和胃等多種惡性腫瘤中，中國(guó)新增病例和死亡人數(shù)均居世界首位。

自1978年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)以來(lái)，順鉑廣泛應(yīng)用于頭頸癌、卵巢癌、睪丸癌、膀胱癌、肺癌及結(jié)腸直腸癌等多種腫瘤的治療。由于細(xì)胞內(nèi)的氯離子濃度較低，順鉑進(jìn)入細(xì)胞后，其配體氯會(huì)被水分子取代，形成的正電鉑離子能夠與細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA和蛋白質(zhì)等親核分子作用。其中，DNA為順鉑的主要作用靶點(diǎn)，順鉑多與DNA中的嘌呤堿基的N7位點(diǎn)結(jié)合，形成Pt-DNA加合物。

但是，普遍耐藥以及嚴(yán)重的毒副作用限制了順鉑在臨床治療的持續(xù)應(yīng)用。臨床中很多病人存在先天或者獲得性順鉑耐藥性。癌癥病人在給予順鉑之后，腫瘤細(xì)胞會(huì)從各個(gè)通路抵御順鉑的作用，導(dǎo)致獲得性耐藥，如：1)通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，使順鉑分子入胞量減少；2)增大細(xì)胞漿內(nèi)含硫蛋白的解毒效應(yīng)；3)DNA修復(fù)加快；4)提高細(xì)胞對(duì)DNA損傷的耐受性等。另外，順鉑會(huì)導(dǎo)致包括腎小管損傷在內(nèi)的較為嚴(yán)重的腎毒性、胃腸道毒性、血液毒性和耳毒性等。而且病人體內(nèi)順鉑的累積也是潛在的危險(xiǎn)因素。

而近些年來(lái)，第二代、第三代鉑類藥物層出不窮，如卡鉑、奧沙利鉑、沙伯以及吡鉑等，雖然有一些改進(jìn)，但至今沒(méi)有任何一種鉑類藥物能取代順鉑。因此，許多的研究人員致力于研究新型的鉑類復(fù)合材料來(lái)解決順鉑相關(guān)的一系列問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鉑納米晶復(fù)合納米材料的制備方法及產(chǎn)品，所得到的鉑納米晶復(fù)合納米材料具備良好的抗腫瘤活性，不僅可以克服腫瘤耐藥，而且對(duì)正常組織有良好的生物安全性。

本發(fā)明所提供的技術(shù)方案為：

一種鉑納米晶復(fù)合納米材料的制備方法，包括如下步驟：

1)將乙酰丙酮鉑溶解在油胺和油酸中，真空條件下在50～100℃下攪拌；升溫至150～250℃，繼續(xù)注入三乙基硼氫化鋰，反應(yīng)1～60分鐘，不良溶劑沉淀，得到小尺寸鉑納米晶；

2)將步驟1)中得到的小尺寸鉑納米晶采用薄膜分散法或乳化溶劑揮發(fā)法，進(jìn)行兩親性高分子的組裝修飾，得到鉑納米晶復(fù)合納米材料。

上述技術(shù)方案中，步驟1)中所得的小尺寸鉑納米晶的粒徑為1～10nm，經(jīng)過(guò)步驟2)后得到的鉑納米晶復(fù)合納米材料的粒徑為1～600nm。小尺寸鉑納米晶與鉑納米晶復(fù)合納米材料所屬的粒徑范圍，便于應(yīng)用于腫瘤治療。

鉑納米晶復(fù)合納米材料借助小尺寸鉑納米晶、功能性高分子以及腫瘤組織固有的特征微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA的大規(guī)模殺傷，進(jìn)而高效殺傷腫瘤細(xì)胞。首先，功能性高分子以及高通透性和滯留效應(yīng)(EPR效應(yīng))可以實(shí)現(xiàn)腫瘤組織靶向。入胞后，刺激介導(dǎo)納米材料解體為很多個(gè)小尺寸鉑納米晶，其極大的比表面積顯著加快鉑離子溢出速率；其次，腫瘤微酸環(huán)境以及內(nèi)涵體的較大酸度會(huì)進(jìn)一步促使鉑納米晶表面溶解腐蝕，釋放出大量鉑離子，擴(kuò)散至細(xì)胞核內(nèi)破壞DNA，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。利用功能性高分子靶向傳遞和微環(huán)境響應(yīng)性解體伴隨pH調(diào)控鉑離子釋放，聯(lián)合使用多種策略，不僅增強(qiáng)對(duì)腫瘤的殺傷，同時(shí)也降低對(duì)正常組織的毒副作用。

所述兩親性高分子可以選用功能性高分子，具體優(yōu)選為市售的兩親性高分子或合成的高分子聚合物(如刺激響應(yīng)的高分子聚合物或連接腫瘤靶向分子的高分子聚合物)。

所述市售兩親性高分子選自泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、吐溫、維生素E聚乙二醇琥珀酸酯、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚乳酸、司盤、磷脂、聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、白蛋白、脂蛋白、蓖麻油聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯酯、脂肪酸聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚和多元醇酯中的一種或多種。

所述刺激響應(yīng)的高分子聚合物選自腫瘤pH響應(yīng)的高分子聚合物、腫瘤ROS響應(yīng)的高分子聚合物、腫瘤酶響應(yīng)的高分子聚合物、光響應(yīng)的高分子聚合物、熱響應(yīng)的高分子聚合物、磁響應(yīng)的高分子聚合物和超聲響應(yīng)的高分子聚合物中的一種或多種。

所述腫瘤pH響應(yīng)的高分子聚合物選自通過(guò)物理吸附或化學(xué)合成內(nèi)含咪唑、哌啶、原酸酯鍵、馬來(lái)酸二甲酯鍵、肟鍵、縮醛/縮酮鍵、腙鍵、酰胺或酰腙鍵的一種或多種的親水-疏水嵌段高分子聚合物。

所述腫瘤ROS響應(yīng)的高分子聚合物選自通過(guò)物理吸附或化學(xué)合成內(nèi)含二硒鍵、琥珀酰亞胺-硫醚鍵、二硫鍵的一種或多種的親水-疏水嵌段高分子聚合物。

所述腫瘤酶響應(yīng)的高分子聚合物選自通過(guò)物理吸附或化學(xué)合成內(nèi)含對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶、前列腺特異性抗原、組織蛋白酶B、分泌型磷脂酶A2、α-淀粉酶、賴氨酰基氧化酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、成纖維細(xì)胞活化蛋白敏感的一種或多種的親水-疏水嵌段高分子聚合物。

所述連接腫瘤靶向分子選自葉酸、透明質(zhì)酸、蛋白、多肽、抗體、核酸適配體、DNA和RNA中的一種或多種。

作為優(yōu)選，所述步驟1)中真空條件下在50～100℃下攪拌0.5～2h。

作為優(yōu)選，所述步驟1)中乙酰丙酮鉑、油胺、油酸和三乙基硼氫化鋰的投料比為20～200mg:2～20ml:0.01～0.5ml:0.05～1ml。

作為優(yōu)選，所述步驟2)中的薄膜分散法的制備過(guò)程：將小尺寸鉑納米晶分散在良溶劑中，室溫下攪拌并加入兩親性高分子，減壓蒸發(fā)，水化，得到鉑納米晶復(fù)合納米材料。所述水化時(shí)優(yōu)選使用pH緩沖液，進(jìn)一步優(yōu)選為PBS緩沖液。

作為優(yōu)選，所述步驟2)中的乳化溶劑揮發(fā)法的制備過(guò)程：將小尺寸鉑納米晶分散在良溶劑中，室溫下攪拌并加入到兩親性高分子水溶液中，超聲，減壓蒸發(fā)，得到鉑納米晶復(fù)合納米材料。

作為優(yōu)選，所述步驟2)中小尺寸鉑納米晶與兩親性高分子的質(zhì)量投料比為1:1～50。通過(guò)調(diào)控二者之間的質(zhì)量投料比，一方面，實(shí)現(xiàn)對(duì)刺激的靈敏響應(yīng)，即于腫瘤部位實(shí)現(xiàn)刺激介導(dǎo)的分解組裝；另一方面，控制鉑納米晶復(fù)合納米材料中裝載的小尺寸鉑納米晶數(shù)量。

作為優(yōu)選，所述兩親性高分子選自泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、吐溫、維生素E聚乙二醇琥珀酸酯和聚乳酸-羥基乙酸共聚物中的一種或幾種。

作為優(yōu)選，所述兩親性高分子為通過(guò)物理吸附或化學(xué)合成的刺激響應(yīng)的高分子聚合物，或者通過(guò)物理吸附或化學(xué)合成連接腫瘤靶向分子的高分子聚合物。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述兩親性高分子選自泊洛沙姆-葉酸復(fù)合高分子、硬脂胺-聚(天冬氨酸-咪唑)高分子、脫氧膽酸-SS-透明質(zhì)酸高分子或疏水陽(yáng)離子穿透肽-MMP2敏感肽-聚乙二醇高分子。

作為優(yōu)選，所述步驟1)中不良溶劑選自丙酮、乙醇、乙酸乙酯、甲醇、甲基吡咯烷酮、中鏈醇、乙腈、二甲基甲酰胺和二甲基亞砜中的一種或多種。

作為優(yōu)選，所述步驟2)中良溶劑選自二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、環(huán)己烷和二氧六環(huán)中的一種或多種。

本發(fā)明還提供一種上述的制備方法得到的鉑納米晶復(fù)合納米材料。

同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

(1)首先通過(guò)合成小尺寸鉑納米晶，由于其表面的鉑離子溢出速率可由pH調(diào)控。在中性環(huán)境中，鉑納米晶表面鉑離子溢出速率很慢；而偏酸環(huán)境會(huì)加速表面腐蝕釋放大量鉑離子。在腫瘤治療中，腫瘤微酸環(huán)境以及內(nèi)涵體的較大酸度會(huì)促使鉑納米晶表面溶解腐蝕，釋放出大量鉑離子，擴(kuò)散至細(xì)胞核內(nèi)破壞DNA，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡；而到達(dá)正常組織的鉑納米晶因釋放鉑離子少，毒性很低。

(2)鉑納米晶復(fù)合納米材料使用功能性高分子對(duì)小尺寸鉑納米晶進(jìn)行組裝修飾。借助功能性高分子以及高通透性和滯留效應(yīng)(EPR效應(yīng))實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向，進(jìn)而高效殺傷腫瘤細(xì)胞。

(3)鉑納米晶復(fù)合納米材料不僅可以克服腫瘤耐藥，而且對(duì)正常組織有良好的生物安全性。

(4)本發(fā)明涉及反應(yīng)體系溫和，條件可控，具有良好的臨床轉(zhuǎn)化可能性。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中的小尺寸鉑納米晶的X射線衍射圖；

圖2為實(shí)施例1中的小尺寸鉑納米晶的透射電子顯微鏡照片；

圖3為實(shí)施例3中的鉑納米晶復(fù)合納米材料的動(dòng)態(tài)光散射粒度分布圖；

圖4為實(shí)施例4中的pH敏感鉑納米晶復(fù)合材料在pH7.4和pH5.5的透射電子顯微鏡照片；

圖5為鉑納米晶復(fù)合材料在不同pH下對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性；

圖6為靜脈注射鉑納米晶復(fù)合材料的平均血藥濃度-時(shí)間曲線。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

室溫溫度范圍為20-25℃。

下面結(jié)合具體的實(shí)施例和說(shuō)明書附圖詳細(xì)闡述本發(fā)明小尺寸鉑納米晶和鉑納米晶復(fù)合納米材料的制備及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。

實(shí)施例1

小尺寸鉑納米晶的合成：將80mg乙酰丙酮鉑與7ml油胺，0.09ml油酸，真空條件下在70℃攪拌1小時(shí)，以5℃/min的速度升至170℃；將0.2ml三乙基硼氫化鋰注射到反應(yīng)體系中，老化5分鐘，丙酮沉淀，離心得到小尺寸鉑納米晶。

對(duì)得到的小尺寸鉑納米晶進(jìn)行X射線衍射分析，結(jié)果如附圖1所示；對(duì)小尺寸鉑納米晶用透射電鏡進(jìn)行形貌表征，結(jié)果如附圖2所示，粒徑在2～4nm。

實(shí)施例2

小尺寸鉑納米晶的合成：將80mg乙酰丙酮鉑與5ml油胺，0.05ml油酸，真空條件下在70℃攪拌2小時(shí)，以5℃/min的速度升至170℃；將0.2ml三乙基硼氫化鋰注射到反應(yīng)體系中，老化30分鐘，丙酮沉淀，離心得到鉑納米晶。得到的鉑納米粒尺寸在4～6nm。

實(shí)施例3

鉑納米晶復(fù)合納米材料的制備：將1.2mg小尺寸鉑納米晶(按照本實(shí)施例2方法制得)和20mg泊洛沙姆P188分散在氯仿中，室溫?cái)嚢?h，減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑。加入3ml PBS(pH 7.4)水化，即得鉑納米晶復(fù)合納米材料。

利用動(dòng)態(tài)光散射分析得到的鉑納米晶復(fù)合納米材料的粒度分布，結(jié)果如附圖3所示。

實(shí)施例4

pH敏感鉑納米晶復(fù)合材料的制備：將1.2mg小尺寸鉑納米晶(按照本實(shí)施例1方法制得)和20mg泊洛沙姆-葉酸復(fù)合高分子(F127-FA)分散在氯仿中，邊攪拌邊加入15mg硬脂胺-聚(天冬氨酸-咪唑)的甲醇溶液(氯仿：甲醇＝10：1，v/v)，室溫?cái)嚢?h，減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑。加入3ml PBS(pH7.4)水化，得腫瘤pH敏感的鉑納米晶復(fù)合納米材料。

使用透射電鏡對(duì)得到的pH敏感的鉑納米晶復(fù)合材料在pH 7.4和pH 5.5進(jìn)行形貌表征，結(jié)果如附圖4所示。結(jié)果顯示，該種鉑納米晶復(fù)合材料有良好的pH響應(yīng)性。

實(shí)施例5

鉑納米晶復(fù)合納米材料的制備：將1.2mg小尺寸鉑納米晶(按照本實(shí)施例2方法制得)和20mg疏水脫氧膽酸-SS-透明質(zhì)酸(HA-SS-DOCA)分散在氯仿中，室溫?cái)嚢?h，減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑。加入3ml PBS(pH 7.4)水化，即得腫瘤ROX敏感的鉑納米晶復(fù)合納米材料。

實(shí)施例6

鉑納米晶復(fù)合納米材料的制備：將1.2mg小尺寸鉑納米晶(按照本實(shí)施例2方法制得)分散在氯仿中，滴入20mg疏水陽(yáng)離子穿透肽-MMP2敏感肽-聚乙二醇(PepFect14-GPLGIAGQ-PEG)的水溶液中，探頭超聲(3分鐘，150W)，即得腫瘤酶敏感的鉑納米晶復(fù)合納米材料。

實(shí)施例7

鉑納米晶復(fù)合納米材料的制備：將1.2mg小尺寸鉑納米晶(按照本實(shí)施例1方法制得)分散在氯仿中，滴入20mg維生素E聚乙二醇琥珀酸酯的水溶液中，探頭超聲(3分鐘，150W)形成均勻乳液。減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，即得鉑納米晶復(fù)合納米材料。

性能實(shí)驗(yàn)

一、鉑納米晶復(fù)合材料對(duì)人源腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒性

1、材料：腫瘤細(xì)胞株(肝癌HCCLM3)；

2、方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人源腫瘤細(xì)胞，用新鮮的培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)至1×10⁴cells/ml，接種于96孔扳內(nèi)，200μl/well，于37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)12-24h后換成含有鉑納米晶復(fù)合材料(按照本實(shí)施例4方法制得)的新鮮培養(yǎng)液。細(xì)胞加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24h，吸出培養(yǎng)液并用200μl PBS洗。然后向96孔扳內(nèi)加入MTT溶液(200μl/well)，于37℃下共同孵育1～4h，吸出培養(yǎng)液，加入200μl DMSO，震蕩搖勻后，測(cè)定其光密度OD值。

數(shù)據(jù)處理，利用酶標(biāo)儀相應(yīng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算每一種樣品3～5個(gè)孔OD值的平均值，利用平均值按如下公式計(jì)算細(xì)胞成活率(Cell Viability％)。

細(xì)胞成活率％＝樣品組OD值的平均值/空白對(duì)照組OD值的平均值×100％(Cell Viability％＝OD_sample/OD_control×100％)

結(jié)果見實(shí)施例附圖5。

二、鉑納米晶復(fù)合材料在老鼠動(dòng)物體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

1、材料和方法

1.1、藥品和試劑：鉑納米晶復(fù)合材料(按照本實(shí)施例3方法制得)，規(guī)格10ml：3mg，自制；氯仿、甲醇、乙醇，分析級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水，重蒸餾水。

1.2、動(dòng)物：balb/c小鼠，體重(20±3)g，6只，雄性，由浙江大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2、給藥方案與樣品采集：

balb/c雄性小鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12小時(shí)，按2mg/kg劑量于尾靜脈注射鉑納米復(fù)合材料，給藥后于0.0833，0.1667，0.25，0.5，0.75，1，2，4，6，8，12h，眼眶取血約0.1ml全血置于肝素化試管中，待測(cè)。

3、全血樣品處理及分析：

精密吸取全血樣品50μl，加入5ml 70％硝酸。室溫溶解24h后，熱臺(tái)揮去濃硝酸，用2％稀硝酸稀釋至5ml，于ICP-MS定量分析。靜脈注射鉑納米復(fù)合材料的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見附圖6。

以上所述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改，補(bǔ)充和等同替換等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。