本發(fā)明屬于藥物制劑領域和基因疫苗載體給藥領域，具體涉及一種樹突細胞靶向的pH響應型DNA疫苗遞送系統(tǒng)及制備方法。

背景技術：

疫苗是預防和治療癌癥、丙型肝炎、艾滋病、流感等疾病的有效方法。而DNA疫苗相比于傳統(tǒng)疫苗，具有穩(wěn)定、易于修飾與制備、安全性、能形成長期體液免疫和細胞免疫等方面的優(yōu)勢，而成為疫苗發(fā)展的新方向。然而，DNA疫苗的遞送過程存在酶解、低吸收、轉染效率低、抗原遞呈不足等方面的風險。因此，選擇合適的DNA疫苗遞送載體對于發(fā)展至關重要。

首先，將DNA疫苗靶向遞送至抗原遞呈細胞，如巨噬細胞和樹突細胞能顯著提高攝取與遞呈效率。CN 104771764A公布了一種巨噬細胞靶向載體系統(tǒng)，通過甘露糖修飾載體靶向抗原遞呈細胞表面過量表達的甘露糖受體。然后，DNA疫苗進入內涵體-溶酶體系統(tǒng)，突破溶酶體進入細胞質是DNA疫苗所編碼抗原表達的必要步驟。電荷反轉材料能響應環(huán)境pH的變化，通過化學鍵的斷裂改變自身電性，pH響應型釋放DNA。最后，帶正電荷的DNA載體材料通過質子海綿效應突破溶酶體到達細胞質，使DNA進入細胞核進行表達。具有仿病毒結構的兩親性樹狀脂肽其兼具非病毒載體的安全性和病毒載體的高轉染效率。高轉染效率有助于表達足量抗原，觸發(fā)后續(xù)的主要組織相容性復合物I介導的細胞免疫和主要組織相容性復合物II介導的體液免疫。

雖然靶向性材料、電荷反轉材料、DNA載體材料能分別發(fā)揮其作用，但是要將它們有機地結合起來并根據遞送過程中的環(huán)境變化發(fā)揮程序化轉染的作用仍然需要借助層層自組裝的技術。層層自組裝是利用靜電作用將帶正電荷和帶負電荷的聚合物依次沉積于內核表面。通過調整聚合物的濃度與用量避免聚沉而形成穩(wěn)定的納米粒。層層自組裝技術是一種成熟的技術，已被廣泛地應用于藥物、蛋白、基因遞送系統(tǒng)的構建中。

技術實現(xiàn)要素：

針對以上問題，本發(fā)明的目的是通過層層自組裝構建一種樹突細胞靶向的pH響應型DNA疫苗遞送系統(tǒng)，降低細胞毒性，提高轉染效率，進而增強后續(xù)的免疫反應。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的方案如下：

一種樹突細胞靶向的pH響應型DNA疫苗遞送系統(tǒng)，包括DNA載體材料DSPE-G2、電荷反轉材料PAH-Cit和靶向性材料MCS，其特征在于，由兩親性的樹狀脂肽DSPE-G2壓縮DNA形成的正電性納米粒作為層層自組裝的內核，在其表面覆蓋陰離子聚電解質PAH-Cit作為電荷反轉層，再在其表面覆蓋陽離子聚電解質MCS作為外層靶向樹突細胞。從而形成粒徑為256.8±10.7nm、分散系數(shù)為0.104、表面電位為25.1±2.3mV的四元復合物納米粒。

所述的DSPE-G2的結構為：

所述的電荷反轉層PAH-Cit在酸性條件下酯鍵斷裂，脫去檸康酰支鏈，形成陽離子聚電解質聚丙烯胺。

所述的外層MCS具有靶向樹突細胞表面甘露糖受體功能，進而促進受體介導的內吞作用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的制備方法如下：

a、DNA載體的制備：將2mg DSPE-G2溶于100μL氯仿/甲醇(v/v＝4∶1)中，注入1mL快速攪拌中的HEPES緩沖液(10mM，pH 7.4)中，持續(xù)攪拌6h除去有機溶劑。

b、二元復合物的制備：將pDNA溶于HEPES緩沖液(10mM，pH 7.4)中，調整濃度為0.2mg/mL。將pDNA溶液與濃度為0.1-2mg/mL的DSPE-G2溶液等體積混合，渦旋1min，室溫孵化20min。

c、三元復合物的制備：將PAH-Cit溶于HEPES緩沖液(10mM，pH 7.4)中，調整濃度為1mg/mL、2mg/mL。取50-200μL PAH-Cit溶液與100μL二元復合物溶液混合，室溫孵化30min。

d、四元復合物的制備：將MCS溶于1％(v/v)醋酸溶液，靜置過夜，用1M NaOH調節(jié)pH＝5.5，過0.8μm濾膜，調整濃度為0.5mg/mL。取150-300μL三元復合物溶液逐滴加入300μL攪拌中的MCS溶液，持續(xù)攪拌30min。

在上述制備過程中，不同濃度DSPE-G2與pDNA復合的N/P比為1-20，優(yōu)選的N/P比為20。

在上述制備過程中，PAH-Cit與二元復合物需按照DSPE-G2與PAH-Cit的濃度比為1∶1，質量比為1∶1的比例混合。

在上述制備過程中，MCS與三元復合物需按照PAH-Cit與MCS的濃度比為4∶1，質量比為2∶3的比例混合。

本發(fā)明制備的DNA疫苗遞送系統(tǒng)可用于靶向遞送DNA疫苗到樹突細胞，實現(xiàn)程序化轉染。

相比于現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

1、由于外層殼聚糖衍生物甘露糖配體的引入，該DNA疫苗遞送系統(tǒng)具有很好的樹突細胞靶向性。

2、該DNA疫苗遞送系統(tǒng)具有pH響應，經樹突細胞攝取進入內涵體-溶酶體系統(tǒng)后，電荷反轉層在酸性環(huán)境刺激下電性由負變正，快速釋放含DNA的內核。

3、具有仿病毒結構的DNA載體材料DSPE-G2能有效壓縮DNA，而且能顯著提高DNA的轉染效率，表達足量的抗原，促進機體產生免疫反應。

4、本發(fā)明所用的材料都具有良好的生物相容性和生物可降解性，細胞毒性小，安全性高。

5、本發(fā)明制備方法簡單，反應條件溫和可控，具有廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1二元復合物的凝膠阻滯電泳圖

圖2二元復合物隨N/P比的粒徑、電位變化圖

圖3四元復合物的透射電鏡圖

圖4 DSPE-G2的細胞毒性評價

圖5 DNA疫苗遞送系統(tǒng)的細胞毒性評價

圖6 DNA疫苗遞送系統(tǒng)的熒光顯微鏡觀察體外轉染圖

具體實施方式

下面具體實施例是對本發(fā)明的進一步說明，但下述僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。

實施例1：DNA載體的制備

將2mg DSPE-G2溶于100μL氯仿/甲醇(v/v＝4∶1)中，注入1mL快速攪拌中的HEPES緩沖液(10mM，pH 7.4)中，持續(xù)攪拌6h除去有機溶劑。

用激光粒度分析儀測定DSPE-G2納米粒的粒徑分布與表面電位。結果表明，DSPE-G2納米粒的粒徑為296.3±19.6nm，分散系數(shù)為0.269，表面電位為31.5±6.1mV。

實施例2：二元復合物的制備

將pDNA溶于HEPES緩沖液(10mM，pH 7.4)中，調整濃度為0.2mg/mL。用HEPES緩沖液(10mM，pH 7.4)調節(jié)DSPE-G2溶液濃度為0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、1、1.5、2mg/mL。將不同濃度的DSPE-G2溶液與pDNA溶液等體積混合，對應N/P比為1、2、4、5、6、10、15、20，渦旋1min，室溫孵化20min。

對二元復合物進行凝膠阻滯實驗，檢驗DSPE-G2對pDNA的壓縮能力。取10μL二元復合物溶液與上樣緩沖液混合，加入含Goldview核酸染料的1％瓊脂糖凝膠上樣孔中，浸入TAE電泳緩沖液中，恒壓90V電泳30min。紫外燈下觀察凝膠阻滯條帶。結果表明，當N/P比≥4時，DSPE-G2能完全壓縮pDNA，將其阻滯于加樣孔中而不向正極遷移(附圖1)。

用激光粒度分析儀測定二元復合物的粒徑分布與表面電位，進一步優(yōu)化N/P比。N/P比從5增加到20的過程中，粒徑從＞400nm降至250nm左右并趨于平穩(wěn)。電位從接近0mV增加到30mV左右并趨于平穩(wěn)。說明隨著DSPE-G2用量的增加，能更好地壓縮pDNA形成緊致的內核，而且表明正電性的增加有利于PAH-Cit電荷反轉層的吸附。最終N/P比＝20的二元復合物粒徑為242.5±10.1nm，分散系數(shù)為0.297，表面電位為30.5±6.4mV(附圖2)。

實施例3：一種樹突細胞靶向的pH響應型DNA疫苗遞送系統(tǒng)的制備方法

將50μL 0.2mg/mL pDNA溶液與50μL 2mg/mL的DSPE-G2溶液混合，渦旋1min，室溫孵化20min。取100μL 1mg/mL的PAH-Cit溶液與二元復合物溶液混合，室溫孵化30min。將200μL三元復合物溶液逐滴加入攪拌中的300μL 0.5mg/mL MCS溶液，持續(xù)攪拌30min。

實施例4：一種樹突細胞靶向的pH響應型DNA疫苗遞送系統(tǒng)的制備方法

將50μL 0.2mg/mL pDNA溶液與50μL 2mg/mL的DSPE-G2溶液混合，渦旋1min，室溫孵化20min。取150μL 1mg/mL的PAH-Cit溶液與二元復合物溶液混合，室溫孵化30min。將250μL三元復合物溶液逐滴加入攪拌中的300μL 0.5mg/mL MCS溶液，持續(xù)攪拌30min。

實施例5：一種樹突細胞靶向的pH響應型DNA疫苗遞送系統(tǒng)的制備方法

將50μL 0.2mg/mL pDNA溶液與50μL 2mg/mL的DSPE-G2溶液混合，渦旋1min，室溫孵化20min。取200μL 1mg/mL的PAH-Cit溶液與二元復合物溶液混合，室溫孵化30min。將300μL三元復合物溶液逐滴加入攪拌中的300μL 0.5mg/mL MCS溶液，持續(xù)攪拌30min。

實施例6：一種樹突細胞靶向的pH響應型DNA疫苗遞送系統(tǒng)的制備方法

將50μL 0.2mg/mL pDNA溶液與50μL 2mg/mL的DSPE-G2溶液混合，渦旋1min，室溫孵化20min。取50μL 2mg/mL的PAH-Cit溶液與二元復合物溶液混合，室溫孵化30min。將150μL三元復合物溶液逐滴加入攪拌中的300μL 0.5mg/mL MCS溶液，持續(xù)攪拌30min。

實施例7：一種樹突細胞靶向的pH響應型DNA疫苗遞送系統(tǒng)的制備方法

將50μL 0.2mg/mL pDNA溶液與50μL 2mg/mL的DSPE-G2溶液混合，渦旋1min，室溫孵化20min。取75μL 2mg/mL的PAH-Cit溶液與二元復合物溶液混合，室溫孵化30min。將175μL三元復合物溶液逐滴加入攪拌中的300μL 0.5mg/mL MCS溶液，持續(xù)攪拌30min。

實施例8：一種樹突細胞靶向的pH響應型DNA疫苗遞送系統(tǒng)的制備方法

將50μL 0.2mg/mL pDNA溶液與50μL 2mg/mL的DSPE-G2溶液混合，渦旋1min，室溫孵化20min。取100μL 2mg/mL的PAH-Cit溶液與二元復合物溶液混合，室溫孵化30min。將200μL三元復合物溶液逐滴加入攪拌中的300μL 0.5mg/mL MCS溶液，持續(xù)攪拌30min。

表1：三元復合物與四元復合物的粒徑、表面電位

從表中可以看出，相同的PAH-Cit用量下，濃度較高的PAH-Cit溶液(2mg/mL)相比于低濃度(1mg/mL)更易于與二元復合物吸附，形成負電性更強的三元復合物。而在相同的PAH-Cit濃度(2mg/mL)條件下，增加PAH-Cit用量對于三元復合物的粒徑、電位沒有顯著影響。但與MSC復合后會形成粒徑更大的四元復合物，而且會增大聚沉的風險。所以選定實施例6為優(yōu)方案。

在四元復合物層層自組裝的制備過程中，納米粒的粒徑變化不明顯，表面電位由內核的正電性到三元復合物的負電性，再到四元復合物的正電性，說明每一種材料的充分結合，并形成穩(wěn)定的復合物。最終四元復合物的粒徑為256.8±10.7nm，分散系數(shù)為0.104，表面電位為25.1±2.3mV(附圖3)。

實施例9：DSPE-G2的細胞毒性評價

將對數(shù)生長期的樹突細胞按每孔1×10⁴個細胞接種于96孔板，0.1μL RMPI-1640完全培養(yǎng)基/孔，培養(yǎng)24h，使細胞匯合度為70-80％。吸去培養(yǎng)基，每孔加入100μL不同濃度的DSPE-G2或PEI 25k(2.5、5、10、20、50μg/mL，RMPI-1640完全培養(yǎng)基為溶劑)。24h后，吸去培養(yǎng)基，每孔加入100μL含10％MTT溶液(5mg/mL，pH＝7.4PBS)的RMPI-1640完全培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)孵育4h。棄去上清液，每孔加入150μL DMSO，室溫振蕩10min，用酶聯(lián)免疫測定儀于570nm測定吸光度。以未經陽離子聚合物處理的細胞作為對照，計算細胞生存率，細胞生存率(％)＝OD570(實驗組)/OD570(對照組)×100。

結果表明，PEI 25k的細胞毒性隨濃度的增加而顯著增加，當濃度達到20μg/mL以上時，細胞大量死亡，顯示了較強的細胞毒性。而DSPE-G2的細胞毒性低于PEI 25k，在高濃度的情況下尤為明顯，所以適用于遞送pDNA(附圖4)。

實施例10：DNA疫苗遞送系統(tǒng)的細胞毒性評價

將對數(shù)生長期的樹突細胞按每孔1×10⁴個細胞接種于96孔板，100μL RMPI-1640完全培養(yǎng)基/孔，培養(yǎng)24h，使細胞匯合度為70-80％。吸去培養(yǎng)基，每孔加入100μL含不同復合物(pDNA/PEI_25kN/P＝10、二元復合物N/P＝5、二元復合物N/P＝10、二元復合物N/P＝15、二元復合物N/P＝20、三元復合物、四元復合物，控制pDNA含量為200ng)的無血清RMPI-1640培養(yǎng)基。孵育4h后，換RMPI-1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)20h。吸去培養(yǎng)基，每孔加入100μL含10％MTT溶液(5mg/mL，pH＝7.4PBS)的RMPI-1640完全培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)孵育4h。棄去上清液，每孔加入150μL DMSO，室溫振蕩10min，用酶聯(lián)免疫測定儀于570nm測定吸光度。以未經陽離子聚合物處理的細胞作為對照，計算細胞生存率，細胞生存率(％)＝OD570(實驗組)/OD570(對照組)×100。

結果表明，二元復合物的N/P比增大使轉染毒性增大；而且，隨著層層自組裝的進行，轉染毒性也會增強。但是，所有復合物的細胞生存率均高于80％，轉染毒性均低于pDNA/PEI_25kN/P＝10對照組，表明具有樹突細胞靶向性和pH敏感性的DNA疫苗遞送系統(tǒng)的低毒性(附圖5)。

實施例11：DNA疫苗遞送系統(tǒng)的體外轉染評價

以綠色熒光蛋白質粒pGRP為報告基因，考察不同DNA疫苗遞送系統(tǒng)的轉染效率。將對數(shù)生長期的樹突細胞按每孔4×10⁵個細胞接種于6孔板，1mL RMPI-1640完全培養(yǎng)基/孔，培養(yǎng)24h，使細胞匯合度為70-80％。吸去培養(yǎng)基，每孔加入1mL含不同復合物(pGFP/PEI_25kN/P＝10、二元復合物pGFP/DSPE-G2 N/P＝20、四元復合物pGFP/DSPE-G2/PAH-Cit/CS、四元復合物pGFP/DSPE-G2/PAH-Cit/MCS，控制pDNA含量為2μg)的無血清RMPI-1640培養(yǎng)基。孵育4h后，換RMPI-1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)20h。用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達，并拍照。

結果表明，二元復合物pGFP/DSPE-G2、未經靶向修飾的四元復合物pGFP/DSPE-G2/PAH-Cit/CS的轉染效率均低于pGFP/PEI_25k N/P＝10，而四元復合物pGFP/DSPE-G2/PAH-Cit/MCS的轉染效率顯著高于pGFP/PEI_25k N/P＝10，說明了PAH-Cit電荷反轉層的pH響應性釋放pDNA、甘露糖配體的靶向樹突細胞作用能顯著提高轉染效率。使不易被轉染的免疫細胞也達到了較高的轉染效率，有助于表達足量抗原，進而激發(fā)免疫反應(附圖6)。

實施例1-11結果表明，本發(fā)明構建的一種具有樹突細胞靶向性和pH敏感性的DNA疫苗遞送系統(tǒng)細胞毒性低、轉染效率高，能增強核酸疫苗的免疫原性，在基因免疫治療方面有著廣闊的應用前景。

以上所述僅是本發(fā)明的具體實施方式，應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進，這些改進也應視為本發(fā)明的保護范圍。