本發(fā)明涉及藥物用途的
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，本發(fā)明涉及一種阿魏菇多糖在疫苗佐劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：由于流浪犬生育無法控制，致使許多大城市流浪犬?dāng)?shù)量激增，傷人、咬死家畜和傳播疾病時有發(fā)生，過去控制流浪犬?dāng)?shù)量多是采用誘殺、棒打等不為人道的方法，這種捕殺方法方式較為殘忍，極容易引起愛狗人士的不滿以及社會輿論的壓力。采用犬zp3(caninezonapellucida3，czp3)為靶抗原，研制犬zp3dna疫苗pcdna3-czp3，不僅具有一定的抗生育效果，也具有廣泛的應(yīng)用前景。但該疫苗存在抗原性不高，在使用過程中出現(xiàn)了免疫效果不佳，且疫苗抗原用量較高，不能達(dá)到對流浪犬的數(shù)量進(jìn)行有效控制的目的。佐劑是指加入疫苗制劑后能促進(jìn)、增強(qiáng)或延長機(jī)體對抗原特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)。佐劑也是一種抗原輔助劑,與疫苗共同使用可以明顯提高疫苗的免疫效果。佐劑被用來增強(qiáng)疫苗免疫作用已有80多年的歷史。免疫佐劑可輔佐免疫原刺激機(jī)體產(chǎn)生較早、較強(qiáng)、持久的免疫應(yīng)答,現(xiàn)有的免疫佐劑存在免疫增強(qiáng)效果不理想，免疫力不持久等問題。阿魏菇，學(xué)名阿魏側(cè)耳，是一類食藥兩用珍稀真菌，因?qū)Ｐ约纳蚋谒幱弥参锇⑽旱母o上而得名。阿魏菇的子實(shí)體含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、碳水化合物、多種維生素及礦物質(zhì)等活性成分，具有較高的營養(yǎng)和藥用價值。多糖是一類特殊的生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗輻射、降血脂等多種活性，被稱為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，是繼核酸、蛋白質(zhì)之后的另一種有待深入研究色生物大分子。阿魏菇多糖(pleurotusferulaepolysaccharide,pflp)是阿魏菇中的一種重要有效成分，能夠增強(qiáng)t細(xì)胞功能，促進(jìn)抗體形成，誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生，從而使機(jī)體的免疫系統(tǒng)得到激活。王金輝、黃健等人對阿魏菇多糖免疫活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)阿魏菇多糖能顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力，并且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。此外，之前的研究表明純化的阿魏菇多糖可以有效的激活樹突狀細(xì)胞疫苗，但利用阿魏菇多糖作為佐劑聯(lián)合犬透明帶3dna免疫不育疫苗佐劑影響疫苗的免疫效果未見有報道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有的犬透明帶3dna疫苗存在的抗原性不高，在使用過程中免疫效果不佳，且疫苗抗原用量較高，不能達(dá)到對流浪犬的數(shù)量進(jìn)行有效控制的目的的問題，本發(fā)明提供阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應(yīng)用，能有效提高疫苗免疫效果，降低疫苗抗原用量。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應(yīng)用。優(yōu)選的，本發(fā)明中的阿魏菇多糖由新鮮阿魏菇或阿魏菇凍干粉中提取獲得。優(yōu)選的，本發(fā)明中的阿魏菇多糖的純度為96％。優(yōu)選的，本發(fā)明應(yīng)用中的阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質(zhì)量比為1:1～10:1。更優(yōu)選的，本發(fā)明應(yīng)用中的阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質(zhì)量比為2:1。進(jìn)一步，阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應(yīng)用，接種步驟為先注射阿魏菇多糖，后注射pcdna3-czp3dna疫苗。阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應(yīng)用，接種步驟為pcdna3-czp3dna疫苗和阿魏菇多糖同時注射。阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應(yīng)用，免疫動物為犬類、小鼠、大鼠中的任意一種。通過實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)方案，可以達(dá)到以下有益效果:(1)用阿魏菇多糖作為犬透明帶3dna疫苗佐劑，在用大鼠進(jìn)行效果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時，igg抗體水平相比于單用pcdna3-czp3組明顯升高，總產(chǎn)仔數(shù)相比于單用pcdna3-czp3組的41只阿魏菇多糖配伍之后下降至最低13只，展現(xiàn)出了良好的有效性，能夠更好的提高抗原的免疫原性，增強(qiáng)免疫效果。(2)用阿魏菇多糖制備的佐劑與犬透明帶3dna疫苗配合使用，不僅佐劑效果明顯，而且佐劑易獲得，質(zhì)量容易控制。具體實(shí)施方式下面，舉實(shí)施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。本發(fā)明中選用的所有材料、試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知的，但不限制本發(fā)明的實(shí)施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實(shí)施方式的實(shí)施。實(shí)施例一：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應(yīng)用，其中，阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質(zhì)量比為10:1。實(shí)施例二：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應(yīng)用，其中，阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質(zhì)量比為1:1。實(shí)施例三：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應(yīng)用，其中，阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質(zhì)量比為2:1。實(shí)施例四：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應(yīng)用，其中，阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質(zhì)量比為5:1。實(shí)施例五：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應(yīng)用，其中，阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質(zhì)量比為7:1。實(shí)施例六：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應(yīng)用，其中，阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質(zhì)量比為9:1。實(shí)施例七：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應(yīng)用，其中，阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質(zhì)量比為3:1。實(shí)施例八：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應(yīng)用，其中，阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質(zhì)量比為8:1。實(shí)施例九：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應(yīng)用，其中，阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質(zhì)量比為6:1。實(shí)施例十：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應(yīng)用，其中，阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質(zhì)量比為4:1。實(shí)施例十一：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應(yīng)用，其中，接種步驟為先注射阿魏菇多糖，后注射pcdna3-czp3dna疫苗。實(shí)施例十二：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應(yīng)用，其中，接種步驟為先注射pcdna3-czp3dna疫苗，后注射阿魏菇多糖。實(shí)施例十三：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應(yīng)用，其中，接種步驟為pcdna3-czp3dna疫苗和阿魏菇多糖同時注射。實(shí)施例十四：將上述實(shí)施例一至十提供的十個不同方案分別按照實(shí)施例十三提供的注射步驟進(jìn)行系列效果驗(yàn)證試驗(yàn)，隨機(jī)抽取樣本實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下所示：1、取40只6～8周齡雌性balb/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組小鼠10只。具體劃分為:1注射生理鹽水對照組；2注射質(zhì)粒pcdna3-czp3組(100μg/鼠)；31:1注射組：注射pcdna3-czp3(100μg/鼠)+阿魏菇多糖(100μg/鼠)，；42:1注射組：注射pcdna3-czp3(100μg/鼠)+阿魏菇多糖(200μg/鼠)然后對小鼠后肢肌內(nèi)進(jìn)行注射；在小鼠初次免疫后14d進(jìn)行第2次加強(qiáng)免疫、第2次免疫后14d進(jìn)行第3次加強(qiáng)免疫，在初次免疫14d、二免后14d和三免14d后，分別在小鼠眼后眶采血，測定免疫小鼠血清igg的抗體水平。結(jié)果如表1所示：表1：小鼠血清中igg抗體的間接elisa檢測的od值注：*p＜0.05，***p＜0.001，均與pcdna3-czp3實(shí)驗(yàn)組相比由表1可知，較pcdna3-czp3組相比阿魏菇多糖組小鼠血清igg的抗體水平顯著升高，從第2次免疫開始就有極顯著差異(p＜0.001)，pcdna3-czp3+pfp(200μg)組igg升高水平更為顯著。2、取免疫小鼠的脾細(xì)胞懸液測定cd4+、cd8+、cd4+和cd8+細(xì)胞的比值，結(jié)果如表2所示：表2：對免疫小鼠脾中cd4+和cd8+細(xì)胞亞群的影響組別cd4+(％)cd8+(％)cd4+/cd8+0.9％nacl27.37±1.5711.13±0.282.45±0.08pcdna3-czp332.37±0.9611.47±0.502.83±0.08pcdna3-czp3+pfp(100μg)39.30±1.40*16.23±0.69**2.42±0.05**pcdna3-czp3+pfp(200μg)45.87±0.90***19.42±0.24***2.19±0.03***注：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，均與pcdna3-czp3實(shí)驗(yàn)組相比由表2可知，阿魏菇多糖組能同時提高小鼠脾cd4+t淋巴細(xì)胞和cd8+t淋巴細(xì)胞的百分比，同時降低cd4+/cd8+的比值，pcdna3-czp3+pfp(200μg)組的變化更為顯著，可見加入阿魏菇多糖作為佐劑有利于cd4+t淋巴細(xì)胞和cd8+t淋巴細(xì)胞向ctl細(xì)胞的分化。3、三次免疫后的14d，將具有正常生育能力的balb/c雄鼠按照1：3的比例與免疫過的雌鼠進(jìn)行合籠，每天輪換雄鼠。21d后將雄鼠取出，觀察統(tǒng)計雌鼠的窩仔數(shù)，計算抗生育率，結(jié)果如表3所示：表3：小鼠抗生育免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表3可知，免疫阿魏菇多糖組相比于pcdna3-czp3疫苗單獨(dú)免疫組免疫小鼠的不育率明顯增加，總產(chǎn)仔數(shù)相比于pcdna3-czp3組的41只阿魏菇多糖配伍之后下降到17只，pcdna3-czp3+pflp(200μg)組低至13只。此外，用斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)分析小鼠抗體水平和產(chǎn)仔數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果表明無論是單獨(dú)免疫pcdna3-czp3組、阿魏菇多糖佐劑組小鼠抗體水平和產(chǎn)仔數(shù)均呈負(fù)相關(guān)。繼續(xù)用犬類和大鼠以上述步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得出相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)論：用阿魏菇多糖作為犬透明帶3dna疫苗佐劑，igg抗體水平相比于單用pcdna3-czp3組升高明顯，不育率顯著升高。實(shí)施例十五：按照實(shí)施例十四所述的試驗(yàn)方法進(jìn)行多次重復(fù)試驗(yàn)，采用阿魏菇多糖的純度為96％，將小鼠按注射阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的不同質(zhì)量比分為1：1組、2:1組、3:1組、4:1組、5:1組、6:1組、7:1組、8:1組、9:1組和10:1組，不同組別的不育率如表4所示：表4：不同阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質(zhì)量比小鼠不育率組別1:1組2:1組3:1組4:1組5:1組6:1組7:1組8:1組9:1組10:1組不育率(％)41.6156.2950.5848.4345.3246.7349.6539.4741.2230.57由表4可知，在阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質(zhì)量比為1:1至10:1之間，小鼠的不育率與質(zhì)量比不呈正相關(guān)關(guān)系，在2:1時不育率最高，免疫效果最佳。綜上所述通過實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明提供的用阿魏菇多糖作為犬透明帶3dna疫苗佐劑，用阿魏菇多糖作為犬透明帶3dna疫苗佐劑，在進(jìn)行效果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時，igg抗體水平相比于單用pcdna3-czp3組升高明顯，總產(chǎn)仔數(shù)相比于單用pcdna3-czp3組的41只阿魏菇多糖配伍之后下降至最低13只，展現(xiàn)出了良好的有效性，能夠更好的提高抗原的免疫原性，增強(qiáng)免疫效果；用阿魏菇多糖制備的佐劑與犬透明帶3dna疫苗配合使用，不僅佐劑效果明顯，而且佐劑易獲得，質(zhì)量容易控制。如上所述，即可較好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明,上述的實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案做出的各種改變和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明確定的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁12