本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2010年9月9日、發(fā)明名稱為“包含含有皂苷的佐劑的新疫苗制劑”的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)no.201080047645.0的分案申請(qǐng)。【
技術(shù)領(lǐng)域：
】本發(fā)明涉及水包油乳劑，它們作為佐劑的使用，及包含所述乳劑的藥學(xué)，免疫學(xué)或疫苗組合物?！驹尤搿勘旧暾?qǐng)要求2009年9月10日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)no.61/241,171的優(yōu)先權(quán)，且還參考下列專利申請(qǐng)：2008年2月7日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)no.12/027,776，2004年7月26日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)no.10/899,181，現(xiàn)在授權(quán)的美國(guó)專利7,371,395，及2003年7月24日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)no.60/490,345。上述申請(qǐng)，及它們中或它們的審查期間引用的全部文獻(xiàn)(“申請(qǐng)人引用的文獻(xiàn)”)和申請(qǐng)人引用的文獻(xiàn)中引用的或參考的全部文獻(xiàn)，及本文引用的或參考的全部文獻(xiàn)(“本文引用的文獻(xiàn)”)，及本文引用的文獻(xiàn)中引用的或參考的全部文獻(xiàn)，以及本文或通過引用并入本文的任何文獻(xiàn)中提及的任何產(chǎn)品的任何制造商的使用說明，描述，產(chǎn)物說明書，及產(chǎn)物印刷品均通過引用并入本文，且可在本發(fā)明的實(shí)踐中采用。
背景技術(shù)：
：熟知疫苗中佐劑的使用。佐劑是當(dāng)與疫苗抗原組合時(shí)，相比由疫苗抗原單獨(dú)誘導(dǎo)的應(yīng)答，增加對(duì)疫苗抗原的免疫應(yīng)答的化合物。促進(jìn)抗原免疫原性的策略之中尤其是：致使疫苗抗原成粒子的策略，多聚化或乳化疫苗抗原的策略，包裹疫苗抗原的方法，增加宿主先天性細(xì)胞因子應(yīng)答的方式，及使疫苗抗原靶向抗原呈遞細(xì)胞的方法(nossal,1999,in:fundamentalimmunology.paul(ed.),lippincott-ravenpublishers,philadelphia,pa.；vogel和powell,1995,in:vaccinedesign.thesubunitandadjuvantapproach.powell和newman(eds.),plenumpress,ny,n.y.p.141)。因?yàn)樽魟┰诟纳埔呙缈乖拿庖咴灾衅鸬奖匾淖饔?，疫苗制劑中佐劑的使用已?shí)際上是普遍存在的(nossal,1999,見上；vogel和powell,1995,見上；也見pct公開wo97/18837,將它們的教導(dǎo)通過引用并入本文)。本領(lǐng)域中熟知的常規(guī)佐劑性質(zhì)多樣。它們可，例如，由水不溶性無機(jī)鹽，脂質(zhì)體，微團(tuán)或乳劑組成，即弗氏佐劑。其他佐劑可見于以上提及的vogel和powell，1995。盡管無佐劑作用的單一機(jī)理，必要的特征是它們相比由疫苗抗原單獨(dú)誘導(dǎo)的應(yīng)答顯著增加對(duì)疫苗抗原的免疫應(yīng)答的能力(nossal,1999,見上；vogel和powell,1995,見上)。在這點(diǎn)上，一些佐劑在增加體液免疫應(yīng)答中更有效；其他佐劑在增加細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中更有效(vogel和powell,1995,見上)；及再一組的佐劑增加針對(duì)疫苗抗原的體液和細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(vogel和powell,1995,見上)。一般而言，疫苗制劑中使用的乳劑包含油，水溶液和表面活性劑的混合物。一些乳劑合并親脂性表面活性劑諸如span和親水表面活性劑諸如tween但是，可用作為疫苗佐劑使用的乳劑觀察到穩(wěn)定性問題，尤其是存儲(chǔ)或運(yùn)輸期間。當(dāng)這些組合物含有濃縮的免疫原，尤其非-純化的濃縮的免疫原時(shí)尤其如此。一般而言，這是在滅活的(殺的)疫苗中使用的佐劑的情況。此問題在多價(jià)疫苗組合物中甚至更顯著，因?yàn)槊庖咴谙嗤w積的稀釋劑中更濃縮。佐劑使用的另一問題與不利的事件諸如毒性或在注射位點(diǎn)處局部發(fā)炎的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)。例如，可在注射之后產(chǎn)生局部炎性應(yīng)答和/或肉芽腫。為了限制該不利的反應(yīng)，可減少乳劑中的表面活性劑和其他組分；但是，所述減小可然后導(dǎo)致疫苗組合物的穩(wěn)定性的降低。因此，有對(duì)含有該具有增加的安全性和穩(wěn)定性的佐劑的新佐劑和疫苗組合物的需求?！景l(fā)明概述】在第1實(shí)施方式中，本發(fā)明提供在細(xì)菌或病毒懸浮液，尤其濃縮的及非-純化的或弱地純化的那些的存在下具有增加的穩(wěn)定性的新水包油(o/w)乳劑。本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供穩(wěn)定的，安全和容易可施用的，尤其是可注射的，作為用于包含至少一種活性成分的藥物組合物的遞送的媒質(zhì)的o/w乳劑，所述活性成分可為，更具體而言，免疫原。本發(fā)明的再一實(shí)施方式提供穩(wěn)定的，安全和可注射的作為用于增加由免疫原誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的佐劑的o/w乳劑。尤其是，本發(fā)明提供當(dāng)在含有免疫原的疫苗組合物中使用時(shí)，增加受疫苗接種者的對(duì)于免疫原的細(xì)胞免疫應(yīng)答，體液免疫應(yīng)答或，優(yōu)選二者的新佐劑。本發(fā)明的再一實(shí)施方式提供包含o/w乳劑的穩(wěn)定的，安全和免疫原性組合物或疫苗。本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式提供使用本發(fā)明的佐劑制造疫苗組合物的方法；由此獲得的疫苗組合物；及使用所述疫苗組合物的方法。本發(fā)明的再一實(shí)施方式提供包含一或更多瓶的試劑盒。在一實(shí)施方式中，試劑盒包含含有本發(fā)明的佐劑和免疫原或其他藥物產(chǎn)物的1瓶。在再一實(shí)施方式中，試劑盒在第1瓶包含免疫原或其他藥物產(chǎn)物，及在第2瓶包含根據(jù)本發(fā)明制備的佐劑，佐劑被設(shè)計(jì)為在使用之前與免疫原或其他疫苗產(chǎn)物混合。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供可注射的水包油(o/w)乳劑，其包含：(1)包含免疫原的水溶液；(2)包含親水離子表面活性劑諸如皂苷的水溶液(3)包含氫氧化鋁的任選的水溶液(4)礦物油；(5)非-離子親脂性表面活性劑；(6)包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯的具有低hlb值的非-離子親水表面活性劑(通常具有11和13之間的hlb值)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供可注射的水包油(o/w)乳劑，其包含：(1)包含免疫原的水溶液；(2)包含親水離子表面活性劑諸如皂苷的水溶液(3)礦物油；(4)非-離子親脂性表面活性劑；(5)包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯的具有低hlb值的非-離子親水表面活性劑(通常具有11和13之間的hlb值)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供可注射的水包油(o/w)乳劑，其包含：(1)包含免疫原的水溶液；(2)包含親水離子表面活性劑諸如皂苷的水溶液(3)包含氫氧化鋁的任選的水溶液(4)具有大于13和小于40，尤其是hlb≥13.5，及優(yōu)選hlb≥14的高親水-親脂性平衡(hlb)值的非-離子親水表面活性劑；(5)礦物油；(6)非-離子親脂性表面活性劑；(7)具有低hlb值(約9～約13的hlb值)的非-離子親水表面活性劑。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供可注射的水包油(o/w)乳劑，其包含：(1)包含免疫原的水溶液；(2)包含親水離子表面活性劑諸如皂苷的水溶液(3)具有大于13和小于40，尤其是hlb≥13.5，及優(yōu)選hlb≥14的高親水-親脂性平衡(hlb)值的非-離子親水表面活性劑；(4)礦物油；(5)非-離子親脂性表面活性劑；(6)具有低hlb值(約9～約13的hlb值)的非-離子親水表面活性劑。在再一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含含有適合于在受疫苗接種者中引發(fā)免疫學(xué)應(yīng)答的至少一種免疫原的新乳劑的疫苗組合物。本發(fā)明還提供乳劑作為用于增加由免疫原誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，尤其是，用于增加細(xì)胞應(yīng)答，體液應(yīng)答或優(yōu)選二者的佐劑的組合物。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供制造疫苗組合物的方法，其中將免疫原，尤其干形式的免疫原，其可例如，通過冷凍干燥或通過玻璃化獲得，或在水溶液中的免疫原，尤其其中所述干形式或所述水溶液額外地包含離子表面活性劑，例如皂苷，及任選地額外地包含氫氧化鋁，與本發(fā)明的佐劑混合。免疫原可選自：滅活的病原體，減毒的病原體，亞-單元抗原，純化的抗原，未純化的抗原或使用細(xì)菌，酵母，植物，昆蟲或動(dòng)物細(xì)胞，包括質(zhì)粒的表達(dá)載體，等重組產(chǎn)生的抗原。抗原可通過本領(lǐng)域中熟知的手段純化，包括但不限于超濾，超速離心，大小排阻凝膠-過濾，離子-交換層析，及peg-純化。病原體可源于細(xì)菌，病毒，原生動(dòng)物或真菌，或免疫原可構(gòu)成抗毒素。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供在受疫苗接種者中誘導(dǎo)針對(duì)病原體的免疫應(yīng)答的方法，包括給受疫苗接種者施用本發(fā)明的疫苗組合物。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含含有純化的本發(fā)明的免疫原和乳劑的單個(gè)瓶的試劑盒。在一該實(shí)施方式中，單個(gè)瓶之內(nèi)含有的免疫原包含純化的fmd病毒抗原。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含至少2個(gè)瓶的試劑盒，在第1瓶中，免疫原，尤其干形式或在水性介質(zhì)中的溶液中的免疫原，尤其其中所述干形式或所述水溶液額外地包含離子表面活性劑，有利地皂苷和任選地額外地包含氫氧化鋁，且在第2瓶中是本發(fā)明的佐劑或乳劑。包含至少2個(gè)瓶的試劑盒的使用在離散組分的組合(即至少2個(gè)瓶的內(nèi)容物混合到單個(gè)瓶中)會(huì)導(dǎo)致減小的穩(wěn)定性的疫苗制劑的情況中特別有效。需知，在本公開和特別在權(quán)利要求中，術(shù)語諸如“包含(comprises)”，“包含(comprised)”，“包含(comprising)”等可具有美國(guó)專利法中該術(shù)語的含義；例如，它們可表示“包括(includes)”，“包括(included)”，“包括(including)”，等；且術(shù)語諸如“基本上由…組成(consistingessentiallyof)”和“基本上由…組成(consistsessentiallyof)”具有美國(guó)專利法中規(guī)定的含義，例如，它們?cè)试S未明確地?cái)⑹龅囊?，但排除見于現(xiàn)有技術(shù)或影響本發(fā)明的基本或新特征的要素。這些和其他實(shí)施方式被下列詳述公開或通過下列詳述顯而易見及被下列詳述包括?！靖綀D說明】本發(fā)明的全部及可能公開，包括其對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的最佳模式，更特別在以下說明書，包括參照附圖說明，其中：圖1提供在第7，22，121和330天(1年穩(wěn)定性研究)，對(duì)試驗(yàn)1&2的疫苗制劑的轉(zhuǎn)相溫度(pit)確定(通過導(dǎo)電率測(cè)量的)的圖。pit確定是疫苗制劑穩(wěn)定性的一個(gè)量度。圖2提供在產(chǎn)生后多天(1年穩(wěn)定性研究)對(duì)試驗(yàn)3&4的疫苗制劑的pit確定的圖；圖3提供在產(chǎn)生后多天(1年穩(wěn)定性研究)對(duì)試驗(yàn)5&6的疫苗制劑的pit確定的圖；圖4提供在產(chǎn)生后多天(1年穩(wěn)定性研究)對(duì)試驗(yàn)7&8的疫苗制劑的pit確定的圖；圖5提供在產(chǎn)生后多天(1年穩(wěn)定性研究)對(duì)試驗(yàn)9的疫苗制劑的pit確定的圖；圖6提供對(duì)根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生，及存儲(chǔ)36個(gè)月的疫苗制劑(試驗(yàn)1～9)的pit確定的圖；圖7提供顯示根據(jù)在實(shí)施例6中公開的材料和方法處理的豬的直腸溫度的時(shí)間-依賴性變化的圖；圖8提供顯示對(duì)根據(jù)在實(shí)施例6中公開的材料和方法處理的豬觀察的最大溫度變化的圖；圖9提供顯示根據(jù)在實(shí)施例7中公開的材料和方法處理的豬的疫苗效力(pd50)對(duì)比凈荷(μg)的圖?！景l(fā)明詳述】本發(fā)明的其他目的，特征和方面公開于下列詳述，或自下列詳述顯而易見。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員明白，本文僅描述例示實(shí)施方式，且不旨在限制本發(fā)明的更廣方面，該更廣方面在例示實(shí)施方式中具體化。實(shí)際上，本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，可在本發(fā)明中進(jìn)行各種修飾和變異而不離開本發(fā)明的范圍或精神。例如，作為一實(shí)施方式的部分例證的或描述的特征可用于另一實(shí)施方式中，以產(chǎn)生再進(jìn)一步實(shí)施方式。期望本發(fā)明含蓋該修飾和變異在隨附的權(quán)利要求和它們的相當(dāng)體的范圍之內(nèi)。將貫穿本申請(qǐng)引用的全部參考文獻(xiàn)，出版的專利和專利的內(nèi)容通過引用整體并入本文。為了便利，將說明書，實(shí)施例和隨附的權(quán)利要求中采用的特定術(shù)語收集于此。如本文所用，術(shù)語“動(dòng)物”包括全部脊椎動(dòng)物，包括人。其也包括全部發(fā)育階段，包括胚胎和胚胎階段的個(gè)體動(dòng)物。尤其是，術(shù)語“脊椎動(dòng)物”包括但不限于人，狗(例如,狗)，貓(例如,貓)；馬(例如,馬)，牛(例如,牛(cow)，牛(cattle))，豬(例如,豬)，以及禽。如本文所用，術(shù)語“牛(cow)”或“牛(cattle)”通常用于指稱任何齡的牛來源的動(dòng)物?？苫Q的術(shù)語包括“?！保芭佟?，“食用?！?，“公?！?，“小母?！?，“?！钡??？苫Q的術(shù)語包括“小豬”，“母豬”等。本文所用的術(shù)語“禽”指稱分類學(xué)類ava的任何物種或亞種，諸如但不限于雞(種雞,肉雞和產(chǎn)蛋雞)，火雞，鴨，鵝，鵪鶉，雉雞，鸚鵡，雀，鷹，烏鴉和包括鴕鳥，鴯鹋和鶴鴕的平胸鳥。術(shù)語“豬”或“小豬”是指豬來源的動(dòng)物，而“母豬”指稱在育齡和有生殖能力的雌性。如本文所用，術(shù)語“強(qiáng)毒”是指保留其在動(dòng)物宿主中的感染性的能力的分離物。如本文所用，術(shù)語“滅活的疫苗”是指含有不再能復(fù)制或生長(zhǎng)的感染性生物或病原體的疫苗組合物。病原體可為細(xì)菌，病毒，原生動(dòng)物或真菌來源。滅活可通過各種方法實(shí)現(xiàn)，包括凍融，化學(xué)處理(例如，用福爾馬林處理)，超聲處理，輻射，加熱或足以防止生物復(fù)制或生長(zhǎng)而維持其免疫原性的任何其他常規(guī)手段。如本文所用，術(shù)語“免疫原性”是指能在宿主動(dòng)物中產(chǎn)生針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。此免疫應(yīng)答形成由針對(duì)特定感染性生物的疫苗引發(fā)的保護(hù)性免疫的基礎(chǔ)。如本文所用，術(shù)語“免疫應(yīng)答”指稱在動(dòng)物中引發(fā)的應(yīng)答。免疫應(yīng)答可指稱細(xì)胞免疫(cmi)；體液免疫或可涉及二者。本發(fā)明也涵蓋限于一部分免疫系統(tǒng)的應(yīng)答。例如，本發(fā)明的疫苗組合物可特別誘導(dǎo)增加的γ干擾素應(yīng)答。如本文所用，術(shù)語“抗原”或“免疫原”是指在宿主動(dòng)物中誘導(dǎo)特定免疫應(yīng)答的物質(zhì)。抗原可包含全生物，殺死的，減毒的或活的；生物的亞基或部分；含有具有免疫原性性質(zhì)的插入物的重組載體；呈遞到宿主動(dòng)物后能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的dna的碎片或片段；蛋白，多肽，肽，表位，半抗原，或其任何組合。替代性地，免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。如本文所用，術(shù)語“多價(jià)”是指含有多于一種無論來自相同的物種(即，fmd病毒血清型的不同分離物)，還是來自不同物種(即,分離自溶血性巴斯德菌(pasteurellahemotylica)及多殺巴斯德菌(pasteurellamultocida))的抗原的疫苗，或含有來自不同屬的抗原的組合的疫苗(例如，包含來自多殺巴斯德菌(pasteurellamultocida)，沙門氏菌屬(salmonella)，大腸埃希氏菌(escherichiacoli)，睡眠嗜血桿菌(haemophilussomnus)及梭菌屬(clostridium)的抗原的疫苗)。如本文所用，術(shù)語“佐劑”是指添加到疫苗而增加疫苗的免疫原性的物質(zhì)。不完全知道佐劑如何作用的機(jī)理。一些佐劑被認(rèn)為通過緩慢釋放抗原來增強(qiáng)免疫應(yīng)答，而其他佐劑是它們自身就強(qiáng)烈免疫原性，且被認(rèn)為協(xié)同發(fā)揮功能。知道的疫苗佐劑包括，但不限于，油和水乳劑(例如,完全弗氏佐劑和不完全的弗氏佐劑)，短小棒桿菌(corynebacteriumparvum)，卡介苗，氫氧化鋁，葡聚糖，硫酸葡聚糖，氧化鐵，藻酸鈉，細(xì)菌佐劑，特定合成聚合物諸如聚氨基酸，以及氨基酸的共聚物，皂苷，"regressin"(vetrepharm,athens,ga.)，"阿夫立定"(n,n-二-十八烷基-n',n'-雙(2-羥乙基)-丙烷二胺)，石蠟油，胞壁酰二肽等。如本文所用，術(shù)語“乳劑”指稱至少2種物質(zhì)的組合，其中第1物質(zhì)分散到第1物質(zhì)不溶的第2物質(zhì)中。本發(fā)明的乳劑的一例是分散到水相的油相。如本文所用，術(shù)語“不完全的乳劑”指稱必需加入至少一種額外的組分來制造“完全乳劑”的組合物。如本文所用，術(shù)語“完全乳劑”可被認(rèn)為相當(dāng)于本發(fā)明的“即用”免疫學(xué)組合物。完全乳劑的一例是根據(jù)本發(fā)明的方法容易施用于動(dòng)物的本發(fā)明的免疫學(xué)組合物。如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)可接受的載體”和“藥學(xué)可接受的媒質(zhì)”可互換且指稱含有可無不利效果地注入宿主的疫苗抗原的流體媒質(zhì)。本領(lǐng)域知道的適合的藥學(xué)可接受的載體包括，但不限于，無菌水，鹽水，葡萄糖，右旋糖或緩沖溶液。載體可包括輔助劑包括但不限于稀釋劑，穩(wěn)定劑(即,糖和氨基酸)，防腐劑，潤(rùn)濕劑，乳化劑，ph緩沖劑，粘度增強(qiáng)添加劑，顏料等。如本文所用，術(shù)語“疫苗組合物”包括在宿主中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中有用的藥學(xué)可接受的媒質(zhì)中的至少一種抗原或免疫原。疫苗組合物可以劑量及通過醫(yī)療或獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員熟知的技術(shù)，考慮因素如受者動(dòng)物的齡，性別，重量，物種和情況，及施用途徑來施用。施用途徑可為經(jīng)皮，經(jīng)粘膜施用(例如,口腔,鼻,肛門,陰道)或經(jīng)腸胃外途徑(真皮內(nèi),肌內(nèi),皮下,靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi))。疫苗組合物可單獨(dú)施用，或可與其他治療或治療共施用或依次施用。施用形式可包括懸浮液，糖漿或酏劑，及腸胃外，皮下，真皮內(nèi)，肌內(nèi)或靜脈內(nèi)施用制劑(例如,可注射的施用)諸如無菌懸浮液或乳劑。疫苗組合物可作為噴霧劑施用或混合進(jìn)食品和/或水或遞送到與適合的載體，稀釋劑或賦形劑諸如無菌水，生理學(xué)鹽水，葡萄糖，等的混合物中。組合物可含有輔助物質(zhì)諸如潤(rùn)濕或乳化劑，ph緩沖劑，佐劑，膠凝或粘度增強(qiáng)添加劑，防腐劑，調(diào)味劑，顏料，等，依賴于施用途徑和期望的制劑?？芍J詢標(biāo)準(zhǔn)物藥學(xué)教科書，諸如“remington'spharmaceuticalsciences”，1990來制備適合的制劑，無需過度實(shí)驗(yàn)。本文所用的術(shù)語“純化的”不需要絕對(duì)純度；其旨在表示相對(duì)術(shù)語。由此，例如，純化的免疫原制劑，諸如蛋白或滅活的病毒，是免疫原相比天然的環(huán)境中的免疫原更富集的免疫原制劑。免疫原制劑在本文廣泛地指稱為“純化的”使得免疫原表示制劑總免疫原含量的至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，或至少98％?！按种苿保浯碜畹统潭鹊募兓?，可含有少至小于60％，小于20％，小于10％，小于5％，或小于1％的免疫原性組分。本文所用的術(shù)語“高度純化的”旨在表示相比術(shù)語“中度純化的”的“更高程度的純度”。此“更高程度的純度”可包括，但不以任何方式限于，已“高度純化的”免疫學(xué)制劑對(duì)比已“中度純化的”免疫學(xué)制劑中減少的百分率的污染物。如本文所述，“高度純化的”免疫學(xué)制劑會(huì)具有最低到不可檢測(cè)的百分率的污染物，其可導(dǎo)致：減少的期望的免疫應(yīng)答，增加的不期望的免疫應(yīng)答(例如超敏反應(yīng))，或減少的制劑穩(wěn)定性。類似地，已“中度純化的”免疫學(xué)制劑對(duì)比已“最低限度純化的”免疫學(xué)制劑含有相對(duì)減少的百分率的污染物，其如同，對(duì)比稱之為“粗制劑”的制劑減少了百分率的污染物。免疫學(xué)制劑中的污染物可包括，但不以任何方式限于，負(fù)面地貢獻(xiàn)于本發(fā)明的免疫學(xué)組合物的物質(zhì)。負(fù)面地貢獻(xiàn)的污染物的幾例之一是減少本發(fā)明的免疫學(xué)組合物在動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的能力的污染物?？墒褂酶鞣N方法達(dá)到改變水平的純度(例如“高度純化的”,“中度純化的”等)。例如，層析和大小排阻凝膠過濾的組合可導(dǎo)致“高度純化的”或"中度純化的"免疫學(xué)制劑。免疫原的源/類型差異，以及純化過程的輕微變化可顯著影響免疫原純度的最終程度。一般而言，如本文所用，具有最低到最高百分率的污染物的免疫學(xué)制劑會(huì)分別描述為(1)“高度純化的，(2)“中度純化的”，(3)“最低限度純化的”，(4)“粗制劑”。“高度純化的”制劑會(huì)全部類型的污染物都具有最低水平。“中度純化的”制劑會(huì)具有相對(duì)低水平的多數(shù)類型的污染物，但可具有相比會(huì)在可比較的“高度純化的”制劑觀察的更高豐度的一種類型的污染物。同樣，“最低限度純化的制劑”會(huì)具有相對(duì)低水平的一些類型的污染物，但可具有相比可比較的“中度純化的”制劑更高豐度的多于一種類型的污染物。如所預(yù)期，“粗制劑”相比本文討論的其他類型的制劑，全部污染物類型都具有最高水平的污染物。本發(fā)明提供新水包油(o/w)乳劑，其包含：(1)包含能在宿主中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的疫苗抗原或免疫原的水溶液；(2)包含離子表面活性劑的水溶液；(3)非-離子親水表面活性劑；(4)礦物油；在一實(shí)施方式中，新水包油(o/w)乳劑包含：(1)包含能在宿主中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的疫苗抗原或免疫原的水溶液；(2)包含離子表面活性劑諸如皂苷的水溶液；(3)具有大于13和小于40(hlb>13,尤其是hlb≥13.5,及優(yōu)選hlb≥14)的親水-親脂性平衡(hlb)值的非-離子親水表面活性劑；(4)礦物油；(5)非-離子親脂性表面活性劑；以及(6)具有低hlb值(9和13之間的hlb值)的非-離子親水表面活性劑。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供新水包油(o/w)乳劑，其包含：(1)包含能在宿主中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的疫苗抗原或免疫原的水溶液；(2)包含離子表面活性劑諸如皂苷的水溶液(3)包含氫氧化鋁的任選的水溶液(4)具有大于13和小于40(hlb>13,尤其是hlb≥13.5,及優(yōu)選hlb≥14)的親水-親脂性平衡(hlb)值的非-離子親水表面活性劑；(5)礦物油；(6)非-離子親脂性表面活性劑；以及(7)具有低hlb值(9和13之間的hlb值)的非-離子親水表面活性劑。一些根據(jù)本發(fā)明制備的乳劑基于從4個(gè)不同組的表面活性劑的成員之中選擇的至少4種表面活性劑的組合，且可能使用屬于各組的一種或更多表面活性劑。這些組中的3組包含非-離子表面活性劑，這些組之一包含離子表面活性劑，例如皂苷。在幾個(gè)實(shí)施方式之一，乳劑(除非另外說明，在本說明書中，這是指包含全部成分的最終乳劑)中離子表面活性劑(2)的濃度是約0.01％～約10％。在幾個(gè)實(shí)施方式之一，乳劑(除非另外說明，在本說明書中，這是指包含全部成分的最終乳劑)中非-離子親水表面活性劑(7)的濃度是1％～8％，尤其是1.5％～6％，優(yōu)選2％～5％，更優(yōu)選2.5％～4％，以重量比乳劑體積(w/v)的百分率表示。此組表面活性劑包含具有低hlb值(9和13之間的hlb值)的非-離子親水表面活性劑。此組包括但不限于乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸單酯(尤其是5個(gè)乙氧基)(例如乙氧基化的山梨糖醇酐單油酸酯諸如tween乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯，乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯(尤其是20個(gè)乙氧基)(例如乙氧基化的山梨糖醇酐三油酸酯諸如tween)，乙氧基化的山梨糖醇酐三硬脂酸酯諸如tween乙氧基化的脂肪醇(尤其是5～10個(gè)乙氧基)(例如brijbrijbrij)，乙氧基化的脂肪酸(尤其是5～10個(gè)乙氧基)(例如simulsolmyrj)，乙氧基化的蓖麻油(尤其是25～35個(gè)乙氧基)(例如arlatonearlatone)和其組合。優(yōu)選乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯及乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯，以及兩種物質(zhì)的組合。脂肪酸優(yōu)選選自：油酸，棕櫚酸，硬酯酸，異硬脂酸，月桂酸和其組合。優(yōu)選的乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯包含乙氧基化的山梨糖醇酐三油酸酯，諸如tween或乙氧基化的山梨糖醇酐三硬脂酸酯，諸如tween在幾個(gè)實(shí)施方式之一，非-離子親水表面活性劑(4)的濃度通常是0.1％～1.5％，尤其是0.2％～1.4％，優(yōu)選0.3％～1.3％，更優(yōu)選0.4％～1.2％，以重量比乳劑體積(w/v)的百分率表示。此第2組表面活性劑包含具有高親水-親脂性平衡(hlb)值(hlb>13,尤其是hlb≥13.5,及優(yōu)選hlb≥14)的非-離子親水表面活性劑。此組包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸單酯(尤其是20個(gè)乙氧基)(例如乙氧基化的山梨糖醇酐單月桂酸酯，諸如tween乙氧基化的山梨糖醇酐單棕櫚酸酯，諸如tween乙氧基化的山梨糖醇酐單硬脂酸酯，諸如tween乙氧基化的山梨糖醇酐單油酸酯，諸如tween乙氧基化的脂肪醇(尤其是15～30個(gè)乙氧基)(例如brijbrijbrij)，乙氧基化的脂肪酸(尤其是15～30個(gè)乙氧基)(例如myrjmyrjmyrjmyrj)，非-離子嵌段共聚物(例如聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物(poe-pop)，諸如lutrollutrol)和其組合。對(duì)于非-離子嵌段共聚物，百分率可更低，且尤其是0.1％～0.5％，更特別是0.2％～0.4％(重量比乳劑體積(w/v))。優(yōu)選的表面活性劑(4)包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸單酯，諸如上述那些。在幾個(gè)實(shí)施方式之一，非-離子親脂性表面活性劑(6)的濃度是0.1％～2.5％，尤其是0.2％～2％，優(yōu)選0.2％～1.5％，更優(yōu)選0.2％～1.2％，以重量比乳劑體積(w/v)的百分率表示。此組表面活性劑包含山梨糖醇酐脂肪酸酯(例如山梨糖醇酐單月桂酸酯,如span山梨糖醇酐單棕櫚酸酯,諸如span山梨糖醇酐單硬脂酸酯,諸如span山梨糖醇酐三硬脂酸酯,諸如span山梨糖醇酐單油酸酯,如span山梨糖醇酐三油酸酯，如span山梨糖醇酐單異硬脂酸酯，諸如arlacel山梨糖醇酐異硬脂酸酯，諸如crill)，二縮甘露醇脂肪酸酯(例如montanide二縮甘露醇單油酸酯(諸如arlacel)，二縮甘露醇二油酸酯,二縮甘露醇三油酸酯,二縮甘露醇四油酸酯)，乙氧基化的二縮甘露醇脂肪酸酯(2,3或4個(gè)乙氧基)(例如montanidemontanide乙氧基化的二縮甘露醇單油酸酯,乙氧基化的二縮甘露醇二油酸酯,乙氧基化的二縮甘露醇三油酸酯,乙氧基化的二縮甘露醇四油酸酯)，及其組合。脂肪酸優(yōu)選選自：油酸，棕櫚酸，硬酯酸，異硬脂酸，月桂酸和其組合。優(yōu)選的表面活性劑(6)包含山梨糖醇酐脂肪酸酯，尤其是上述那些，及其組合。本發(fā)明的表面活性劑可具有來自動(dòng)物或植物來源的脂肪酸。一種來源到另一來源的變化(例如動(dòng)物tween到植物tween)可用僅乳劑制劑中的微小調(diào)節(jié)來簡(jiǎn)單進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的乳劑可具有總體濃度的表面活性劑，以重量/乳劑體積計(jì)，1.2％～10％，尤其是2％～8％，優(yōu)選3％～7％，更優(yōu)選4％～6％。一般而言，根據(jù)本發(fā)明的乳劑可具有轉(zhuǎn)相溫度(pit)，其為≥33℃，尤其是33℃～65℃，更特別是36℃～60℃，優(yōu)選37℃～55℃，及更優(yōu)選38℃～50℃。pit是油包水乳劑變化為水包油乳劑或退相(乳劑分層和2相分離)的溫度。pit值可通過各種手段，如例如通過目視現(xiàn)象(例如見實(shí)施例2)或通過導(dǎo)電率測(cè)量。乳劑放在乳劑pit以下的溫度，例如在水-浴中約25℃。將溫度進(jìn)行性地升高。對(duì)比對(duì)照乳劑觀察乳劑的視覺方面的變化，明顯的是，流動(dòng)性，粘度，2相中的分離，由于油相向表面的遷移的表面方面的變化。觀察此視覺方面的變化的溫度是乳劑的pit值?；蛘撸琾it通過由放進(jìn)乳劑，接近其表面的探針測(cè)量的約5～8millisiemens/cm(ms/cm)的導(dǎo)電率值(水包油乳劑)到約0ms/cm的值(油包水乳劑)的快速轉(zhuǎn)變來測(cè)定。觀察轉(zhuǎn)變的溫度是乳劑的pit值。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員無需過度實(shí)驗(yàn)就能測(cè)定表面活性劑和油的組合，包括它們的相應(yīng)濃度，以便產(chǎn)生本發(fā)明的乳劑，及尤其是具有以上定義的范圍之內(nèi)的pit值的乳劑。一般而言，根據(jù)本發(fā)明的乳劑可含有，以體積/乳劑體積計(jì)，3％～55％的油，尤其是5％～50％的油，優(yōu)選10％～40％的油，及更優(yōu)選地，20％～40％的油。通過定義，除非另外說明，在本說明書中的值的范圍，總是包括范圍的限值。使用的油可為礦物油，包括但不限于石蠟油諸如異石蠟油和/或環(huán)烷油，角鯊?fù)?，姥鮫烷，聚異丁烯油，氫化的聚異丁烯油，聚癸烯油，聚異戊烯油，聚異丙烯油等。在本發(fā)明中有用的一種有利的礦物油可包括包含線性或分支的具有大于15，優(yōu)選15～32的碳原子數(shù)，且無芳族化合物的碳鏈的油。該油可為，例如，以名稱"marcol"或“marcol”(產(chǎn)自esso,法國(guó))或"drakeol"或"drakeol""drakeol"(產(chǎn)自penreco,usa)，(產(chǎn)自sonneborn,usa)，“石蠟油codex”(產(chǎn)自aiglon,法國(guó))，blandol(產(chǎn)自sonneborn,usa)，ondina915(產(chǎn)自shell,uk)銷售的那些。油也可為包含在本文所述的油之中選擇，且以任何比例的至少2種油的油混合物。油混合物也可包含至少一種在上述油之中選擇的油和至少一種植物油，且此植物油占約0.1％～約33％的油相，優(yōu)選約10％～約25％v/v。這些植物油是可生物降解且優(yōu)選在存儲(chǔ)溫度(約+4℃)是液體或至少使提供在此溫度是液體的乳劑成為可能的富含油酸的不飽和的油。例如植物油可為花生油，堅(jiān)果油，葵花油，紅花油，大豆油，橙油等。在幾個(gè)實(shí)施方式之一，親水表面活性劑(4)和(7)優(yōu)選包括具有分子的相同的親水部分的表面活性劑。例如，使用用于各親水表面活性劑(4)和(7)的乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸酯。例如如果選擇tween為具有低hlb值的非-離子親水表面活性劑，具有高h(yuǎn)lb值的非-離子親水表面活性劑會(huì)有利地具有用乙氧基化的山梨糖醇酐，諸如tween構(gòu)成的親水部分。一般而言，本發(fā)明考慮使用水溶液，其包含適合的獸醫(yī)學(xué)或藥學(xué)可接受的媒質(zhì)，賦形劑或稀釋劑，其包括但不限于無菌水，生理學(xué)鹽水，葡萄糖，緩沖劑等。媒質(zhì)，賦形劑或稀釋劑也可包括多元醇，糖族或ph緩沖劑。媒質(zhì)，賦形劑或稀釋劑也可，例如，包含氨基酸，肽，抗氧化劑，殺菌劑和抑菌劑化合物。以獲得本發(fā)明的乳劑的100％的體積的量將水溶液加入油和表面活性劑。乳劑的親水-親脂性平衡(hlb)允許表面活性劑的親水或親脂性力的估計(jì)。兩性分子的hlb通常如下計(jì)算：hlb可具有0(對(duì)于最親脂性分子)～20(對(duì)于最親水分子)的值。根據(jù)表面活性劑的化學(xué)組成(顯著地例如乙氧基或烯氧化物的添加)，此估計(jì)可變化，且hlb值域可增加(例如，具有29的hlb的lutrol)。隨著表面活性劑的混合，混合物的hlb是各表面活性劑的hlb的累加，被其重量比平衡：在根據(jù)本發(fā)明制備的乳劑的一實(shí)施方式中，乳劑的最終hlb是約9～約12，優(yōu)選約9.5～約11.5和更優(yōu)選約10～約11.5。本發(fā)明涵蓋乳劑，其包含：石蠟油(尤其是以約10％～約40％和優(yōu)選約20％～約40％的濃度,以體積/乳劑體積(v/v)表示)；山梨糖醇酐脂肪酸單酯(作為非-離子親脂性表面活性劑)，乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯(作為具有低hlb值的非-離子親水表面活性劑)；及乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸單酯(作為具有高h(yuǎn)lb值的非-離子親水表面活性劑)。尤其是山梨糖醇酐脂肪酸單酯是山梨糖醇酐單油酸酯(尤其是以0.2％～1.5％,優(yōu)選0.2％～1.2％的濃度，以重量/乳劑體積(w/v)表示)，乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯是乙氧基化的山梨糖醇酐三油酸酯(尤其是以2％～5％,優(yōu)選2.5％～4％w/v的濃度)及乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸單酯是乙氧基化的山梨糖醇酐單油酸酯(尤其是以0.3％～1.3％,優(yōu)選0.4％～1.2％w/v的濃度)。例如，乳劑包含：約29.3％以體積/乳劑體積計(jì)的石蠟油，0.6重量％/乳劑體積的山梨糖醇酐單油酸酯，3.4重量％/乳劑體積的乙氧基化的山梨糖醇酐三油酸酯，及0.75重量％/乳劑體積的乙氧基化的山梨糖醇酐單油酸酯。在本發(fā)明的第2實(shí)施方式中，乳劑包含石蠟油(尤其是以10％～40％,優(yōu)選20％～40％v/v的濃度)，山梨糖醇酐脂肪酸單酯(作為非-離子親脂性表面活性劑)，乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯(作為具有低hlb值的非-離子親水表面活性劑)，及非-離子嵌段共聚物(作為具有高h(yuǎn)lb值的非-離子親水表面活性劑)。尤其是山梨糖醇酐脂肪酸單酯是山梨糖醇酐單油酸酯(尤其是以0.2％～1.5％,優(yōu)選0.2％～1.2％w/v的濃度)，乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸三酯是乙氧基化的山梨糖醇酐三油酸酯(尤其是以2％～5％,優(yōu)選2.5％～4％w/v的濃度)，非-離子嵌段共聚物是聚氧乙烯/聚氧丙烯聚合物(poe-pop)(尤其是以0.1％～0.5％,優(yōu)選0.2％～0.4％w/v的濃度)。例如乳劑包含：約29.3％v/v的石蠟油，0.6％w/v的山梨糖醇酐單油酸酯，3.4％w/v的乙氧基化的山梨糖醇酐三油酸酯，及0.25％w/v的乙氧基化的山梨糖醇酐單油酸酯。在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋可注射的水包油(o/w)乳劑，其包含：(1)包含活性成分諸如藥物或免疫原，優(yōu)選免疫原的水溶液；(2)包含皂苷的水溶液(3)礦物油；(4)非-離子親脂性表面活性劑；以及(5)包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯的具有低hlb值的非-離子親水表面活性劑(其可具有11和13之間的hlb值)。在另一特定實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋可注射的水包油(o/w)乳劑，其包含：(1)包含活性成分諸如藥物或免疫原，優(yōu)選免疫原的水溶液；(2)包含皂苷的水溶液(3)包含氫氧化鋁的水溶液(4)礦物油；(5)非-離子親脂性表面活性劑；以及(6)包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯的具有低hlb值的非-離子親水表面活性劑(其可具有11和13之間的hlb值)。根據(jù)此實(shí)施方式的乳劑包含可含有達(dá)20個(gè)乙氧基的乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯。脂肪酸可來自動(dòng)物或植物來源，且可選自：油酸，棕櫚酸，硬酯酸，異硬脂酸，月桂酸和其組合。在一實(shí)施方式中，乙氧基化的脂肪酸優(yōu)選為油酸。其他成分，以及乳劑的一般性質(zhì)，諸如pit，可相比上述那些具有相同的特征。優(yōu)選地，表面活性劑(6)包含乙氧基化的山梨糖醇酐脂肪酸二酯，諸如乙氧基化的山梨糖醇酐二油酸酯，乙氧基化的山梨糖醇酐二硬脂酸酯或乙氧基化的山梨糖醇酐二異硬脂酸酯，乙氧基化的山梨糖醇酐二棕櫚酸酯，乙氧基化的山梨糖醇酐二月桂酸酯，及其組合?？蓪⑷芜x地其他化合物作為輔佐劑添加到乳劑，包括但不限于礬；cpg寡核苷酸(odn)，尤其是odn2006，2007，2059或2135(pontarollor.a.etal.,vet.immunol.immunopath,2002,84:43-59；wernettec.m.etal.,vet.immunol.immunopath,2002,84:223-236；mutwirig.etal.,vet.immunol.immunopath,2003,91:89-103)；多聚a-多聚u(“vaccinedesignthesubunitandadjuvantapproach”,editedbymichaelf.powellandmarkj.newman,pharmaceuticalbiotechnology,6:03)；二甲基二-十八烷基銨溴化物(dda)(“vaccinedesign:thesubunitandadjuvantapproach”,editedbymichaelf.powellandmarkj.newman,pharmaceuticalbiotechnology,volume6:157)，n,n-二-十八烷基-n’,n’-雙(2-羥乙基)丙烷二胺(諸如)(ibid,p.148)，卡波姆，殼聚糖(例如見美國(guó)專利系列no.5,980.912)。本發(fā)明也提供制造包含至少一種抗原或免疫原組合物和根據(jù)本發(fā)明制備的佐劑或乳劑的疫苗組合物或免疫學(xué)組合物的方法?？乖蛎庖咴M合物可在乳劑形成期間合并，或在替代實(shí)施方式中，可將抗原或免疫原組合物，其優(yōu)選額外地包含皂苷和任選地額外地包含氫氧化鋁，在之后，例如，恰在使用之前加入乳劑。使用的水溶液的整個(gè)量可存在于首先產(chǎn)生的乳劑中。或者，其可為僅一部分此水溶液用于形成乳劑，及余下量的水溶液在并合免疫原之后添加。免疫原或抗原可為干形式或以一些其他適當(dāng)?shù)墓腆w形式存在，然后與乳劑混合或，交替，抗原可為溶液，尤其是以水溶液存在，且將此溶液與乳劑混合。優(yōu)選將表面活性劑根據(jù)它們的溶解度添加到油或水溶液。例如，將非-離子親脂性表面活性劑加入根據(jù)本發(fā)明的油，而將具有高h(yuǎn)lb值的非-離子親水表面活性劑加入水溶液?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的常規(guī)方法制備乳化。例如，在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，可在乳劑pit以下的溫度，尤其是于室溫，例如于約25℃制備乳劑。將水相和油相通過機(jī)械攪拌，例如用裝備能創(chuàng)建高剪力的轉(zhuǎn)子-定子的渦輪混合在一起。優(yōu)選以低旋轉(zhuǎn)速度開始攪拌，并隨著通常漸進(jìn)地將水溶液添加進(jìn)油而緩慢增加。優(yōu)選將水溶液漸進(jìn)地添加到油?？烧{(diào)整油/水溶液的比，以獲得油包水(w/o)乳劑，例如，以約40％～約55％濃度的油(v/v)。當(dāng)攪拌停止時(shí)，乳劑漸進(jìn)地變化為o/w乳劑(轉(zhuǎn)相)。轉(zhuǎn)相之后，且如果需要，將乳劑通過添加以獲得期望的濃度的油的水溶液來稀釋為最終乳劑?？捎诩s5℃存儲(chǔ)乳劑。在另一實(shí)施方式中，可于高于乳劑pit的溫度制備乳劑。在第1步驟中，將水相和油相于高于乳劑pit的溫度混合在一起。優(yōu)選將水溶液漸進(jìn)地添加到油?？烧{(diào)整油/水溶液比，以獲得油包水(w/o)乳劑，例如以約40％～約55％濃度的油(v/v)。乳化可通過用低或無剪力，例如用靜態(tài)混合器或海洋螺旋或用非常低旋轉(zhuǎn)速度的渦輪攪拌來進(jìn)行。獲得的乳劑是油包水(w/o)乳劑。在第2步驟中，將乳劑漸進(jìn)地冷卻到pit以下。此步驟期間，乳劑變化為o/w乳劑(轉(zhuǎn)相)。轉(zhuǎn)相之后，且如果需要，將乳劑通過添加以獲得期望的濃度的油的水溶液來稀釋為最終乳劑?？捎诩s5℃存儲(chǔ)乳劑。乳劑中滴的尺寸可約100nm～約500nm。乳劑可，例如，作為佐劑使用，以配制疫苗組合物或藥物組合物。也可將乳劑用作溶劑，以溶解干燥的產(chǎn)品，尤其是含有，例如，減毒的微生物或活重組載體的干產(chǎn)品。在特定實(shí)施方式中，用僅一部分水溶液產(chǎn)生預(yù)制乳劑。此預(yù)制乳劑可通過添加活性成分諸如藥物或免疫原，優(yōu)選免疫原的懸浮液來稀釋，以獲得最終組合物?；蛘撸A(yù)制乳劑可用水溶液稀釋，及用于溶解干燥的產(chǎn)品諸如干產(chǎn)品。適合于在本發(fā)明中使用的免疫原或抗原可選自：滅活的病原體，減毒的病原體，免疫原性亞-單元(例如蛋白,多肽,肽,表位,半抗原)或重組表達(dá)載體，包括具有免疫原性插入子的質(zhì)粒。在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，免疫原是滅活的或殺死的微生物。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，疫苗組合物包含選自禽病原體的免疫原，所述病原體包括但不限于鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)，腸炎沙門氏菌(salmonellaenteritidis)，感染性支氣管炎病毒(ibv)，新城疫病毒(ndv)，蛋產(chǎn)量下降綜合征病毒(eds)，或感染性法氏囊病病毒(ibdv)，禽流感病毒，等，及其組合。替代性地，疫苗組合物包含選自貓病原體的免疫原，所述病原體諸如但不限于貓皰疹病毒(fhv)，貓杯狀病毒(fcv)，貓白血病病毒(felv)，貓免疫缺陷病毒(fiv)，狂犬病病毒等，及其組合。在再一實(shí)施方式中，本發(fā)明的疫苗組合物包含選自狗病原體的免疫原，所述病原體包括但不限于狂犬病病毒，狗皰疹病毒(chv)，狗細(xì)小病毒(cpv)，狗冠狀病毒，犬鉤端螺旋體(leptospiracanicola)，黃疸出血型鉤端螺旋體(leptospiraicterohaemorrhagiae)，感冒傷寒型鉤端螺旋體(leptospiragrippotyphosa)，博氏疏螺旋體(borreliaburgdorferi)，支氣管炎博德特菌(bordetellabronchiseptica)等，及其組合。在本發(fā)明的再一實(shí)施方式中，組合物包含選自馬病原體的免疫原，所述病原體諸如馬皰疹病毒(1型或4型)，馬流感病毒，破傷風(fēng)，西尼羅河病毒，等或其組合。在本發(fā)明的再一實(shí)施方式中，組合物包含選自牛病原體的免疫原，所述病原體諸如口蹄疫病毒(fmdv)，狂犬病病毒，牛輪狀病毒，3型牛副流感病毒(bpiv-3)，牛冠狀病毒，牛病毒腹瀉病毒(bvdv)，牛呼吸道合胞體病毒(brsv)，感染性牛鼻氣管炎病毒(ibr)，大腸埃希氏菌(escherichiacoli)，多殺巴斯德菌(pasteurellamultocida)，溶血性巴斯德菌(pasteurellahaemolytica)等和其組合。在本發(fā)明的再一實(shí)施方式中，組合物包含選自豬病原體的免疫原，所述病原體諸如但不限于豬流感病毒(siv)，2型豬圓環(huán)病毒(pcv-2)，豬生殖呼吸性綜合征病毒(prrs)，假性狂犬病病毒(prv)，豬細(xì)小病毒(ppv)，fmdv，豬肺炎支原體(mycoplasmahyopneumoniae)，紅班丹毒絲菌(erysipelothrixrhusiopathiae)，多殺巴斯德菌(pasteurellamultocida)，支氣管炎博德特菌(bordetellabronchiseptica)，大腸埃希氏菌(escherichiacoli)等，及其組合。本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供包含藥學(xué)可接受的媒質(zhì)中的至少一種免疫原和乳劑的疫苗組合物。包含病毒，細(xì)菌，真菌等的免疫原可通過體外培養(yǎng)方法使用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基或宿主細(xì)胞系和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法產(chǎn)生。例如，prrs可在適當(dāng)?shù)募?xì)胞系，諸如ma-104細(xì)胞系中培養(yǎng)(尤其見美國(guó)專利系列no.5,587,164；5,866,401；5,840,563；6,251,404)。以類似方式，pcv-2可使用pk-15細(xì)胞系培養(yǎng)(見美國(guó)專利系列no.6,391,314)；siv可培養(yǎng)于蛋(美國(guó)專利系列no.6.048.537)；及豬肺炎支原體(mycoplasmahyopneumoniae)可培養(yǎng)于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(美國(guó)專利系列no.5,968,525；us5.338.543；rossr.f.等人,am.j.vet.res.,1984,45：1899-1905)。為了獲得滅活的免疫學(xué)，或疫苗組合物，病原體優(yōu)選在收獲之后滅活及，任選地，利用化學(xué)處理使用，例如，福爾馬林或甲醛，β-丙內(nèi)酯，乙烯亞胺，二元乙烯亞胺(bei)，和/或物理處理(例如熱處理或超聲處理)來使經(jīng)歷澄清。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知滅活方法。例如，fmd病毒可通過乙烯亞胺(cunliffe,hr,appliedmicrobiology,1973,p.747-750)或通過高壓(ishimaruetal.,vaccine22(2004)2334–2339)滅活，prrs病毒可通過β-丙內(nèi)酯處理(plana-duran等人,vet.microbiol.,1997,55：361～370)或通過bei處理(美國(guó)專利系列no.5,587,164)滅活；pcv-2病毒的滅活可使用乙烯亞胺處理或通過β-丙內(nèi)酯處理來實(shí)現(xiàn)(美國(guó)專利系列no.6,391,314)；豬流感病毒可使用去污劑如triton，或用甲醛處理來滅活(美國(guó)專利系列no.6,048,537)；豬肺炎支原體(mycoplasmahyopneumoniae)細(xì)菌可通過甲醛處理(rossr.f.見上)，通過乙烯亞胺或bei處理來滅活(見wo91/18627)。滅活的病原體可通過常規(guī)濃度技術(shù)，尤其是通過超濾濃縮，和/或通過常規(guī)純化手段純化，尤其是使用層析技術(shù)包括但不限于凝膠-過濾，在蔗糖梯度上的超速離心，或選擇性沉淀，尤其是在聚乙二醇(peg)的存在下。在根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物中有用的免疫原也包括表達(dá)載體。該載體包括，但不限于，體內(nèi)重組表達(dá)載體諸如多核苷酸載體或質(zhì)粒(ep-a2-1001025；chaudhurip,res.vet.sci.2001,70:255-6)，病毒載體諸如但不限于腺病毒載體，痘病毒載體諸如雞痘(美國(guó)專利系列no.5,174,993；5,505,941；及5,766,599)或金絲雀痘載體(美國(guó)專利系列no.5,756,103)或細(xì)菌載體(大腸埃希氏菌(escherichiacoli)或沙門氏菌屬(salmonellasp.))。本發(fā)明也包括多價(jià)免疫學(xué)組合物或組合疫苗組合物的制劑。例如，根據(jù)本發(fā)明制備的組合牛細(xì)菌苗中有用的抗原包括，但不限于，牛支原體(mycoplasmabovis)，巴斯德菌屬(pasteurellasp.)，特別多殺巴斯德菌(p.multocida)及溶血性巴斯德菌(p.haemolytica)，嗜血桿菌屬(haemophilussp.)，特別睡眠嗜血桿菌(h.somnus)，梭菌屬(clostridiumsp.)，沙門氏菌屬(salmonella)，棒桿菌屬(corynebacterium)，鏈球菌屬(streptococcus)，葡萄球菌屬(staphylococcus)，莫拉菌屬(moraxella)，大腸埃希氏菌(e.coli)等。本發(fā)明還提供在宿主，例如，動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括給宿主施用本發(fā)明的免疫學(xué)組合物或疫苗組合物。以此方式引發(fā)的免疫應(yīng)答顯著地是抗體和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，及尤其是，γ-干擾素應(yīng)答。尤其是，本發(fā)明提供針對(duì)，或防止或減少通過動(dòng)物被病原性生物的感染(例如,通過病毒,細(xì)菌,真菌或原生動(dòng)物寄生蟲感染)導(dǎo)致的癥狀免疫的方法。本發(fā)明的方法在下列脊椎動(dòng)物中有用，包括但不限于人，狗(例如,狗)，貓(例如,貓)；馬(例如,馬)，牛(例如,牛)和豬動(dòng)物(例如,豬)，以及禽，包括但不限于雞，火雞，鴨，鵝，鵪鶉，雉雞，鸚鵡，雀，鷹，烏鴉和平胸鳥(鴕鳥,鴯鹋,鶴鴕,等)。在本發(fā)明的特定方面，這些方法由在分娩之前通過施用根據(jù)本發(fā)明制備的疫苗組合物給懷孕的雌性疫苗接種組成。這些方法還包括：通過疫苗接種流程引發(fā)的保護(hù)性抗體的誘導(dǎo)和這些保護(hù)性抗體從免疫接種的懷孕的雌性到它們的后代的轉(zhuǎn)移。該母源抗體的轉(zhuǎn)移隨后保護(hù)后代免于疾病。根據(jù)本發(fā)明制造的疫苗組合物的劑量會(huì)依賴于待免疫接種的動(dòng)物的物種，品種，齡，尺寸，疫苗接種歷史，及健康狀態(tài)。其他因素如抗原濃度，額外的疫苗組分，及施用途徑(即,皮下,真皮內(nèi),口腔,肌內(nèi)或靜脈內(nèi)施用)也會(huì)影響有效劑量。待施用的疫苗劑量可基于疫苗的抗原濃度，施用途徑，及待免疫接種的動(dòng)物的齡和病情容易測(cè)定。各批的抗原可個(gè)別校準(zhǔn)。或者，無需過度實(shí)驗(yàn)，不同劑量的系統(tǒng)免疫原性試驗(yàn)，以及l(fā)d50研究和其他篩選過程可用于測(cè)定根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物的有效劑量。從以下顯示的實(shí)施例，容易得知何近似的劑量及和何近似的體積對(duì)于使用本文所述的疫苗組合物適當(dāng)。關(guān)鍵因素是劑量提供至少部分針對(duì)天然的感染的保護(hù)性效應(yīng)，如通過與天然的感染關(guān)聯(lián)的死亡率和病態(tài)的減小所證明。適當(dāng)?shù)捏w積同樣由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易查明。例如，在禽物種中，劑量體積可約0.1ml～約0.5ml及，有利地，約0.3ml～約0.5ml。對(duì)于貓，狗和馬物種，劑量體積可約0.2ml～約3.0ml，有利地約0.3ml～約2.0ml，及更有利地，約0.5ml～約1.0ml。對(duì)于牛和豬物種，劑量體積可約0.2ml～約5.0ml，有利地約0.3ml～約3.0ml，及更有利地0.5ml～約2.0ml。重復(fù)的疫苗接種可優(yōu)選為周期性時(shí)間間隔，以起初增強(qiáng)免疫應(yīng)答或當(dāng)自最后劑量起長(zhǎng)時(shí)間逝去。在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，作為腸胃外注射(即,皮下,真皮內(nèi)或肌內(nèi))施用疫苗組合物。組合物可作為一個(gè)劑量施用，或在替代實(shí)施方式中，以約2～約6周，優(yōu)選約2～約5周的間隔提供的約2～約5個(gè)劑量的重復(fù)的劑量施用。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)真可，劑量數(shù)和疫苗接種之間的時(shí)間間隔依賴于許多因素，包括但不限于免疫接種的動(dòng)物齡；動(dòng)物情況；免疫途徑；每劑量可利用的抗原量；等。對(duì)于初始疫苗接種，周期通常會(huì)相比1周更長(zhǎng)，且優(yōu)選會(huì)在約2～約5周之間。對(duì)于之前免疫接種的動(dòng)物，追加疫苗接種，懷孕之前或期間，可以約每年間隔進(jìn)行。本發(fā)明也涵蓋使用無針注射器諸如或(bioject,oregon,usa)施用疫苗組合物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能無需過度實(shí)驗(yàn)，關(guān)于因素諸如待免疫接種的動(dòng)物的物種；動(dòng)物的齡和重量，等需要調(diào)整注射器的規(guī)格。在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，方法包括用本發(fā)明的乳劑配制的疫苗組合物的單次施用。例如，在一實(shí)施方式中，疫苗組合物是滅活的fmd病毒組合物，而替代實(shí)施方式提供包含滅活的pcv2病毒組合物的疫苗。其他免疫學(xué)組合物或疫苗適合于在單劑量方案中使用，包括但不限于滅活的豬肺炎支原體(mycoplasmahyopneumoniae)，prrs和siv。本發(fā)明還涉及治療宿主，例如，動(dòng)物的方法，包括給宿主施用根據(jù)本發(fā)明制備及包含至少一種選自下列的免疫原的藥物組合物：蛋白或肽，滅活的或減毒的病毒，抗體，過敏原，cpgodn，生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子或抗生素，及尤其是cpgodn或細(xì)胞因子。這些藥物組合物可用于改善動(dòng)物諸如雞，豬，牛(cow)或牛(cattle)的生長(zhǎng)性。本發(fā)明還涉及試劑盒，起包含含有與根據(jù)本發(fā)明制備的乳劑組合的成分諸如純化的免疫原的單個(gè)瓶。試劑盒可替代性地包含第1瓶，起含有與皂苷和氫氧化鋁組合的成分諸如免疫原或藥物組合物，及第2瓶，起含有根據(jù)本發(fā)明制備的乳劑。免疫原可為本文所述的干形式，干燥的形式或水溶液。以下通過下列非限制性實(shí)施例的方式進(jìn)一步描述本發(fā)明。【實(shí)施例】【實(shí)施例1：乳劑制備方法】通過轉(zhuǎn)相方法制備乳劑。在第1步驟中，將水相和油相于+40℃混合在一起。在第2步驟中，將乳劑漸進(jìn)地冷卻到+5℃pit以下，以便獲得o/w乳劑。轉(zhuǎn)相之后，將最終乳劑(即疫苗制劑)混合及隨后存儲(chǔ)于+5℃(總結(jié)于表1)。表1*濃度/量范圍○氫氧化鋁-約0.0％～約1.0％(w/v)，相對(duì)于疫苗制劑體積○皂苷-約0.1mg～約2mg/ml疫苗制劑○抗原-約0.1μg～約200μg/ml疫苗制劑○m102&磷酸鹽到體積將山梨糖醇酐單油酸酯(span)和山梨糖醇酐三油酸酯(20oe)(tween)引入油相。山梨糖醇酐單油酸酯(20oe)(tween)在石蠟油中不混溶。在相同的緩沖劑(例如，磷酸二鈉單鉀0.02m等滲緩沖劑(ph7.8))中作為疫苗制備tween的20％(w/v)溶液。當(dāng)攪拌停止時(shí)，乳劑變化為水包油乳劑。將乳劑放入5℃的冷室至少4小時(shí)。在此階段，乳劑是含有50％的油相的預(yù)制乳劑。第2步驟：用含免疫原(滅活的fmdv,豬肺炎支原體(mycoplasmahyopneumoniae)免疫原,或pcv-2免疫原,以上描述的)，皂苷和氫氧化鋁的120ml的磷酸二鈉單鉀0.02m等滲緩沖劑ph7.8制備水相#2。將在第1步驟中制備的預(yù)制乳劑冷卻到約5℃，通過添加半體積的水相#2，于相同的溫度稀釋，及通過旋轉(zhuǎn)磁條1分鐘來混合。tsap乳劑中的最終表面活性劑濃度是4.75％(w/v)。一般而言，以下列順序加入本文公開的疫苗制劑的組分：(1)介質(zhì)102于5℃，(2)皂苷，(3)氧化鋁氫氧化物，(4)抗原和(5)不完全的乳劑(即油相加水相#1的組合)。如本文制備，tsap疫苗于5℃穩(wěn)定達(dá)36個(gè)月。使用相同的制備方法，其他乳劑可如以下預(yù)示例中描述獲得：【tsap-2乳劑】tsap-2乳劑是含有33％的油相的o/w乳劑。油相(120ml)含有marcol88％v/v，span1.8％w/v和tween10.2％w/v。水相#1(120ml)含有磷酸二鈉單鉀0.02m等滲緩沖劑(ph7.8)97.75％v/v，及l(fā)utrol0.75％w/v。水相#2(120ml)由磷酸二鈉單鉀0.02m等滲緩沖劑(ph7.8)，皂苷，氫氧化鋁構(gòu)成，及任選地含有免疫原。tsap-2乳劑中的最終表面活性劑濃度是約4.25％w/v。【tsap-3乳劑】tsap-3乳劑是含有50％的油相的o/w乳劑。油相(160ml)含有marcol92％v/v，span1.8％w/v和brij6.2％w/v。水相#1(160ml)含有磷酸二鈉單鉀0.02m等滲緩沖劑(ph7.8)98.5％v/v，及l(fā)utrol0.5％w/v，皂苷，氫氧化鋁，及任選地含有免疫原。tsap-3乳劑中的最終表面活性劑濃度是約4.25％w/v。【tsap-4乳劑】tsap-4乳劑是含有10％的油相的o/w乳劑。油相(120ml)含有marcol60％v/v，span17.2％w/v和arlatone22.8％w/v。水相#1(120ml)含有磷酸二鈉單鉀0.02m等滲緩沖劑(ph7.8)97.5％v/v和tween2.5％w/v。用400ml的磷酸二鈉單鉀0.02m等滲緩沖劑ph7.8，皂苷，氫氧化鋁，及任選地含有免疫原的制備水相#2。將100ml的預(yù)制乳劑用400ml的水相#2稀釋而獲得tsap-3乳劑。tsap-4乳劑中的最終表面活性劑濃度是4.25％w/v?！緦?shí)施例2：乳劑的轉(zhuǎn)相溫度(pit)的確定】將10ml的tsap乳劑放入在約25℃溫度的水-浴中的玻璃管。tsap乳劑是白色均質(zhì)乳劑。水浴中的溫度漸進(jìn)地增加。視覺觀察乳劑中的變化(乳劑由于黃-棕色油相向表面的遷移而成為2個(gè)分離的相)。此變化是乳劑分層的特征。觀察到此變化的溫度是乳劑的pit值。對(duì)于tsap乳劑，pit是約36℃～46℃。圖1～5提供對(duì)根據(jù)本發(fā)明制備的疫苗制劑的pit確定圖(1年穩(wěn)定性研究)。圖6提供對(duì)根據(jù)本發(fā)明制備及存儲(chǔ)36個(gè)月的疫苗制劑的pit確定圖(3年穩(wěn)定性研究)?！緦?shí)施例3：研究#1：根據(jù)實(shí)施例1制備的疫苗制劑的穩(wěn)定性】此表顯示根據(jù)在實(shí)施例1中描述的方法制備的疫苗制劑的穩(wěn)定性(即制劑保持水包油乳劑的以月計(jì)算的時(shí)間)。制劑包含指示的成分(見制劑1～13)，及用于各這些制劑的抗原包含被認(rèn)為中度到高度純化的滅活的fmd病毒分離物。如表2顯示，氫氧化鋁的存在提供增加的疫苗穩(wěn)定性，尤其當(dāng)使用抗原的最高濃度時(shí)(將制劑9,11和13的增強(qiáng)的穩(wěn)定性與在12個(gè)月的制劑3,5和7相對(duì)減少的穩(wěn)定性比較)。平均起來，含有更高抗原的制劑(即制劑9,11和13)中氫氧化鋁的存在增加油/水穩(wěn)定性時(shí)間從約3～6個(gè)月(即對(duì)于制劑3,5和7觀察到的油/水穩(wěn)定性)到約12個(gè)月(即對(duì)制劑9,11觀察到的油/水穩(wěn)定性)，或甚至到約24個(gè)月(即對(duì)于制劑13觀察到的油/水穩(wěn)定性)。表2試驗(yàn)12345678910111213抗原(μg/劑量)0156015601560156015601560皂苷(mg/劑量)0000.50.511000.50.511al(oh)3(％最終)00000000.3.3.3.3.3數(shù)劑量75757575757575757575757575t0moso/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wt3moso/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wt6moso/wo/ww/oo/ww/oo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wo/wt9moso/wo/ww/oo/ww/oo/ww/oo/wo/wo/wo/wo/wo/wt12moso/wo/ww/oo/ww/oo/ww/oo/wo/wo/wo/wo/wo/wt24moso/wo/ww/oo/ww/oow/w/oo/ww/oo/ww/oo/wo/w【實(shí)施例4：研究#2：根據(jù)實(shí)施例1制備的疫苗制劑的穩(wěn)定性】如在實(shí)施例1中所述及根據(jù)表3中顯示的組分量制備疫苗制劑。如前所述，組分的添加順序是：(1)介質(zhì)102，(2)皂苷，(3)氧化鋁氫氧化物，(4)純化的抗原，及(5)不完全的乳劑(在實(shí)施例1中，不完全的乳劑定義為油相加水相#1)。純化的抗原是fmdv抗原o1campos，a24cruzeiro和c3indaial。使用介質(zhì)102(m102,以下顯示的處方)調(diào)整總體積。表3表4組分描述1l的m102濃儲(chǔ)物溶液mgcl295170mmkcl190400mmcacl2238260mmchcl35ml純丙氨酸276g-葡萄糖18804500mm碳酸氫鈉21802540mm胨3000g-乳清蛋白水解產(chǎn)物4000g-根據(jù)表5測(cè)定疫苗穩(wěn)定性。表5*對(duì)于無氧化鋁凝膠的疫苗**在穩(wěn)定性研究結(jié)尾實(shí)施的對(duì)照對(duì)于各疫苗制劑，如在實(shí)施例2中所述測(cè)定轉(zhuǎn)相溫度(pit)。以“血紅細(xì)胞凝集素單位”(uh)/疫苗劑量顯示添加的抗原量。表6總結(jié)pit數(shù)據(jù)及顯示，pit保持基本穩(wěn)定達(dá)36個(gè)月。圖6提供對(duì)試驗(yàn)1～10的疫苗制劑的通過導(dǎo)電率的pit確定的圖(總結(jié)于表6)。用皂苷-輔佐的制(即試驗(yàn)3,4,6,7,9和10)劑觀察到的pit的增加獨(dú)自構(gòu)成相對(duì)于非-皂苷-輔佐的制劑(即試驗(yàn)2,5和8)的穩(wěn)定性的改善。表6乳劑的粒子粒度分布(表7)在36個(gè)月時(shí)期保持在研究標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定的范圍之內(nèi)。表7【實(shí)施例5：在施用多劑量的用tsap乳劑輔佐的口蹄疫(fmd)病毒疫苗之后的血清學(xué)結(jié)果-牛研究】材料和方法：將12～14月齡，未免疫接種及無fmd抗體的90頭牛選擇，隨機(jī)化及分配為待免疫接種的9只動(dòng)物的10個(gè)組。將動(dòng)物用指示的疫苗制劑(9807-9814)在第1天免疫接種。根據(jù)實(shí)施例1制備表8，9，10和11中列的各制劑，并包含在實(shí)施例1中提到的全部組分，如下改變?cè)碥蘸蜌溲趸X量：皂苷的量為0，0.7，1.3或2.7mg/劑量，且algel氫氧化鋁的量為0％或0.37％。將8組通過肌內(nèi)途徑免疫接種(im組)，將2組通過皮下途徑免疫接種(sc組)。將im組的各動(dòng)物用相應(yīng)疫苗在第56天通過肌內(nèi)途徑及在第84天通過皮下途徑再疫苗接種。將sc組的各動(dòng)物用相應(yīng)疫苗在第56和84天通過皮下途徑再疫苗接種。表8總結(jié)疫苗制劑的穩(wěn)定性。表8通過肌內(nèi)途徑第1疫苗接種之后無任何損傷。通過肌內(nèi)途徑第2疫苗接種之后有一些損傷，但全部這些損傷在通過肌內(nèi)途徑第2疫苗接種之后28天后退去。表9總結(jié)疫苗制劑的安全性，如在特定的日期通過動(dòng)物體重測(cè)量顯示。表9結(jié)果：表10總結(jié)實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)期間收集的血清學(xué)數(shù)據(jù)。o1campos，a24cruzeiro和c3indaial是fmd病毒的3個(gè)獨(dú)立血清型，且o1，a24和c3抗體的存在是疫苗制劑在受疫苗接種者中引發(fā)免疫應(yīng)答的陽性指示。“g1”表示肌內(nèi)施用疫苗制劑，“g2”表示皮下施用疫苗制劑。對(duì)于本發(fā)明，特別對(duì)于fmd病毒抗原，有抗體滴度(即o1campos,a24cruzeiro和c3indaial的血清水平)和相當(dāng)?shù)娜罕Ｗo(hù)(epp)數(shù)之間的強(qiáng)的，直接關(guān)聯(lián)。簡(jiǎn)言之，當(dāng)抗體滴度高時(shí)，免疫接種動(dòng)物被相應(yīng)地高度保護(hù)免于病毒感染。意外地，氫氧化鋁的存在相關(guān)于依賴于施用途徑的免疫應(yīng)答中的顯著差異。當(dāng)氫氧化鋁存在時(shí)，如在制劑9812g1和9812g2中，當(dāng)皮下施用疫苗制劑時(shí)，有受疫苗接種者免疫應(yīng)答的顯著增加，如通過抗體滴度測(cè)量。對(duì)于不含有氫氧化鋁，即9811g1和9811g2的對(duì)應(yīng)疫苗制劑，無由于施用途徑的功效的類似顯著差異。目前不知道此由于氫氧化鋁存在同時(shí)皮下施用途徑的使用的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答的原因，但本發(fā)明的有效實(shí)施方式可包括，但不以任何方式限于，依賴于當(dāng)前和未來功效(例如抗體滴度)數(shù)據(jù)改變疫苗施用途徑。相比非-皂苷-輔佐的對(duì)照疫苗制劑(即9807&9808)，皂苷-輔佐的疫苗制劑在研究動(dòng)物中引發(fā)針對(duì)全部3種fmd病毒抗原的更快速免疫應(yīng)答，如在第21天皂苷-輔佐的制劑的更高平均抗體滴度顯示。總之，證據(jù)表明，本發(fā)明提供改善的穩(wěn)定性及致使相比非-皂苷輔佐的制劑更快速免疫應(yīng)答。表10g1-疫苗制劑肌內(nèi)施用g2-疫苗制劑皮下施用【實(shí)施例6：在施用2劑量的用tsap乳劑輔佐的口蹄疫(fmd)病毒疫苗之后的血清學(xué)結(jié)果-豬研究】材料和方法：將未免疫接種及無fmd抗體的57頭豬選擇，隨機(jī)化及分配為待免疫接種的6只動(dòng)物的9個(gè)組及不待免疫接種的3只動(dòng)物的1個(gè)組(非-免疫接種的動(dòng)物)。將動(dòng)物用指示的疫苗制劑(a-i)在第1天免疫接種。根據(jù)實(shí)施例1制備表11中列的各制劑，并包含在實(shí)施例1中提到的全部組分，皂苷和氫氧化鋁如下改變：皂苷的量是0，0.7，1.3或2.7mg/劑量，algel氫氧化鋁的量是0％或0.37％。通過測(cè)量包括直腸溫度和動(dòng)物對(duì)疫苗接種的反應(yīng)的視覺標(biāo)志的幾個(gè)參數(shù)來評(píng)定疫苗制劑安全性。表11結(jié)果：全部含有抗原的疫苗制劑(表11中描述的制劑b-i)在測(cè)試動(dòng)物中誘導(dǎo)顯著大于由無抗原對(duì)照(表11中描述的制劑i)誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答的抗體應(yīng)答。含有皂苷的制劑相比不含有皂苷的制劑誘導(dǎo)相對(duì)更大抗體應(yīng)答。表12總結(jié)抗體滴度數(shù)據(jù)，及重述各制劑的抗原，皂苷和氫氧化鋁的量。尤其是，抗體滴度數(shù)據(jù)表明，相對(duì)于不含有皂苷的疫苗制劑，疫苗制劑中存在約0.7mg/劑量和約2.7mg/劑量之間的皂苷增加抗體應(yīng)答。表12【實(shí)施例7：豬中3種實(shí)驗(yàn)fmd疫苗的保護(hù)性劑量50％(pd50)的確定】概觀.研究的目的是測(cè)試本發(fā)明的3種實(shí)驗(yàn)fmd疫苗制劑的在豬中針對(duì)fmd強(qiáng)毒攻擊的功效。分別用無抗原(a)，及改變劑量的用本發(fā)明的佐劑配制的滅活的純化的fmdo1manisa抗原(疫苗b,c和d)制備4種疫苗(a,b,c和d)。疫苗提供為填充到25ml的30ml瓶，劑量是2ml/劑量。攻擊株是fmdo1manisa，4494024d：911，20-07-1994(起已原本分離為o1manisaturkey1/78)，且次級(jí)豬腎細(xì)胞中的滴度是7.67log10tcid50/ml。用于攻擊株的稀釋劑是含標(biāo)準(zhǔn)抗生素的hanksmem，2％胚胎牛血清(fbs)。過程.將無fmdv及未之前針對(duì)fmd免疫接種的豬用于研究。在實(shí)驗(yàn)過程前將10周(加或減1周)齡的各47頭豬習(xí)服至少24小時(shí)。將豬每室圈養(yǎng)2～3只動(dòng)物，及飼喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及使隨意飲水。在第1天(d1)，將豬(無論性別)分配到3只動(dòng)物的15個(gè)組和2只動(dòng)物的1個(gè)組。將各組在一特定室內(nèi)圈養(yǎng)，及在各室內(nèi)，將動(dòng)物用木板(1.5m)個(gè)別隔離免于攻擊，直到完成研究。在d0，將動(dòng)物在左側(cè)耳之后用個(gè)體注射器根據(jù)表13和14肌內(nèi)免疫接種。疫苗接種之前，將疫苗瓶輕輕倒置約10次，以確保均質(zhì)懸浮液。表13-疫苗組合物表14-疫苗接種總結(jié)組疫苗劑量注射的疫苗體積(ml)#豬b1b劑量2.03b2b1/2劑量13b3b1/4劑量0.53b4b1/8劑量0.253b5b1/16劑量0.133c1c劑量2.03c2c1/2劑量13c3c1/4劑量0.53c4c1/8劑量0.253c5c1/16劑量0.133d1d劑量2.03d2d1/2劑量13d3d1/4劑量0.53d4d1/8劑量0.253d5d1/16劑量0.133(對(duì)照)122攻擊.在d28，稀釋o型fmd病毒以獲得100,000tcid50/ml(將病毒濃儲(chǔ)物稀釋2.67log10,或468倍)。在同日，通過施用stressnil(1ml/20kg)和氯胺酮(2ml/20kg)通過im途徑麻醉全部動(dòng)物，及用10,000tcid50的病毒在0.1ml下通過真皮內(nèi)途徑攻擊到左后足的外爪足跟小球內(nèi)。從d0到d28每天檢查動(dòng)物的一般健康。注意任何臨床觀察和治療。攻擊之后，每天觀察動(dòng)物持續(xù)7天(d29～d35)。以相同的順序進(jìn)行觀察，開始于有用最高劑量免疫接種的動(dòng)物的室到有用最低劑量免疫接種的動(dòng)物的室，及結(jié)束于對(duì)照(組a)。每天檢查一般健康，特別注意鼻及足上的fmd的跡象。在疫苗接種前(在d1或d0)，攻擊之前及在研究結(jié)束時(shí)d14和d28自各動(dòng)物收集血。將樣品熱滅活(56℃持續(xù)30分鐘)，并通過vn測(cè)試在全部血清中測(cè)定o型fmdvab滴度(merialr&d,lelystad)。在d36(觀察時(shí)期結(jié)束)，將動(dòng)物安樂死(4～6ml/50kgivt61)和緊密檢查fmdv跡象。將用全劑量的疫苗免疫接種的組(組b1,c1或d1)中觀察到的任何損傷采樣及于-70℃冷凍而用于進(jìn)一步病毒分型。在鼻，口和/或足(除了接種的足的主爪)上損傷的存在被認(rèn)為是fmd的證據(jù)。由于符合標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)試被認(rèn)為有效，這顯示兩個(gè)對(duì)照豬必顯示fmd臨床體征。通過spearmankarber方法計(jì)算各疫苗的pd50。結(jié)果.效力對(duì)比凈荷顯示于圖9，并將關(guān)聯(lián)研究數(shù)據(jù)數(shù)值總結(jié)于以下表15和16。表15表16使用邏輯回歸的疫苗效力的計(jì)算疫苗凈荷(μg)pd50ic95-ic95+b0.43.5941.60462.896c24.58211.70212.6979d1011.79.53351.55當(dāng)前第1頁12