本發(fā)明涉及醫(yī)療藥物領(lǐng)域，具體涉及一種透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

靶向給藥系統(tǒng)是藥劑學(xué)研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一。靶向給藥能夠選擇性的將藥物輸送至靶標(biāo)位置，增加療效的同時(shí)減少藥物對(duì)正常組織的毒副作用。透明質(zhì)酸(ha)是一種由n-乙酰-d-葡萄糖胺和d-葡萄糖醛酸經(jīng)β-1,4糖苷鍵連接而成的線性高分子氨基葡聚糖。目前研究采用高分子量透明質(zhì)酸作為主動(dòng)靶向因子，與腫瘤細(xì)胞表面的cd44受體特異性結(jié)合，介導(dǎo)藥物進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)釋放藥物。ha具有很多優(yōu)勢(shì)：水溶性好，生物可降解，生物相容性好，無毒，無免疫原性，容易進(jìn)行化學(xué)修飾等。

在傳統(tǒng)的臨床實(shí)踐中，疾病的診斷和治療是兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的過程。然而，診斷用造影劑和治療用藥的分別使用會(huì)帶來用藥的副作用疊加，貽誤治療時(shí)期以及增加患者用藥痛苦等缺點(diǎn)。為此，在臨床醫(yī)生和科研工作者的共同努力下，治療診斷學(xué)(theranostics)作為一種新理念逐漸發(fā)展起來。治療診斷學(xué)是一種將藥物治療與診斷相結(jié)合的手段，個(gè)性化地對(duì)病人同時(shí)實(shí)現(xiàn)治療和診斷，可以提高診斷效率，減少對(duì)人體的毒副作用，以達(dá)到事半功倍的效果。同時(shí)應(yīng)用于診斷和治療的試劑稱為治療診斷一體化試劑(theranosticagent)，該類試劑能夠?qū)崟r(shí)診斷病情并同步進(jìn)行治療的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)使其成為治療癌癥的新策略。

微泡具有良好的回聲效果，被應(yīng)用為超聲造影劑，但是微泡的粒徑過大和不穩(wěn)定性限制了它在超聲造影方面的應(yīng)用。近年來，為了解決超聲微泡粒徑過大和不穩(wěn)定問題，出現(xiàn)了一種相變液態(tài)氟碳納米球。相變液態(tài)氟碳納米球粒徑小，可穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞到達(dá)血管外靶標(biāo)；與微泡相比，穩(wěn)定性較好，在聚焦超聲，激光以及加熱條件下可以發(fā)生液-氣轉(zhuǎn)變而進(jìn)行超聲成像。盡管具有很多優(yōu)點(diǎn)，相變液態(tài)氟碳納米球仍然存在穩(wěn)定性不高的問題，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，相變液態(tài)氟碳納米球在儲(chǔ)存過程中會(huì)出現(xiàn)液-氣相變；在進(jìn)入體循環(huán)后，在到達(dá)靶部位之前，出現(xiàn)過早的相變。因此，需要制備一種更為穩(wěn)定，粒徑在納米級(jí)的相變超聲造影劑。

無機(jī)硅材料具有良好的生物相容性，穩(wěn)定性。有文獻(xiàn)報(bào)道，中空微球具有超聲成像效果而作為超聲造影劑，但粒徑在微米級(jí)，不能通過epr效應(yīng)到達(dá)腫瘤部位。近年來，硅包裹的液態(tài)氟碳相變納米球被報(bào)道用做超聲造影劑，該造影劑可通過epr效應(yīng)到達(dá)腫瘤部位，然后在聚焦超聲的作用下發(fā)生液-氣轉(zhuǎn)變，產(chǎn)生造影效果，但是制備該造影劑的工藝復(fù)雜，并且會(huì)加入有毒的表面活性劑。

在本發(fā)明中采用硅沉積法所制備的一種透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑粒徑較小，可通過腫瘤部位epr效應(yīng)實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向。同時(shí)，修飾的透明質(zhì)酸又可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)靶向，從而可降低該制劑的毒副作用，并增強(qiáng)藥物的療效。另一方面，與磷脂液態(tài)氟碳納米球相比，本發(fā)明制備的一種透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球具有良好的穩(wěn)定性和持久的超聲造影效果。采用溫和的硅沉積法制備一種透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑，工藝簡(jiǎn)單方便，所用的材料經(jīng)濟(jì)且生物相容性好，無有毒的表面活性劑的加入，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)磷脂液態(tài)氟碳納米球作為超聲造影劑穩(wěn)定性不好，現(xiàn)有硅包裹液態(tài)氟碳納米球工藝復(fù)雜的問題，以多西他賽為模型藥物，提供一種新的透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑及其制備方法。該新型載藥液——?dú)庀嘧兗{米球粒徑較小，可通過腫瘤部位epr效應(yīng)實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向。同時(shí)，修飾透明質(zhì)酸又可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)靶向，可降低該制劑的毒副作用，并增強(qiáng)藥物的治療作用。另一方面，與磷脂液態(tài)氟碳納米球相比，本發(fā)明制備的透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球具有良好的穩(wěn)定性和持久的超聲造影加效果。采用硅沉積法制備一種透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑，工藝簡(jiǎn)單方便，所用的材料經(jīng)濟(jì)且生物相容性好，無有毒的表面活性劑的加入，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

步驟1：稱取適量的大豆卵磷脂和藥物溶解于二氯甲烷，在減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，得到均勻的脂膜，然后加入一定量的水，震蕩或超聲使薄膜脫落，得到脂質(zhì)混懸液。

步驟2：將步驟1得到的脂質(zhì)混懸液用超聲波細(xì)胞破碎儀超聲10min，得到脂質(zhì)體，將該脂質(zhì)體于4℃冷卻。

步驟3：向步驟2得到的脂質(zhì)體加入一定量液態(tài)氟碳，冰浴條件下，用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲，即得到載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球。

步驟4：將步驟3得到的載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球分散在一定量的水中，用稀氨水調(diào)ph呈弱堿性，然后加入少量的硅酸四乙酯(teos)，冰浴攪拌反應(yīng)24小時(shí)，離心，除去未包載的藥物以及硅酸四乙酯的水解產(chǎn)物，將沉淀用水洗，再分散于水中，得到硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球混懸液。

步驟5：向步驟4制備的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球混懸液中加入3-氨丙基-三乙氧基硅烷(aptes)，并用稀氨水調(diào)ph呈弱堿性，攪拌反應(yīng)一段時(shí)間，得到氨基化的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球。

步驟6：取一定量的透明質(zhì)酸，溶解于水中。然后向透明質(zhì)酸的水溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)的水溶液，反應(yīng)一段時(shí)間，得到活化的透明質(zhì)酸。

步驟7：向步驟5得到的氨基化的硅包裹磷脂液態(tài)氟碳納米球混懸液和步驟6得到的活化透明質(zhì)酸溶液混合，反應(yīng)過夜，離心，沉淀用水洗3次，再分散于水中，得到透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑。

本發(fā)明應(yīng)用乳化法和硅沉積法成功制備了透明質(zhì)酸修飾的硅包裹磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑，具有合成工藝簡(jiǎn)單、耗時(shí)少、生物相容性好、高度特異性結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)例1中透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑電鏡圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑粒徑分布圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)例1透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑紅外圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)例2透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑體外加熱致相變顯微鏡觀察圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)例2透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑體外累積釋放圖。

圖6為本發(fā)明實(shí)例2透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑mtt實(shí)驗(yàn)細(xì)胞活力圖。

圖7為本發(fā)明實(shí)例2透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑體外顯影圖。

圖8為本發(fā)明實(shí)例2透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑體內(nèi)顯影圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明并不僅限于下述實(shí)施例。

實(shí)施例1

1.磷脂液態(tài)氟碳納米球的制備

將30mg大豆卵磷脂(spc)和3mg藥物溶于2ml二氯甲烷中。通過減壓蒸發(fā)快速除去二氯甲烷，形成脂膜。加入8ml磷酸鹽緩沖液(ph7.4)后，將脂質(zhì)膜在超聲波水浴中水合5分鐘，得到粗乳。將粗乳用超聲波細(xì)胞破碎儀超聲10min，并在4℃的冰箱中冷卻得到脂質(zhì)體。將0.06ml的pfp加入到脂質(zhì)體混懸液中，然后用超聲波細(xì)胞破碎器在冰浴條件下超聲5分鐘，得到載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球。

2.氨基化的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球的制備

將8ml磷脂液態(tài)氟碳納米球混懸液稀釋至24ml，用稀氨水調(diào)ph8.5，然后加入0.162ml硅酸四乙酯，冰浴攪拌反應(yīng)24小時(shí)，離心，用高效液相色譜法測(cè)量上清液藥物含量，測(cè)得藥物包封率86.70％±1.42％。沉淀再分散于24ml水中，用水調(diào)ph8.5，加入0.012ml3-氨丙基-三乙氧基硅烷(aptes)，攪拌反應(yīng)4小時(shí)，得到氨基化的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球。

3.透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑的制備

精密稱量11.3mg的透明質(zhì)酸溶解于6ml水中得到透明質(zhì)酸溶液。精密稱量37mg的nhs和20mgedc并溶解于2ml水中。將兩份溶液混合，攪拌反應(yīng)2小時(shí)得到活化的透明質(zhì)酸溶液。將活化的透明質(zhì)酸溶液與氨基化的硅包裹磷脂液態(tài)氟碳納米球混懸液混合，攪拌反應(yīng)過夜，離心，沉淀用水洗3次，得到透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑。

將制備成的透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑混懸液稀釋一定的倍數(shù)，用透射電鏡觀察其形態(tài)，如圖1所示，透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑為球體結(jié)構(gòu)。采用馬爾文激光粒度分析儀測(cè)量其粒徑，粒徑分布結(jié)果見圖2，透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑的平均粒徑為274.5±3.25nm。傅里葉紅外分析驗(yàn)證透明質(zhì)酸的成功修飾，如圖3所示，(a)表示硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球，在修飾氨基后，在1560cm^-1出現(xiàn)氨基的彎曲振動(dòng)峰，得到氨基化的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球(b)。將氨基化的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球透明質(zhì)酸修飾后得到透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑(c)，在(c)的紅外圖譜上出現(xiàn)透明質(zhì)酸的羥基峰3600cm^-1，以及形成的酰胺鍵的羰基峰1730cm^-1。

實(shí)施例2

1.透明質(zhì)酸修飾的硅包裹磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑體外加熱致相變顯微鏡觀察

將制備成的透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑混懸液加入到離心管中，然后將離心管進(jìn)入到水浴中，用溫度計(jì)監(jiān)測(cè)溫度，于不同溫度(25，35，45，55，65，70℃)下加熱5min，然后再光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)。結(jié)果見圖4，結(jié)果表明，當(dāng)溫度低于55℃，幾乎沒有氣泡產(chǎn)生。當(dāng)溫度升高至65℃，可觀察到少量氣泡，當(dāng)溫度升至70℃時(shí)，可觀察到大量氣泡。粒徑分析結(jié)果顯示，當(dāng)溫度從25加熱到55℃時(shí)，粒徑從280nm緩慢增加到526nm，當(dāng)溫度升高到65和75℃時(shí)，粒徑呈現(xiàn)不均勻分布，并且出現(xiàn)多峰，表明過度膨脹和破碎的透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑共存。

2.透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)

以多西他賽為模型藥物，將透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球，透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球+聚焦超聲，載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球，多西他賽原料藥進(jìn)行體外藥物釋放考察，如圖5所示，多西他賽原料藥由于其難水溶性，體外釋藥速度緩慢，在36小時(shí)其累積釋藥率僅為36％。載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球具有較快的累積釋藥速度和較高的累積實(shí)藥率，在24小時(shí)累積釋藥率達(dá)到94％。透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球由于硅殼的包裹，藥物釋放與載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球相對(duì)緩慢，在36小時(shí)的累積釋藥率約為60％，然而透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球+聚焦超聲具有相對(duì)較快的實(shí)驗(yàn)速度和比較高的累積實(shí)驗(yàn)率，累積釋藥率可以達(dá)到85％。表明透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑具有超聲介導(dǎo)的釋藥行為。

3.透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑細(xì)胞毒性研究

以a549細(xì)胞為研究對(duì)象，以細(xì)胞活力為考察指標(biāo)，對(duì)透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑空白載體的毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。并且考察了超聲對(duì)細(xì)胞以及對(duì)載體毒性的影響。如圖6所示，透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑空白載體具有較高的生物相容性。超聲并不會(huì)增加載體的毒性，并且單獨(dú)的超聲也不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害。

4.透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑體外顯影實(shí)驗(yàn)

將制備成的透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑，硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑，載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑混懸液取0.2ml于瓊脂模型中，給予低強(qiáng)度聚焦超聲(lifu)照射，進(jìn)行超聲顯影。結(jié)果如圖7所示，透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑和硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑比載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑具有更強(qiáng)和更持久的超聲顯影效果.表明包裹的硅殼可以增強(qiáng)造影效果。

5.透明質(zhì)酸修飾的硅包裹磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑體內(nèi)顯影實(shí)驗(yàn)

將制備成的透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑混懸液尾靜脈注射給入h22荷瘤小鼠，然后用lifu照射腫瘤部位，再進(jìn)行超聲成像。如圖8所示，透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑具有較好的體內(nèi)顯影效果。由于透明質(zhì)酸介導(dǎo)的腫瘤靶向，透明質(zhì)酸修飾的硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑比硅包裹載藥磷脂液態(tài)氟碳納米球超聲造影劑具有更強(qiáng)的造影效果。