本公開內(nèi)容大體上涉及通過將惡性細(xì)胞或含有源自哺乳動物惡性細(xì)胞的組分的體液與識別人天冬氨酸β-羥化酶(asph)(基因id：444)的全長亞型的抗體接觸來診斷和治療哺乳動物惡性腫瘤的方法。用與細(xì)胞毒性劑連接的識別asph的全長亞型的單克隆抗體(mab)或其衍生物(比如單鏈可變片段(scfv)和納米抗體)治療哺乳動物的惡性腫瘤的方法也在本發(fā)明內(nèi)。

背景技術(shù)：

1、癌癥或惡性腫瘤是一種多因素疾病，在2018年有約960萬人死亡。在世界范圍內(nèi)，它是第二大主要死亡原因(bray等人(2018))。受宿主和環(huán)境之間的相互作用影響的基因組和表觀基因組的復(fù)雜修飾導(dǎo)致癌癥的發(fā)展和進(jìn)展。盡管在表征腫瘤發(fā)生、腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的分子機制方面取得了進(jìn)展(coyle等人(2017))，但癌癥檢測延遲、手術(shù)選擇有限、治療抗性和腫瘤復(fù)發(fā)是降低癌癥的患病率和死亡率的嚴(yán)重障礙。由于轉(zhuǎn)移是癌癥死亡的主要原因，因此早期檢測和設(shè)計針對多步驟/多方面轉(zhuǎn)移機制的治療方法至關(guān)重要。

2、需要改善的用于早期檢測的材料和方法以及改善的針對轉(zhuǎn)移機制的治療方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、若干種途徑已顯示有助于惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移。asph是通過增強細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、細(xì)胞干性、血管生成、淋巴生成、遷移、休眠-再活化-在遠(yuǎn)處過度生長來惡性轉(zhuǎn)化實體腫瘤的關(guān)鍵因素。asph還通過誘導(dǎo)免疫抑制來促進(jìn)腫瘤生長。這些影響部分經(jīng)由激活notch、tgfβ、hgf-cmet、hif和src信號傳導(dǎo)途徑實現(xiàn)。asph表達(dá)是早期胚胎發(fā)育和分化所必需的，但在出生后被沉默，并且在成年期在正常成人組織(胎盤除外)上檢測不到。當(dāng)asph通過生長因子和缺氧重新出現(xiàn)并上調(diào)時，會引發(fā)腫瘤發(fā)生并在廣泛的人腫瘤中維持惡性表型。與無或低水平相比，中度至高水平的asph表達(dá)導(dǎo)致癌癥患者的復(fù)發(fā)/再發(fā)、早期進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和生存期縮短。因此，靶向asph可對癌癥診斷、預(yù)后和治療具有普遍深遠(yuǎn)的臨床影響。本文提供了改善癌癥治療結(jié)果的新的基于asph的診斷和抗轉(zhuǎn)移策略。

2、本發(fā)明的實施方案提供了一種與asph的全長亞型結(jié)合的lrc1抗體。盡管已經(jīng)產(chǎn)生了數(shù)百種針對asph蛋白的單克隆抗體，但本發(fā)明的lrc1抗體與這些現(xiàn)有技術(shù)相比提供了幾個重要的優(yōu)點。lrc1抗體為設(shè)計用于使用液體活檢檢測早期腫瘤形成的測定提供了改善的靈敏度和特異性。這是由于lrc1抗體的獨特且出乎意料的特性所致，包括：(1)識別在細(xì)胞中過表達(dá)時具有轉(zhuǎn)化活性的asph的全長亞型；(2)識別源自中胚層的腫瘤(比如肉瘤、白血病和淋巴瘤)中的asph的全長亞型；(3)當(dāng)與固相支持物結(jié)合時，檢測少至25pg的asph的全長亞型；(4)作為惡性腫瘤的伴隨診斷測試，檢測含有核外粒體和外泌體的生物流體中存在的asph的全長亞型；(5)所描述的基于lrc1mab的免疫測定通過使用15-25μl源自手指刺破的外周血，僅涉及使用單個lrc1?mab以及使用數(shù)字和光學(xué)控制和自動化的橫向流動和微流體分析，為早期癌癥診斷提供了一種高靈敏度的技術(shù)；(6)已經(jīng)確定了lrc1在asph的全長亞型上結(jié)合的確切表位(即npveds)，asph是一種癌胚和致癌蛋白，其在腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞來源的外泌體和核外粒體的表面上特異性高表達(dá)；以及(7)已經(jīng)確定了lrc1?mab的獨特氨基酸和核酸序列。本發(fā)明的實施方案大大提高了其早期檢測癌癥的能力。使用單一抗體對源自內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的腫瘤具有這種程度的免疫反應(yīng)性是前所未有的，并且與人腫瘤的發(fā)展、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

3、在一些實施方案中，lrc1抗體包括輕鏈和重鏈，其中輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(lcvr)，且重鏈包含重鏈可變區(qū)(hcvr)。lcvr包含由氨基酸序列seq?id?no:5組成的互補決定區(qū)lcdr1，由氨基酸序列seq?id?no:6組成的lcdr2，和由氨基酸序列seq?id?no:7組成的lcdr3。hcvr包含由氨基酸序列seq?id?no:2組成的互補決定區(qū)hcdr1，由氨基酸序列seq?idno:3組成的hcdr2，和由氨基酸序列seq?id?no:4組成的hcdr3。

4、在替代實施方案中，與asph的全長亞型結(jié)合的lrc1抗體包括輕鏈和重鏈，所述輕鏈包含具有氨基酸序列seq?id?no:9的lcvr，所述重鏈包含具有氨基酸序列seq?id?no:8的hcvr。在另一替代實施方案中，與asph的全長亞型結(jié)合的抗體包括輕鏈和重鏈，所述輕鏈包含氨基酸序列seq?id?no:11，所述重鏈包含具有氨基酸序列seq?id?no:10。在又一替代實施方案中，與asph的全長亞型結(jié)合的抗體包括兩條輕鏈和兩條重鏈，每條輕鏈包含氨基酸序列seq?id?no:11，每條重鏈包含氨基酸序列seq?id?no:10。

5、在另一方面，本發(fā)明的實施方案提供了一種dna分子，其包含編碼具有氨基酸序列seq?id?no:11的輕鏈多肽的多核苷酸序列。在一個實施方案中，編碼輕鏈多肽的dna分子包含核酸序列seq?id?no:21。

6、在另一方面，本發(fā)明的實施方案提供了一種dna分子，其包含編碼具有氨基酸序列seq?id?no:10的重鏈多肽的多核苷酸序列。在一個實施方案中，編碼重鏈多肽的dna分子包含核酸序列seq?id?no:20。

7、在另一方面，本發(fā)明的實施方案提供了一種重組宿主細(xì)胞，其包含上述dna分子。該細(xì)胞可表達(dá)包含具有氨基酸序列seq?id?no:10的重鏈和具有氨基酸序列seq?id?no:11的輕鏈的抗體。

8、在另一方面，本發(fā)明的實施方案提供了一種產(chǎn)生與人asph的全長亞型結(jié)合的抗體的方法，所述抗體包括重鏈和輕鏈，所述重鏈包含氨基酸序列seq?id?no:10，所述輕鏈包含氨基酸序列seq?id?no:11。該方法包括以下步驟：(i)在使得asph?mab表達(dá)的條件下培養(yǎng)上述重組宿主細(xì)胞；和(ii)從宿主細(xì)胞中回收表達(dá)的抗體。

9、在另一方面，本發(fā)明的實施方案提供了一種藥物組合物，其包含上述抗體以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載劑、稀釋劑、填充劑、輔助劑、綴合物或賦形劑。

10、另一方面，本發(fā)明的實施方案提供了一種通過將來自哺乳動物的體液(生物流體)與結(jié)合asph的全長亞型(seq?id?no:1)的抗體在足以形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下接觸并檢測抗原-抗體復(fù)合物來診斷哺乳動物惡性腫瘤的方法。以此方式檢測的惡性腫瘤包括源自以下的那些：(1)內(nèi)胚層組織，例如頭頸癌、甲狀腺癌、胸腺癌、非小細(xì)胞肺癌、食道癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、膽囊癌、膽管癌、胰腺癌、結(jié)腸和直腸癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、輸卵管癌和宮頸癌；(2)中胚層組織，例如軟組織肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、惡性間皮瘤、髓性白血病、淋巴性白血病、多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤；(3)外胚層組織，例如皮膚癌、黑色素瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)腫瘤，比如神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞來源的原發(fā)性惡性cns腫瘤和轉(zhuǎn)移性cns腫瘤(例如多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(gbm))也檢測。將患者來源的組織樣品，例如實體腫瘤的活檢和體液(生物流體)，比如cns來源的腦脊液(csf)、血液(血清)、尿液、唾液、痰、肺積液和腹水流體與本發(fā)明的asph特異性抗體接觸。

11、在另一方面，本發(fā)明的實施方案提供了一種藥物組合物，其包含上述抗體以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載劑、稀釋劑、填充劑、輔助劑、綴合物或賦形劑。

12、本文描述的測定可用于預(yù)測(前)惡性疾病的預(yù)后。用于哺乳動物惡性腫瘤的預(yù)后的方法通過以下進(jìn)行：(a)將來自哺乳動物的體液與本發(fā)明的asph特異性抗體在足以形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下接觸，并檢測抗原-抗體復(fù)合物；(b)定量復(fù)合物的量以確定流體中的asph水平；和(c)將流體中的asph水平與正常組織(其具有微量或不可檢測的asph水平)進(jìn)行比較。asph水平隨時間增加指示疾病的逐漸惡化，并因此指示預(yù)后不良。如果asph水平高于參考水平，則受試者鑒定為患有惡性腫瘤。當(dāng)生物樣品為血清時，將檢測到的asph水平與參考水平進(jìn)行比較。當(dāng)asph水平高于參考水平時，進(jìn)一步向受試者提供確認(rèn)診斷和隨后適合于惡性腫瘤的治療。在一些實施方案中，治療包括向受試者施用包含治療有效量的與細(xì)胞毒性劑(殺死細(xì)胞(包括癌細(xì)胞)的物質(zhì)，其可阻止癌細(xì)胞分裂和生長并可導(dǎo)致腫瘤尺寸縮小)連接的本發(fā)明的asph特異性抗體的組合物，所述細(xì)胞毒性劑包括常規(guī)化療藥物(例如多柔比星、紫杉醇)、微管蛋白抑制劑(美登木素生物堿[dm1和dm4]或澳瑞他汀)、dna損傷劑(例如卡利奇霉素)、澳瑞他汀(例如單甲基澳瑞他汀e(mmae)和f(mmaf))、德魯替康、多卡霉素、sn-38、pe38(假單胞菌(pseudomonas)外毒素a的38kda片段)、pbd(吡咯并苯二氮)、放射性同位素(例如α粒子、質(zhì)子)及其衍生物?？捎迷摐y定診斷的惡性腫瘤包括但不限于頭頸癌、甲狀腺癌、胸腺癌、非小細(xì)胞肺癌、食道癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、膽管癌、膽囊癌、胰腺癌、結(jié)腸和直腸癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、輸卵管癌和宮頸癌、軟組織肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、惡性間皮瘤、髓性白血病、淋巴性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、皮膚癌、黑色素瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。

13、本文描述的測定形式還可用于生成用于惡性疾病的預(yù)后的時間數(shù)據(jù)。監(jiān)測患有惡性腫瘤的哺乳動物受試者的治療進(jìn)展的方法通過以下進(jìn)行：(a)使來自哺乳動物受試者的第一生物樣品與結(jié)合asph的全長亞型的抗體在足以形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下接觸，并然后檢測和測量抗原-抗體復(fù)合物以確定第一樣品中的asph水平；(b)向受試者施用用于治療惡性腫瘤的治療劑；(c)使來自該哺乳動物受試者的第二治療后生物樣品與結(jié)合asph的全長亞型的抗體在足以形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下接觸，并然后檢測和測量抗原-抗體復(fù)合物以確定第二樣品中的asph水平；和(c)比較兩個樣品中的asph水平。第二水平測量值顯著低于第一水平測量值指示治療劑有效，且反之亦然。此外，治療劑可以是治療有效量的與細(xì)胞毒性劑連接的本發(fā)明的asph特異性抗體?？捎迷摐y定監(jiān)測的惡性腫瘤包括但不限于頭頸癌、甲狀腺癌、胸腺癌、非小細(xì)胞肺癌、食道癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、膽管癌、膽囊癌、胰腺癌、結(jié)腸和直腸癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、輸卵管癌和宮頸癌、軟組織肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、惡性間皮瘤、髓性白血病、淋巴性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、皮膚癌、黑色素瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。

14、本發(fā)明還包括診斷試劑盒。用于檢測腫瘤細(xì)胞的試劑盒包含與asph的全長亞型結(jié)合的抗體或其功能活性片段，其中該抗體或功能活性片段與seq?id?no:1的殘基286-291結(jié)合。該試劑盒任選地包含用于檢測抗體與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合的手段。例如，該試劑盒包含可檢測標(biāo)志物，例如非放射性標(biāo)志物，比如gd+++或fe++或放射性化合物。該試劑盒還可包含使用說明、用于確定陽性抗體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)試劑和/或用于確定缺乏抗體結(jié)合的陰性對照。這些組件一起包裝在試劑盒中。在一些實施方案中，該試劑盒是以標(biāo)準(zhǔn)雙抗體夾心結(jié)合形式配制的診斷測定，其中一種與asph的全長亞型結(jié)合的抗體捕獲患者樣品中的asph抗原，而另一種asph特異性抗體用于檢測捕獲的asph。例如，捕獲抗體固定化在固相上，所述固相例如測定板、測定孔、硝酸纖維素膜、珠、試紙(dipstick)或洗脫柱的組件。第二抗體，即檢測抗體，通常用可檢測標(biāo)簽(比如量熱劑或放射性同位素)標(biāo)記。這些組件一起包裝在試劑盒中?？捎迷撛噭┖性\斷的惡性腫瘤包括但不限于頭頸癌、甲狀腺癌、胸腺癌、非小細(xì)胞肺癌、食道癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、膽管癌、膽囊癌、胰腺癌、結(jié)腸和直腸癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、輸卵管癌和宮頸癌、軟組織肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、惡性間皮瘤、髓性白血病、淋巴性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、皮膚癌、黑色素瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。

15、本文還描述并記載了其他實現(xiàn)方式。