本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料，具體涉及一種靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、免疫療法是通過調(diào)整或干預(yù)機(jī)體免疫功能狀態(tài)，達(dá)到治療疾病的方法。腫瘤細(xì)胞一般會采用多種策略來避免被免疫系統(tǒng)識別和清除，免疫療法的目的就是通過激活免疫系統(tǒng)，使其能夠識別并攻擊殺死腫瘤細(xì)胞；免疫檢查點(diǎn)抑制劑是免疫療法的關(guān)鍵，包括pd-1抑制劑、pd-l1抑制劑、ctla-4抑制劑等。然而，由于肝癌腫瘤免疫抑制微環(huán)境的特殊性，單獨(dú)免疫療法面臨著效果有限、藥物毒性增加、耐藥性增加等問題。并且在免疫治療中，藥物的靶向性差和副作用多是一個顯著問題，藥物往往不能精準(zhǔn)地作用于腫瘤細(xì)胞，對外周正常細(xì)胞也會造成損害。

2、細(xì)胞外囊泡是由幾乎所有類型的細(xì)胞產(chǎn)生并分泌到胞外的具有雙層磷脂結(jié)構(gòu)的納米級囊泡，作為蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、代謝物等的載體在細(xì)胞間穿梭，行使物質(zhì)傳遞和信息交流功能。外泌體是細(xì)胞外囊泡的一種，直徑通常在30-150nm之間，同樣具有物質(zhì)傳遞和信息交流的功能，并在免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生發(fā)展、代謝、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用。同時，外泌體作為一種新興的藥物載體，近年來在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注和研究，目前常用的外泌體包括巨噬細(xì)胞外泌體、間充質(zhì)細(xì)胞外泌體等，如公開號為cn118121631a的中國專利文獻(xiàn)公開了一種氧化鐵納米顆粒工程化的巨噬細(xì)胞外泌體在制備抑制視網(wǎng)膜新生血管的藥物中的應(yīng)用，公開號為cn116036042a的中國專利文獻(xiàn)公開了一種穩(wěn)定的靶向m2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的外泌體納米粒及制備方法及應(yīng)用。但是巨噬細(xì)胞外泌體、間充質(zhì)細(xì)胞外泌體等制備過程耗時長且產(chǎn)量較小，不利于藥物制劑產(chǎn)業(yè)化。

3、微藻作為自然界的一種單細(xì)胞藻類，微藻外泌體具有數(shù)量龐大、易于獲取、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)的外泌體超速離心法根據(jù)顆粒的不同大小、密度和沉降率來分離外泌體，是最常用的外泌體富集方法，但存在耗時長、成本高、純度低、回收率低、樣本量需求大及反復(fù)離心導(dǎo)致外泌體被損壞等缺點(diǎn)；密度梯度離心法根據(jù)顆粒的沉降系數(shù)差異，使外泌體在密度梯度連續(xù)分布的蔗糖溶液中被分配到特定位置上，形成不同的外泌體區(qū)帶，雖然具有適應(yīng)范圍廣、分離效果好、純度高、外泌體不會被損壞等優(yōu)點(diǎn)，但其設(shè)備要求高、離心時間長、操作要求高、回收率低且需要制備惰性梯度介質(zhì)溶液等；共沉淀法根據(jù)顆粒的表面電荷，使外泌體與疏水性蛋白或脂質(zhì)分子結(jié)合共沉淀形成多聚物從而在液體中分離、富集外泌體，但其具有純度低、特異性差、回收率低、聚合物難以去除和外泌體結(jié)構(gòu)易被破壞等缺點(diǎn)。因此需要對微藻外泌體提取方法進(jìn)行改進(jìn)。此外，微藻這類天然的外泌體具有靶向性差的缺點(diǎn)，不能很好的靶向腫瘤組織。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒的制備方法，制得的微藻外泌體納米顆粒具有肝癌組織靶向性好、生物安全性好、藥物療效確切精準(zhǔn)的優(yōu)點(diǎn)。

2、具體采用的技術(shù)方案如下：

3、一種靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

4、(1)結(jié)合超速離心法、超濾法和尺寸排阻法制備微藻細(xì)胞外泌體，微藻細(xì)胞為小球藻細(xì)胞或集胞藻細(xì)胞，微藻細(xì)胞外泌體的粒徑為30-150nm；

5、(2)通過電穿孔的方法將免疫檢查點(diǎn)抑制劑載入微藻細(xì)胞外泌體中，得到載藥微藻外泌體，使肝腫瘤細(xì)胞膜與載藥微藻外泌體發(fā)生膜融合，制備得到所述的靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒。

6、本發(fā)明一方面改進(jìn)了微藻細(xì)胞外泌體的提取方法，得到的微藻細(xì)胞外泌體溶液中外泌體濃度更高，粒徑更均勻，另一方面，利用微藻細(xì)胞外泌體負(fù)載免疫檢查點(diǎn)抑制劑后，進(jìn)一步與肝腫瘤細(xì)胞膜進(jìn)行膜融合，肝腫瘤細(xì)胞膜表面存在特征分子如抗原、膜蛋白等，根據(jù)受配體相互結(jié)合的原理，可以靶向肝腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而賦予微藻外泌體納米顆粒靶向肝癌組織的能力。

7、具體的，所述的微藻細(xì)胞外泌體的制備方法包括以下步驟：

8、s01培養(yǎng)微藻細(xì)胞，收集培養(yǎng)后的微藻細(xì)胞上清液，將收集得到的上清液進(jìn)行超速離心，超速離心條件為10000-12000g，2-8℃，15-20min；

9、s02利用0.22μm微孔濾膜，將步驟(1)得到的溶液過濾到超濾管中將分子量≤100kda的溶質(zhì)分離出來并離心，離心條件為3200-3500g，2-8℃，15-20min，得到超濾液；

10、s03采用層析柱純化超濾液，使超濾液在重力作用下流經(jīng)層析柱，后用緩沖液洗脫層析柱填料吸附的外泌體，得到微藻細(xì)胞外泌體溶液。

11、進(jìn)一步的，所述的層析柱填料為多孔樹脂；洗脫用的緩沖液為pbs緩沖液。

12、優(yōu)選的，所述的免疫檢查點(diǎn)抑制劑選用pd-1藥物。

13、優(yōu)選的，步驟(2)中，將免疫檢查點(diǎn)抑制劑溶液和微藻細(xì)胞外泌體溶液重懸于pbs緩沖液中，隨后在350-450v的電壓下電穿孔1-2ms，孵育后離心，離心條件為180000-250000g，2-8℃，60-90min，進(jìn)一步將沉淀重懸，得到載藥微藻外泌體溶液。

14、進(jìn)一步優(yōu)選的，免疫檢查點(diǎn)抑制劑溶液的濃度為1-2mg/ml，微藻細(xì)胞外泌體溶液的濃度為2-3mg/ml，免疫檢查點(diǎn)抑制劑溶液和微藻細(xì)胞外泌體溶液的體積比為1:6-8。

15、優(yōu)選的，肝腫瘤細(xì)胞膜為大鼠肝癌n1s1細(xì)胞膜，免疫檢查點(diǎn)抑制劑選用多肽拮抗劑aunp-12。

16、優(yōu)選的，肝腫瘤細(xì)胞膜與載藥微藻外泌體的質(zhì)量比為2-15:1，在上述質(zhì)量比的條件下，有利于肝腫瘤細(xì)胞膜與載藥微藻外泌體更好地進(jìn)行膜融合。

17、本發(fā)明還提供了所述的靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒的制備方法制得的靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒。

18、該微藻外泌體納米顆粒的粒徑為50-170nm，能夠靶向肝癌組織。

19、本發(fā)明還提供了一種肝癌治療產(chǎn)品，包括所述的靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒。

20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

21、(1)本發(fā)明改進(jìn)了微藻細(xì)胞外泌體的提取方法，與現(xiàn)有的外泌體提取方法相比，本發(fā)明通過超速離心法、超濾法以及尺寸排阻法，得到的微藻細(xì)胞外泌體溶液中外泌體濃度更高，粒徑更均勻，克服了傳統(tǒng)的超速離心法純度低、回收率低、樣本量需求大及反復(fù)離心導(dǎo)致外泌體被損壞等缺點(diǎn)。

22、(2)本發(fā)明采用自然界綠色植物來源的外泌體作為體內(nèi)藥物遞送載體用于腫瘤治療，并利用膜融合的方法使微藻細(xì)胞外泌體帶上了腫瘤細(xì)胞的特征，增強(qiáng)了其靶向腫瘤組織的能力，且得到的靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒遞送pd-1藥物具有靶向性好、藥物療效確切、生物安全性好等優(yōu)點(diǎn)，為臨床腫瘤治療提供了一種新的思路和理論依據(jù)，在腫瘤治療中具有重要的意義，也具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述的微藻細(xì)胞外泌體的制備方法包括以下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒的制備方法，其特征在于，步驟s03中，所述的層析柱填料為多孔樹脂；洗脫用的緩沖液為pbs緩沖液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述的免疫檢查點(diǎn)抑制劑選用pd-1藥物。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，將免疫檢查點(diǎn)抑制劑溶液和微藻細(xì)胞外泌體溶液重懸于pbs緩沖液中，隨后在350-450v的電壓下電穿孔1-2ms，孵育后離心，離心條件為180000-250000g，2-8℃，60-90min，進(jìn)一步將沉淀重懸，得到載藥微藻外泌體溶液。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒的制備方法，其特征在于，肝腫瘤細(xì)胞膜為大鼠肝癌n1s1細(xì)胞膜，免疫檢查點(diǎn)抑制劑選用多肽拮抗劑aunp-12。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒的制備方法，其特征在于，肝腫瘤細(xì)胞膜與載藥微藻外泌體的質(zhì)量比為2-15:1。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒的制備方法制得的靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒，其特征在于，所述的靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒粒徑為50-170nm。

10.一種肝癌治療產(chǎn)品，其特征在于，包括權(quán)利要求8或9所述的靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒及其制備方法，屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，方法包括：(1)結(jié)合超速離心法、超濾法和尺寸排阻法制備微藻細(xì)胞外泌體，微藻細(xì)胞為小球藻細(xì)胞或集胞藻細(xì)胞，微藻細(xì)胞外泌體的粒徑為30?150nm；(2)通過電穿孔的方法將免疫檢查點(diǎn)抑制劑載入微藻細(xì)胞外泌體中，得到載藥微藻外泌體，使肝腫瘤細(xì)胞膜與載藥微藻外泌體發(fā)生膜融合，制備得到所述的靶向肝癌組織的微藻外泌體納米顆粒。本發(fā)明制得的微藻外泌體納米顆粒具有肝癌組織靶向性好、生物安全性好、藥物療效確切精準(zhǔn)的優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：唐喆,曾誠,趙金超,胡杞濤,蔣昂峰
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第四醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15