本發(fā)明涉及生物信息，具體涉及基于pacbio?hifi三代dna測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型的方法。

背景技術(shù)：

1、個體單倍體型的研究需求促進(jìn)了單倍體型構(gòu)建方法和工具的不斷發(fā)展和進(jìn)步，不依賴親本數(shù)據(jù)和群體測序、僅從個體全基因組測序數(shù)據(jù)中重構(gòu)出單倍體型儼然已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前的單倍體型構(gòu)建方法主要有兩大類：一種基于比對的單倍體型分型方法，一種是基于組裝的單倍體型分型方法。基于比對的單倍體型分析通常以預(yù)先識別出雜合標(biāo)記位點(diǎn)（主要是snp和indel標(biāo)記）和測序片段作為輸入信息，并將單倍體型組裝過程轉(zhuǎn)化為最小片段去除，最長單倍體型構(gòu)建，最小錯誤糾正等。第三代測序序列的讀長優(yōu)勢在構(gòu)建單倍體型上具有巨大的應(yīng)用潛力，近年來已有多個基于三代序列的基因組分型工具發(fā)表，其中以whathap的方法具有代表性。基于組裝的單倍體型分型方法主要有兩種，一種是有親本數(shù)據(jù)，在組裝時參考親本的數(shù)據(jù)進(jìn)行分型，組裝出兩套單倍體型的基因組。另一種是基于參考基因組上的變異位點(diǎn)信息，將組裝的reads分成單倍體型的兩套，再分別進(jìn)行組裝。由于以上的方法是基于整個基因組范圍內(nèi)的單倍體型分型，序列數(shù)量和變異位點(diǎn)數(shù)量相對龐大，需要的時間較多，資源消耗相對較大，同時對數(shù)據(jù)的糾錯也有更高的要求。同時一些分析方法需要依賴已有的數(shù)據(jù)，子代的親本數(shù)據(jù)通常較難獲得。

2、基于此，本發(fā)明提供一種高精度的基于基因?qū)用娴膯伪扼w信息檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于上述表述，本發(fā)明提供了基于pacbio?hifi三代dna測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型的方法，該方法結(jié)合pacbio?hifi的測序數(shù)據(jù)長讀長、高精確度和高準(zhǔn)確率的優(yōu)點(diǎn)，可以根據(jù)人的多態(tài)性位點(diǎn)信息，精確地得到人基因單倍體變異信息。

2、本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

3、基于pacbio?hifi三代dna測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型的方法，該方法能進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型，檢測出人的2條單倍體型的突變信息，輸入文件包括：三代pacbiohifi的reads序列、參考基因組；該方法包括以下幾個步驟，

4、過濾短讀長序列：過濾無效短讀長序列小于1000bp；

5、比對：完成過濾操作后，使用比對軟件將三代測序數(shù)據(jù)比對到參考基因組上，生成bam格式文件；

6、變異檢測與過濾：使用變異檢測軟件deepvariant從bam文件中識別出測序基因組數(shù)據(jù)中的原始snp位點(diǎn)，并對這些原始snp位點(diǎn)進(jìn)行過濾，過濾剩下的突變位點(diǎn)集合用于下游操作處理的輸入，一條測序片段（read）上包含多個變異位點(diǎn)以及基因型，看作單倍體型序列的一個“局部單倍體型”；

7、構(gòu)建單倍體型：利用基因組reads上的局部單倍體型之間的重疊關(guān)系，構(gòu)建出覆蓋基因組大范圍的單倍體型；

8、分型：將reads比對到參考基因組上，根據(jù)測序的reads上的雜合變異位點(diǎn)對測序的reads進(jìn)行分型，區(qū)分哪些測序片段是來自父方，哪些片段來自母方，然后對兩種基因型的片段分別進(jìn)行組裝，形成兩套基因型；

9、構(gòu)建評價(jià)指標(biāo)：分型準(zhǔn)確率=100%-分型結(jié)果中不正確的連續(xù)snp對的比例，分型準(zhǔn)確率的值越大，表明分型的準(zhǔn)確率越高，計(jì)算n50值，n50值越大，說明獲得的單倍體型的連續(xù)性越好。

10、在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。

11、進(jìn)一步地，上述的基于pacbio?hifi三代dna測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型的方法，所述比對步驟為：將pacbio?hifi數(shù)據(jù)使用minimap2進(jìn)行比對處理，將hifi數(shù)據(jù)比對到參考基因組上，生成bam格式文件。

12、進(jìn)一步地，上述的基于pacbio?hifi三代dna測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型的方法，所述變異檢測與過濾步驟中，這些原始的變異位點(diǎn)需要經(jīng)過以下步驟進(jìn)行過濾：保留pass位點(diǎn)、過濾純合位點(diǎn)、深度過濾、偏差處理。

13、進(jìn)一步地，上述的基于pacbio?hifi三代dna測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型的方法，所述保留pass位點(diǎn)：僅保留filter字段值為“pass”的位點(diǎn)，同時剔除距離小于3個堿基的相鄰的兩個snp位點(diǎn)。

14、進(jìn)一步地，上述的基于pacbio?hifi三代dna測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型的方法，所述過濾純合位點(diǎn)：deepvariant從bam文件中識別出測序reads數(shù)據(jù)中包含的原始snp位點(diǎn)及其在snp位點(diǎn)上的基因型，并存儲在vcf文件中，在vcf文件中，過濾“gt”字段為“1/1”、“0/0”、“./.”的位點(diǎn)，保留雜合變異的位點(diǎn)“0/1”；同時過濾掉兩種基因型的read數(shù)目之比超過80%或者小于20%的位點(diǎn)。

15、進(jìn)一步地，上述的基于pacbio?hifi三代dna測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型的方法，所述深度過濾：如果位點(diǎn)下面的read數(shù)目大于2倍的平均深度或者小于一半的平均深度，則過濾該位點(diǎn)，平均深度定義為snp位點(diǎn)下面的read的平均數(shù)目。

16、進(jìn)一步地，上述的基于pacbio?hifi三代dna測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型的方法，所述偏差處理：deepvariant輸出的vcf文件，會記錄每一個snp位點(diǎn)的位置p，以位置p為中心，前后擴(kuò)展200bp，p+200bp、p-200bp區(qū)域的變異位點(diǎn)信息是擴(kuò)增后的變異信號，并判斷是否為符合單倍體分型的基因型，過濾不符合單倍體分型的基因型，保留符合單倍體分型的基因型。

17、進(jìn)一步地，上述的基于pacbio?hifi三代dna測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型的方法，所述構(gòu)建單倍體型步驟中，來自同一個單倍體型的read通過重疊的snp位點(diǎn)能形成連續(xù)的路徑，來自不同單倍體型的read在圖中形成的路徑互不交叉，支持路徑的reads測序深度數(shù)目越高，則表示該路徑越可靠；反之，就可能是錯誤引起的噪音路徑，可靠性較低。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案具有以下有益技術(shù)效果：

19、三代pacbio?hifi數(shù)據(jù)能夠覆蓋人類的基因序列，因此也能完整測序人類基因的基因序列。pacbio?hifi數(shù)據(jù)測序長度高達(dá)25kb，對于絕大多數(shù)的基因能夠提供足夠的精確度覆蓋的reads支持，獲取相應(yīng)的結(jié)構(gòu)變異信息。由于pacbio?hifi數(shù)據(jù)精確度高達(dá)99.9%，能夠有效地避免假陽性問題。單倍體可以用于幫助檢測和糾正錯誤或缺失的測序數(shù)據(jù)，從醫(yī)學(xué)角度來解釋個體基因組是至關(guān)重要的，尤其是考慮到在醫(yī)學(xué)上有重要影響作用的基因表達(dá)或功能的稀有（或“私有”）變異時。

20、該方法結(jié)合了三代pacbio?hifi測序數(shù)據(jù)的特點(diǎn)，先利用hifi數(shù)據(jù)比對上參考基因組，在基因范圍內(nèi)，查到對應(yīng)的突變位點(diǎn)信息、進(jìn)行區(qū)分單倍體型信息。通過較長的基因片段，然后利用reads片段上overlap區(qū)域的信息，從而區(qū)分出單倍體型的信息。

技術(shù)特征：

1.基于pacbio?hifi三代dna測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型的方法，其特征在于，該方法能進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型，檢測出人的2條單倍體型的突變信息，輸入文件包括：三代pacbio?hifi的reads序列、參考基因組；該方法包括以下幾個步驟，

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于pacbio?hifi三代dna測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型的方法，其特征在于，所述比對步驟為：將pacbio?hifi數(shù)據(jù)使用minimap2進(jìn)行比對處理，將hifi數(shù)據(jù)比對到參考基因組上，生成bam格式文件。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于pacbio?hifi三代dna測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型的方法，其特征在于，所述變異檢測與過濾步驟中，這些原始的變異位點(diǎn)需要經(jīng)過以下步驟進(jìn)行過濾：保留pass位點(diǎn)、過濾純合位點(diǎn)、深度過濾、偏差處理。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于pacbio?hifi三代dna測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型的方法，其特征在于，所述保留pass位點(diǎn)：僅保留filter字段值為“pass”的位點(diǎn)，同時剔除距離小于3個堿基的相鄰的兩個snp位點(diǎn)。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于pacbio?hifi三代dna測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型的方法，其特征在于，所述過濾純合位點(diǎn)：deepvariant從bam文件中識別出測序reads數(shù)據(jù)中包含的原始snp位點(diǎn)及其在snp位點(diǎn)上的基因型，并存儲在vcf文件中，在vcf文件中，過濾“gt”字段為“1/1”、“0/0”、“./.”的位點(diǎn)，保留雜合變異的位點(diǎn)“0/1”；同時過濾掉兩種基因型的read數(shù)目之比超過80%或者小于20%的位點(diǎn)。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于pacbio?hifi三代dna測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型的方法，其特征在于，所述深度過濾：如果位點(diǎn)下面的read數(shù)目大于2倍的平均深度或者小于一半的平均深度，則過濾該位點(diǎn)，平均深度定義為snp位點(diǎn)下面的read的平均數(shù)目。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于pacbio?hifi三代dna測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型的方法，其特征在于，所述偏差處理：deepvariant輸出的vcf文件，會記錄每一個snp位點(diǎn)的位置p，以位置p為中心，前后擴(kuò)展200bp，并判斷是否為符合單倍體分型的基因型，過濾不符合單倍體分型的基因型，保留符合單倍體分型的基因型。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于pacbio?hifi三代dna測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型的方法，其特征在于，所述構(gòu)建單倍體型步驟中，來自同一個單倍體型的read通過重疊的snp位點(diǎn)能形成連續(xù)的路徑，來自不同單倍體型的read在圖中形成的路徑互不交叉，支持路徑的reads測序深度數(shù)目越高，則表示該路徑越可靠；反之，就可能是錯誤引起的噪音路徑，可靠性較低。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開基于PacBio?HiFi三代DNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型的方法，該方法能進(jìn)行基因?qū)用鎲伪扼w分型，檢測出人的2條單倍體型的突變信息。輸入文件包括：三代PacBio?HiFi的reads序列、參考基因組。該方法包括以下幾個步驟：過濾短讀長序列、比對、變異檢測與過濾、構(gòu)建單倍體型、分型、構(gòu)建評價(jià)指標(biāo)。該方法結(jié)合了三代PacBio?HiFi測序數(shù)據(jù)的特點(diǎn)，先利用HiFi數(shù)據(jù)比對上參考基因組，在基因范圍內(nèi)，查到對應(yīng)的突變位點(diǎn)信息、進(jìn)行區(qū)分單倍體型信息。對于較長的基因片段，利用reads片段上overlap區(qū)域的信息，從而區(qū)分出單倍體型的信息。

技術(shù)研發(fā)人員：黃容,李偉,程艷兵
受保護(hù)的技術(shù)使用者：武漢菲沙基因信息有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15