本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及ripk1/tnfα通路的激活、nf-κb通路的抑制在抑制escc進(jìn)展中的應(yīng)用，更具體的為ripk1/tnfα信號(hào)通路的激活、nf-κb信號(hào)通路的抑制在促進(jìn)escc細(xì)胞凋亡或抑制escc細(xì)胞增殖中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、腫瘤微環(huán)境（tumor?micro-environment,?tme）是一個(gè)高度結(jié)構(gòu)化的生態(tài)系統(tǒng)，包含癌細(xì)胞，以及各種非惡性細(xì)胞類型包裹在周圍。tme包含各種類型的免疫細(xì)胞、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated?fibroblasts，cafs）、內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial?cells，ecs）、周細(xì)胞和其他因組織而異的細(xì)胞類型，如脂肪細(xì)胞和神經(jīng)元。根據(jù)腫瘤發(fā)生的器官、癌細(xì)胞的內(nèi)在特征、腫瘤分期和患者特征，tme的細(xì)胞組成和功能狀態(tài)會(huì)有所不同，tme中的各種細(xì)胞既可以抑制腫瘤，也可以支持腫瘤，最初，這些細(xì)胞被認(rèn)為是無功能的，然而隨著研究機(jī)制的深入，發(fā)現(xiàn)tme中的這些細(xì)胞及其分泌的各種因子在癌癥的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用并且很有希望成為新的治療靶點(diǎn)。

2、近年來關(guān)于微環(huán)境的深入研究讓我們了解到，腫瘤和周圍的微環(huán)境是密切相關(guān)的，并且不斷地相互作用。腫瘤可通過釋放細(xì)胞外信號(hào)，促進(jìn)腫瘤血管生成以及誘導(dǎo)外周免疫耐受來影響微環(huán)境，而微環(huán)境中的免疫細(xì)胞則可影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和演化。tme內(nèi)含多種細(xì)胞以及多種細(xì)胞因子，在腫瘤的增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移上都起到了重要的作用。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated?macrophages，tams）作為tme的重要組成部分，主要通過其分泌的細(xì)胞因子與腫瘤細(xì)胞相互作用，進(jìn)而調(diào)控腫瘤的進(jìn)展。tams分泌的因子具有直接調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的能力，包括腫瘤壞死因子（tnf）等細(xì)胞因子、egf、白細(xì)胞介素-6（il-6）以及cxcl17?和ccl24等趨化因子。

3、tnf，也稱為tnf-α?（stnf）作為一種可溶性的細(xì)胞因子，分子量大小為17kda，stnf由其細(xì)胞表面結(jié)合的前體（tmtnf）在tnf-α?轉(zhuǎn)化酶（tnf-alpha-converting?enzyme?,tace）的作用下從細(xì)胞中釋放出來。多種免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞都可以產(chǎn)生tnf，包括巨噬細(xì)胞、t細(xì)胞、肥大細(xì)胞、粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)元、角質(zhì)形成細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞[53]。tnf-α?具有廣泛的生物學(xué)功能，參與細(xì)胞的凋亡、增殖以及免疫調(diào)節(jié)等等。

4、tnf-α（stnf或tmtnf）主要通過與配體tnfr1、tnfr2結(jié)合，介導(dǎo)的不同信號(hào)通路從而發(fā)揮nf-κb的激活或者是細(xì)胞凋亡等各種生物學(xué)功能，同樣，通過tnfr或tnf拮抗劑與tmtnf結(jié)合，也可以觸發(fā)攜帶tmtnf細(xì)胞的細(xì)胞活化、細(xì)胞因子抑制或凋亡。tnfr1的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域包含死亡結(jié)構(gòu)域，該死亡結(jié)構(gòu)域通過結(jié)合銜接蛋白tnfr相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域?qū)nfr1偶聯(lián)至2種不同信號(hào)通路中的任一種。最主要途徑就是導(dǎo)致nf-κb1的激活，nf-κb1是一個(gè)大量炎癥基因的轉(zhuǎn)錄因子家族；另一種途徑就是caspase-8和caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，凋亡途徑通常受到fadd樣il-1β轉(zhuǎn)化酶的抑制，該酶是一種由nf-κb1激活途徑誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)。然而，如果nf-κb1的活化受到損害，比如經(jīng)常發(fā)生在病原體感染的細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡途徑就成為了tnfr介導(dǎo)的主要途徑。為了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，tnf-tnfr1復(fù)合物被內(nèi)化到內(nèi)吞小泡中，各種銜接蛋白在其中組裝并啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

5、由于巨噬細(xì)胞主要通過各種細(xì)胞因子而對(duì)其周圍的微環(huán)境產(chǎn)生影響，而tnf-α又是微環(huán)境中包含巨噬細(xì)胞在內(nèi)的各種免疫細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子，因此，研究巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子tnf-α?對(duì)不同cdca7表達(dá)水平的escc細(xì)胞產(chǎn)生的影響是非常必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了ripk1/tnfα通路的激活、nf-κb通路的抑制在抑制escc進(jìn)展中的應(yīng)用。更進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了ripk1/tnfα信號(hào)通路的激活、nf-κb信號(hào)通路的抑制在促進(jìn)escc細(xì)胞凋亡或抑制escc細(xì)胞增殖中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明由如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：ripk1/tnfα信號(hào)通路的激活、nf-κb信號(hào)通路的抑制在促進(jìn)escc細(xì)胞凋亡或抑制escc細(xì)胞增殖中的應(yīng)用，所述ripk1/tnfα信號(hào)通路的激活和、nf-κb信號(hào)通路的抑制為抑制或降低cdca7表達(dá)，促進(jìn)或提高ripk1的轉(zhuǎn)錄。

3、進(jìn)一步的，所述促進(jìn)或提高ripk1的表達(dá)為使ripk1蛋白水平增高或使ripk1磷酸化水平增高。

4、更進(jìn)一步的，所述促進(jìn)或提高ripk1的表達(dá)為抑制或阻斷cdca7通過motif-21的dna序列與ripk1的結(jié)合；其中：所述motif-21的dna序列如seq?id?n0.1所示，dna序列為：5’-aaccctaacc-3’。

5、本發(fā)明利用cck8實(shí)驗(yàn)、流式凋亡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證tnf-α對(duì)不同cdca7表達(dá)水平的escc細(xì)胞增殖和凋亡的影響；生物信息學(xué)、chip-seq探索具體的作用機(jī)制和下游靶基因；rt-qpcr、western?blot和雙熒光素報(bào)告酶實(shí)驗(yàn)探索和驗(yàn)證下游靶基因。

6、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證cdca7通過motif-21這個(gè)dna序列與ripk1的基因組結(jié)合，而對(duì)ripk1發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用，從而對(duì)escc細(xì)胞在tnf-α的刺激下產(chǎn)生促進(jìn)生長(zhǎng)和抗凋亡的作用。發(fā)現(xiàn)cdca7表達(dá)水平的高低對(duì)于nod樣受體信號(hào)通路、tnf信號(hào)通路以及nf-κb信號(hào)通路中的基因表達(dá)水平的影響較為明顯，隨后經(jīng)過篩選和驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，cdca7可能通過下游靶基因ripk1發(fā)揮這種調(diào)控作用。

7、本發(fā)明研究表明，cdca7能夠在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控ripk1的表達(dá)，而ripk1蛋白的含量對(duì)于tnf信號(hào)通路、nf-κb信號(hào)通路以及ripk1的磷酸化均會(huì)產(chǎn)生影響，因此猜測(cè)cdca7是通過調(diào)控ripk1的表達(dá)水平而影響escc細(xì)胞在tnf-α介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡。

8、綜上所述，cdca7作為一個(gè)食管鱗癌相關(guān)基因發(fā)揮促癌作用，不僅能夠通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)而直接影響escc細(xì)胞的周期、增殖、emt進(jìn)程和侵襲轉(zhuǎn)移等，更有意義的是，cdca7通過調(diào)控ripk1的表達(dá)而影響tnf-α對(duì)escc細(xì)胞的作用。

技術(shù)特征：

1.ripk1/tnfα信號(hào)通路的激活、nf-κb信號(hào)通路的抑制在促進(jìn)escc細(xì)胞凋亡或抑制escc細(xì)胞增殖中的應(yīng)用，其特征在于：所述ripk1/tnfα信號(hào)通路的激活、nf-κb信號(hào)通路的抑制為抑制或降低cdca7表達(dá)，促進(jìn)或提高ripk1的轉(zhuǎn)錄。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述促進(jìn)或提高ripk1的表達(dá)為使ripk1蛋白水平增高或使ripk1磷酸化水平增高。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述促進(jìn)或提高ripk1的表達(dá)為抑制或阻斷cdca7通過motif-21的dna序列與ripk1的結(jié)合；其中：所述motif-21的dna序列如seq?idn0.1所示，dna序列為：5’-aaccctaacc-3’。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，提供RIPK1/TNFα通路的激活、NF?κB通路的抑制在抑制ESCC進(jìn)展中的應(yīng)用。所述RIPK1/TNFα信號(hào)通路的激活和、NF?κB信號(hào)通路的抑制為抑制或降低CDCA7表達(dá)，促進(jìn)或提高RIPK1的轉(zhuǎn)錄。驗(yàn)證了CDCA7通過motif?21與RIPK1的基因組結(jié)合，而對(duì)RIPK1發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用，從而對(duì)ESCC細(xì)胞在TNF?α的刺激下產(chǎn)生促進(jìn)生長(zhǎng)和抗凋亡的作用。CDCA7作為一個(gè)食管鱗癌相關(guān)基因發(fā)揮促癌作用，不僅能通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)而直接影響ESCC細(xì)胞的周期、增殖、EMT進(jìn)程和侵襲轉(zhuǎn)移等，更有意義的是，CDCA7通過調(diào)控RIPK1的表達(dá)而影響TNF?α對(duì)ESCC細(xì)胞的作用。

技術(shù)研發(fā)人員：崔永萍,李泓漪,劉慧娟,成曉龍,李修博,張宇,翁泳佳,張玲
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山西醫(yī)科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15