本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，涉及一種具有可變形性的抗原遞送載體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、傳染性疾病是由各種病原體所引起的，主要包括病毒、細(xì)菌、真菌或者寄生蟲等。接種疫苗是最為有效的防控策略，但常規(guī)疫苗制劑如鋁鹽佐劑及油乳佐劑均傾向于誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，其細(xì)胞免疫應(yīng)答效果不佳，導(dǎo)致無法有效清除病毒并實(shí)現(xiàn)多種異型病毒的交叉保護(hù)。因此，如何提高細(xì)胞免疫應(yīng)答效率是實(shí)現(xiàn)疫苗制劑更為高效、全面的免疫治療效果的關(guān)鍵。

2、誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的關(guān)鍵在于抗原被抗原提呈細(xì)胞攝取及其從溶酶體中的逃逸效率。疫苗接種通常是采用肌肉或皮下注射，外周組織中抗原提呈細(xì)胞數(shù)量有限，游離抗原與其不能充分接觸，難以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)抗原的有效攝取。此外，游離抗原被細(xì)胞攝取后，大多通過溶酶體途徑被加工提呈，難以有效提升細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，提高抗原被抗原提呈細(xì)胞攝取效率并從溶酶體中高效逃逸是產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答亟待解決的問題。目前，常規(guī)抗原遞送載體多傾向于從單一層面上解決問題，難以同時(shí)實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)。

3、因此，亟需提供一種用于抗原遞送的產(chǎn)品，提高抗原利用率，同時(shí)提升體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，實(shí)現(xiàn)高效的疫苗免疫應(yīng)答效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種具有可變形性的抗原遞送載體及其制備方法以及一種增強(qiáng)雙重免疫應(yīng)答的抗原遞送系統(tǒng)。

2、為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種具有可變形性的抗原遞送載體，所述具有可變形性的抗原遞送載體具有水包油包水型乳液結(jié)構(gòu)，其中內(nèi)水相為含有正電性納米顆粒的懸濁液，油相為含有親油性乳化劑的油性物質(zhì)，外水相為含有親水性乳化劑的溶液。

4、本發(fā)明所涉及的抗原遞送載體是一種乳液制劑，其具有水包油包水(w1/o/w2)結(jié)構(gòu)，并且以含有正電性納米顆粒的懸濁液為內(nèi)水相，以含有親油性乳化劑的油性物質(zhì)為油相，以含有親水性乳化劑的溶液為外水相，使得該乳液制劑具有可變形性，與細(xì)胞接觸時(shí)可發(fā)生應(yīng)力形變，由球形變成扁球形，接觸位點(diǎn)從點(diǎn)擴(kuò)展到面，顯著增加了乳滴與細(xì)胞膜之間的接觸面積，模仿病原體與細(xì)胞間的動(dòng)態(tài)相互作用，增強(qiáng)細(xì)胞攝??；同時(shí)內(nèi)水相中的納米顆粒可高效吸附或包埋抗原，提高其生物利用率，并且正電性的納米顆?？蓮?qiáng)化“質(zhì)子泵效應(yīng)”，促使溶酶體快速溶脹破裂釋放內(nèi)部抗原。因此其能夠顯著提升機(jī)體免疫應(yīng)答尤其是細(xì)胞免疫應(yīng)答，實(shí)現(xiàn)了對(duì)傳染性疾病等更為高效和全面的免疫防護(hù)。

5、優(yōu)選地，所述油相與外水相的體積比為(1-4):(2-11)，所述內(nèi)水相與油相的體積比為(1-3):(2-7)。

6、所述油相與外水相的體積比可以選擇1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、2:3、2:5、2:7、2:9、2:11、3:4、3:5、3:7、3:10、4:5、4:7、4:9、4:11等，內(nèi)水相與油相的體積比可以選擇1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、2:3、2:5、2:7、3:5、3:7等，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他點(diǎn)值均可選擇，在此不再一一贅述。

7、本發(fā)明將油相與內(nèi)水相以及外水相的體積比控制在上述特定的數(shù)值范圍內(nèi)，能夠進(jìn)一步提高乳液制劑的可變形性，增加乳滴與細(xì)胞膜之間的接觸面積，增強(qiáng)細(xì)胞攝取。

8、優(yōu)選地，所述水包油包水型乳液結(jié)構(gòu)中，油包水乳滴的粒徑為100nm-10μm，例如可以是100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、900nm、1μm、2μm、3μm、5μm、6μm、7μm、8μm、10μm等，水包油包水乳滴的粒徑為200nm-20μm，例如可以是200nm、300nm、500nm、700nm、800nm、1μm、2μm、4μm、6μm、8μm、10μm、12μm、14μm、16μm、18μm、20μm等，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他點(diǎn)值均可選擇，在此不再一一贅述。

9、優(yōu)選地，所述正電性納米顆粒的電位為5-40mv，例如5mv、6mv、7mv、8mv、9mv、10mv、12mv、15mv、16mv、18mv、20mv、23mv、25mv、27mv、29mv、30mv、32mv、35mv、37mv、39mv、40mv等，粒徑為10-900nm，例如10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、120nm、140nm、160nm、180nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm等，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他點(diǎn)值均可選擇，在此不再一一贅述。

10、優(yōu)選地，所述正電性納米顆粒的多分散系數(shù)pdi小于0.3，例如0.01、0.02、0.05、0.07、0.08、0.1、0.15、0.18、0.2、0.3等，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他點(diǎn)值均可選擇，在此不再一一贅述。

11、優(yōu)選地，所述正電性納米顆粒包括殼聚糖和/或殼聚糖衍生物納米顆粒。

12、本發(fā)明所涉及的殼聚糖納米顆?；驓ぞ厶茄苌锛{米顆?？梢圆捎帽炯夹g(shù)領(lǐng)域公知技術(shù)方法或者現(xiàn)有技術(shù)已公開的方法進(jìn)行制備，例如離子交聯(lián)法、納米沉淀法、熱固化法、單相凝膠成球法等。

13、優(yōu)選地，所述殼聚糖衍生物包括殼聚糖鹽酸鹽和/或殼聚糖季銨鹽。

14、優(yōu)選地，所述殼聚糖的分子量為20-1000kda，例如20kda、50kda、100kda、300kda、500kda、600kda、800kda、1000kda等，脫乙酰度為80-95％，例如80％、85％、90％、95％等，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他點(diǎn)值均可選擇，在此不再一一贅述。

15、優(yōu)選地，所述油性物質(zhì)為藥品級(jí)油性物質(zhì)，包括角鯊烯、生育酚或亞油酸乙酯中的任意一種或者至少兩種的組合。

16、其中角鯊烯是由6個(gè)異戊二烯構(gòu)成的無環(huán)三萜烯，其化學(xué)名稱為2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，分子式為c30h50；角鯊烯存在于許多植物和動(dòng)物中，其中在鯊魚肝臟中含量尤其豐富?；诮酋徬┑娜閯┦菓?yīng)用最為廣泛的疫苗佐劑之一，可以增強(qiáng)免疫反應(yīng)，并延長免疫反應(yīng)應(yīng)答時(shí)間。

17、其中生育酚是一種脂溶性維生素，由α-，β-，γ-，δ-生育酚這四種生育酚同系物組成，其中α-生育酚活性最強(qiáng)。作為疫苗組分，參與調(diào)節(jié)某些趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)，如趨化因子2(ccl2)、趨化因子3(ccl3)、白介素6(il-6)、趨化因子1(cxcl1)等，可以增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞對(duì)抗原的攝取，并增加引流淋巴結(jié)處募集的先天免疫細(xì)胞數(shù)量。

18、其中亞油酸乙酯是一種脂肪酸乙酯化合物，是亞油酸與乙醇反應(yīng)生成的，化學(xué)式為c20h36o2，具有良好的抗氧化性，能夠減輕氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷。

19、優(yōu)選地，所述親油性乳化劑包括失水山梨醇三油酸酯、硬脂酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、po-500或arlacel?p135中的任意一種或至少兩種的組合。

20、優(yōu)選地，所述親油性乳化劑在油相中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-20％，例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、13％、15％、16％、18％、19％、20％等，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他點(diǎn)值均可選擇，在此不再一一贅述。

21、優(yōu)選地，所述親水性乳化劑包括吐溫80、吐溫85、泊洛沙姆、聚氧乙烯單棕櫚酸酯、聚氧乙烯蓖麻油或聚氧乙烯烷基醚中的任意一種或至少兩種的組合。

22、優(yōu)選地，所述親水性乳化劑在外水相中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-30％，例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、13％、15％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％等，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他點(diǎn)值均可選擇，在此不再一一贅述。

23、優(yōu)選地，所述外水相和內(nèi)水相的ph值獨(dú)立地選自5.5-8.5，例如5.5、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.1、7.3、7.5、7.7、7.8、7.9、8.0、8.2、8.3、8.5等，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他點(diǎn)值均可選擇，在此不再一一贅述，更優(yōu)選6.0-8.0。

24、優(yōu)選地，所述外水相和內(nèi)水相的溶液獨(dú)立地選自純化水、注射用水、0.9％生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸緩沖液或tris緩沖液中的任意一種或者至少兩種的組合。

25、優(yōu)選地，所述外水相的溶液為磷酸鹽緩沖液、檸檬酸緩沖液或tris緩沖液中的任意一種或者至少兩種的組合。

26、優(yōu)選地，所述內(nèi)水相的溶液為純化水、注射用水、0.9％生理鹽水或磷酸鹽緩沖液中的任意一種或者至少兩種的組合。

27、在本發(fā)明中，所述抗原遞送載體的楊氏模量為0.2-50mpa，例如0.2mpa、0.4mpa、0.5mpa、0.6mpa、0.8mpa、1mpa、3mpa、5mpa、7mpa、9mpa、10mpa、12mpa、13mpa、15mpa、16mpa、18mpa、20mpa、22mpa、23mpa、25mpa、27mpa、29mpa、30mpa、32mpa、34mpa、36mpa、38mpa、40mpa、41mpa、43mpa、45mpa、46mpa、48mpa、49mpa、50mpa等，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他點(diǎn)值均可選擇，在此不再一一贅述。

28、在本發(fā)明中，所述抗原遞送載體與細(xì)胞接觸時(shí)的夾角范圍為10-70°，例如可以是10°、15°、20°、22°、24°、26°、28°、30°、33°、35°、37°、38°、40°、42°、44°、45°、47°、50°、55°、60°、70°等，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他點(diǎn)值均可選擇，在此不再一一贅述。

29、第二方面，本發(fā)明提供根據(jù)第一方面所述的具有可變形性的抗原遞送載體的制備方法，所述制備方法包括：

30、將正電性納米顆粒分散于內(nèi)水相溶液中，然后與含有親油性乳化劑的油性物質(zhì)混合進(jìn)行均質(zhì)乳化，得到油包水乳液；再與含有親水性乳化劑的外水相溶液混合進(jìn)行均質(zhì)乳化，得到水包油包水乳液，即得所述具有可變形性的抗原遞送載體。

31、第三方面，本發(fā)明提供一種增強(qiáng)雙重免疫應(yīng)答的抗原遞送系統(tǒng)，所述抗原遞送系統(tǒng)包括第一方面所述的具有可變形性的抗原遞送載體以及抗原，其中抗原吸附于正電性納米顆粒的表面或者包埋于正電性納米顆粒的內(nèi)部。

32、優(yōu)選地，所述抗原負(fù)載量為正電性納米顆粒質(zhì)量的0.1-10％，例如0.1％、1％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％等，上述數(shù)值范圍內(nèi)其他點(diǎn)值均可選擇，在此不再一一贅述。

33、在本發(fā)明所述抗原可以是單價(jià)抗原或者是多價(jià)抗原；抗原可以來自但不限于雞胚培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、攜帶者體液、器官或組織中純化分離所得、重組基因表達(dá)或化學(xué)合成所得，優(yōu)選抗原包括但不限于減毒疫苗、滅活疫苗、裂解疫苗、亞單位疫苗、多糖結(jié)合疫苗、重組疫苗或dna疫苗等中的任意一種或者至少兩種的組合。例如減毒疫苗和滅活疫苗的組合，裂解疫苗和亞單位疫苗的組合，多糖結(jié)合疫苗、重組疫苗的組合，dna疫苗和減毒疫苗的組合，滅活疫苗和裂解疫苗的組合，亞單位疫苗、多糖結(jié)合疫苗、重組疫苗和dna疫苗的組合。

34、第四方面，本發(fā)明提供第三方面所述的增強(qiáng)雙重免疫應(yīng)答的抗原遞送系統(tǒng)的使用方法，通過免疫接種進(jìn)行注射給藥，給藥方式包括皮下注射、肌肉注射、淋巴結(jié)內(nèi)注射、腹腔注射、靜脈注射或足下注射中的任意一種。

35、第五方面，本發(fā)明提供第一方面所述的抗原遞送載體或第三方面所述的增強(qiáng)雙重免疫應(yīng)答的抗原遞送系統(tǒng)在制備抗傳染病藥物中的應(yīng)用。

36、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

37、本發(fā)明提供的抗原遞送載體具有可變形性，在與細(xì)胞接觸時(shí)可以通過變形增大接觸面積，同時(shí)內(nèi)水相中的正電性顆?？筛咝交虬窨乖岣咂渖锢枚?，并利用顆粒的正電性強(qiáng)化“質(zhì)子泵效應(yīng)”，促進(jìn)溶酶體破裂釋放抗原，使細(xì)胞免疫應(yīng)答效果大幅提升，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)體液及細(xì)胞雙重免疫應(yīng)答的增強(qiáng)。