一種基于熒光硅納米顆粒的藥物載體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種熒光納米材料藥物載體的制備方法，具體涉及一種基于熒光硅納米顆粒的藥物載體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，許多納米材料如介孔二氧化娃結(jié)構(gòu)，氧化石墨稀和碳納米管等(參見:ACS Nano 2010，4，529-539 ;Angew.Chem.1nt.Ed.2011，50，8853-8857 ;Small2011, 7，460-464.)被用于設(shè)計(jì)成納米藥物載體，其高效的化學(xué)治療和腫瘤治療效率得到了廣泛的關(guān)注。光學(xué)成像指導(dǎo)腫瘤治療是同時(shí)進(jìn)行腫瘤成像和治療的一種高效方案。熒光納米載體，如異硫氰酸熒光素(FITC)摻雜的二氧化硅納米微球(參見:Angew.Chem.1nt.Ed.2011，50，640-643.)，綠色熒光蛋白摻雜的金納米微束(參見:J.Am.Chem.Soc.2012，134,5722-5725.)，I1-VI族熒光量子點(diǎn)負(fù)載的磷脂微膠(參見:ACS Nano2013，7，6667-6673.)，作為光成像指導(dǎo)腫瘤治療的有效工具被廣泛研宄。然而，以上所提到的納米藥物載體本身并不具有熒光，因而需要額外摻雜熒光材料，如FITC，綠色熒光蛋白，和I1-VI族量子點(diǎn)等。盡管在光指導(dǎo)癌癥治療領(lǐng)域已取得巨大進(jìn)步，然而，目前發(fā)現(xiàn)摻雜所得到的納米藥物載體大都面臨弱的光學(xué)性質(zhì)(如:有機(jī)染料和熒光蛋白嚴(yán)重的光漂白性質(zhì))和安全問(wèn)題(如:量子點(diǎn)內(nèi)含重金屬的潛在危害)。此外，得到的這些熒光納米載體通常具有相對(duì)大的尺寸(25?100納米)，在生物應(yīng)用中引起安全問(wèn)題(如:水動(dòng)力半徑小于10納米的納米顆粒更有利于體內(nèi)外應(yīng)用)。因此，發(fā)展具有好的光學(xué)性質(zhì)(如:強(qiáng)熒光和光穩(wěn)定性好)和良好生物相容性的小尺寸新型熒光納米載體依然勢(shì)在必行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種基于熒光硅納米顆粒的熒光藥物載體的制備方法。
[0004]與傳統(tǒng)硅技術(shù)相比，硅納米結(jié)構(gòu)(如:納米點(diǎn)、納米線、納米球等)具有良好的生物相容性，優(yōu)良的光電性質(zhì)，在體內(nèi)易降解和極易進(jìn)行表面修飾的優(yōu)點(diǎn)(參見:Nature 2000,408, 440-444 ；Science 2003,299, 1874-1877 ；J.Am.Chem.Soc.2007, 129, 7228-7229 ；Angew.Chem.1nt.Ed.2009, 121, 134-138 ； J.Am.Chem.Soc.2009, 131，4434-4438 ；J.Am.Chem.Soc.2011, 133，14192-14195 ；Nat.Mater.2009，8，331-336 ；Nano Lett.2012，12，5532-5538.)。因而，硅納米材料被廣泛用于生物領(lǐng)域。尤其是娃納米顆粒(silicon nanoparticles,簡(jiǎn)稱SiNPs)由于獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)和良好的生物相容性引起廣泛關(guān)注并被研宄作為生物探針用于長(zhǎng)程生物成像(參見:Angew.Chem.1nt.Ed.2009, 121, 134-138 ； J.Am.Chem.Soc.2009, 131, 4434-4438 ； J.Am.Chem.Soc.2011, 133, 14192-14195 ；Angew.Chem.1nt.Ed.2011, 50, 3080-3083 ；Angew.Chem.1nt.Ed.2012，51，8485-8489 ；J.Am.Chem.Soc.2013，135，8350-8356.)
[0005]基于上述理論基礎(chǔ)，具體的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0006]本發(fā)明的基于熒光硅納米顆粒的藥物載體的制備方法，包括下述步驟:
[0007]用緩沖溶液將硅納米顆粒配成20?2000微克每毫升的體系，加入50?350微摩每升的抗腫瘤藥物混合混勾，在20?37攝氏度下振蕩3?30小時(shí)，超濾離心并用相同的緩沖溶液清洗3?10次，除去濾液，得到硅納米顆粒-抗腫瘤藥物復(fù)合物。
[0008]優(yōu)選的，所述的硅納米顆粒粒徑為2?4納米。
[0009]該尺寸的硅納米顆粒具有強(qiáng)熒光、超小尺寸、光穩(wěn)定性好等特性，可以由“一步法”微波方法制備，表面為大量氨基基團(tuán)。
[0010]優(yōu)選的，所述的緩沖溶液pH為4?10。
[0011]優(yōu)選的，所述的緩沖溶液為PB緩沖液、PBS緩沖液或碳酸鹽緩沖液，其中PB緩沖液表示磷酸鹽緩沖液，PBS緩沖液表示含氯化鈉的磷酸鹽緩沖液。
[0012]優(yōu)選的，所述的抗腫瘤藥物為鹽酸阿霉素或紫杉醇。
[0013]本發(fā)明以熒光硅納米顆粒復(fù)合鹽酸阿霉素(DOX)為例，做負(fù)載效率測(cè)定及熒光硅納米顆粒-鹽酸阿霉素(SiNP-DOX)復(fù)合物對(duì)體外和體內(nèi)癌癥細(xì)胞的殺傷研宄，但不限于DOX，紫杉醇(PTX)及其他的抗腫瘤藥物亦同樣適用。
[0014]將上層未結(jié)合的DOX溶液用紫外-可見-近紅外光譜儀測(cè)定DOX在特定吸收峰處的吸光值，從而計(jì)算出硅納米顆粒載藥效率，其負(fù)載效率不低于78毫克每克，甚至可以達(dá)到270毫克每克以上。
[0015]利用3-(4，5_ 二甲基噻唑-2)-2，5- 二苯基四氮唑溴鹽標(biāo)準(zhǔn)比色(MTT)法進(jìn)行硅納米顆粒-抗腫瘤藥物復(fù)合物對(duì)體外癌癥細(xì)胞的殺傷研宄，本發(fā)明制備得到的SiNP-DOX復(fù)合物在細(xì)胞層面起到良好的殺傷癌細(xì)胞的作用；在4?5周齡雌性Balb/c裸鼠右側(cè)背部皮下注射0.1?0.2毫升密度為5 X 16?2 X 10 7的癌細(xì)胞懸液進(jìn)行硅納米顆粒-抗腫瘤藥物復(fù)合物對(duì)體內(nèi)癌癥細(xì)胞的殺傷研宄，本發(fā)明制備得到的SiNP-DOX復(fù)合物在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)，增加了小鼠存活率。
[0016]本發(fā)明的方法所制得的熒光硅納米顆粒-抗腫瘤藥物復(fù)合物在細(xì)胞及活體層面不僅能夠起到良好的殺傷癌細(xì)胞的作用，還能夠起到藥物緩釋從而在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。由于熒光硅納米顆粒本身所具有的強(qiáng)熒光、光穩(wěn)定性好、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，所制得的納米藥物載體不需要額外的摻雜熒光材料、操作安全、快速簡(jiǎn)便，可以作為納米藥物載體廣泛用于光成像指導(dǎo)的癌癥治療領(lǐng)域。
【附圖說(shuō)明】
[0017]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的有關(guān)本發(fā)明的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0018]圖1是本發(fā)明制備得到的SiNP-DOX復(fù)合物在細(xì)胞層面殺傷癌細(xì)胞的對(duì)比曲線圖；
[0019]圖2是本發(fā)明制備得到的SiNP-DOX復(fù)合物在活體層面通過(guò)藥物緩釋殺傷癌細(xì)胞，抑制腫瘤生長(zhǎng)的對(duì)比曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0021]以下【具體實(shí)施方式】中用到的儀器、藥品試劑包括:恒溫振蕩器、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、紫外-可見-近紅外光譜儀、PB緩沖液、PBS緩沖液、碳酸鹽緩沖液、鹽酸阿霉素、改良型1640培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、低糖DMEM培養(yǎng)基、3-(4，5- 二甲基噻唑-2) -2，5- 二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、濃鹽酸、生理鹽水。
[0022]實(shí)施例1
[0023](I) SiNP-DOX 復(fù)合物制備
[0024]用200微升pH = 9的PB緩沖液將硅納米顆粒配成200微克每毫升溶液，然后和200微升50微摩每升的DOX溶液混合于600微升離心管中，于恒溫振蕩器中25攝氏度下反應(yīng)12個(gè)小時(shí)后，離心機(jī)中超濾離心，PB緩沖液清洗可得到SiNP-DOX復(fù)合物溶液備用。
[0025](2) DOX裝載效率
[0026]收集超濾離心后的濾液，即含有自由DOX的濾液，利用紫外-可見光-近紅外光譜儀通過(guò)比色法測(cè)定490納米處吸光值，計(jì)算得到裝載效率約為80毫克每克。
[0027](3) SiNP-DOX復(fù)合物細(xì)胞毒性研宄
[0028]將含20微克每毫升SiNP-DOX復(fù)合物的高糖DMEM培養(yǎng)基，加入含有HeLa細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育24小時(shí)，經(jīng)MTT法用酶標(biāo)儀檢測(cè)570納米處吸光值。經(jīng)計(jì)算HeLa細(xì)胞存活率下降到約20%。
[0029]實(shí)施例2
[0030](I) SiNP-DOX 復(fù)合物制備
[0031]用200微升pH = 9的PB緩沖液將硅納米顆粒配成200微克每毫升溶液，然后和200微升100微摩每升的DOX溶液混合于600微升離心管中，于恒溫振蕩器中25攝氏度下反應(yīng)12個(gè)小時(shí)后，離心機(jī)中超濾離心，PB緩沖液清洗可得到SiNP-DOX復(fù)合物溶液備用。
[0032](2) DOX裝載效率
[0033]收集超濾離心后的濾液，即含有自由DOX的濾液，利用紫外-可見光-近紅外光譜儀通過(guò)比色法測(cè)定490納米處吸光值，計(jì)算得到裝載效率為110毫克每克。
[0034](3) SiNP-DOX復(fù)合物細(xì)胞毒性研宄
[0035]將含5微克每毫升SiNP-DOX復(fù)合物的改良型-1640培養(yǎng)基，加入含有MCF-7細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育48小時(shí)，經(jīng)MTT法用酶標(biāo)儀檢測(cè)570納米處吸光值。經(jīng)計(jì)算MCF-7細(xì)胞存活率下降到約50%。
[0036]實(shí)施例3
[0037](I) SiNP-DOX 復(fù)合物制備
[0038]用200微升pH = 9的PB緩沖液將硅納米顆粒配成200微克每毫升溶液，然后和200微升150微摩每升的DOX溶液混合于600微升離心管中，于恒溫振蕩器中25攝氏度下反應(yīng)12個(gè)小時(shí)后，離心機(jī)中超濾離心，PB緩沖液清洗可得到SiNP-DOX復(fù)合物溶液備用。
[0039](2) DOX裝載效率
[0040]收集超濾離心后的濾液，即含有自由DOX的濾液，利用紫外-可見光-近紅外光譜儀通過(guò)比色法測(cè)定490納米處吸光值，計(jì)算得到裝載效率為150毫克每克。
[0041](3) SiNP-DOX復(fù)合物細(xì)胞毒性研宄
[0042]將含10微克每毫升SiNP-DOX復(fù)合物的改良型-1640培養(yǎng)基，加入含有A549細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育48小時(shí)，經(jīng)MTT法用酶標(biāo)儀檢測(cè)570納米處吸光值。經(jīng)計(jì)算A549細(xì)胞存活率下降到約40%。
[0043]實(shí)施例4
[0044](I) SiNP-DOX 復(fù)合物制備
[0045]用200微升pH = 9的PB緩沖液將硅納米顆粒配成200微克每毫升