復(fù)合細(xì)胞電噴技術(shù)的納米纖維支架制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種復(fù)合細(xì)胞電噴技術(shù)的納米纖維支架制備方法，屬于組織工程納米纖維支架制備與修復(fù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]組織工程利用生物制造技術(shù)將種子細(xì)胞接種在可降解的生物支架材料上進(jìn)行體外培養(yǎng)或植入體內(nèi)組織器官缺損部位，隨著生物材料的逐漸降解和吸收，細(xì)胞不斷增殖并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，最終形成具有正常結(jié)構(gòu)和功能的活體組織，完成對組織的修復(fù)和再造。
[0003]近年來，由于納米材料研宄的迅速發(fā)展，使得人們對靜電紡絲技術(shù)的有了更進(jìn)一步的研宄，和拉升、相分離等方法相比，靜電紡絲技術(shù)已經(jīng)成為制取納米纖維支架最重要最有效的方法。靜電紡絲技術(shù)制備出的納米纖維支架可以提供較高的孔隙率以及較好的連通性，與細(xì)胞在體內(nèi)的生存環(huán)境較為類似，因此在醫(yī)學(xué)上，納米纖維支架得到了也越來越廣泛的應(yīng)用。目前構(gòu)建組織工程納米纖維支架的常見方法如下:
其一:在制備出來的納米纖維支架上直接接種細(xì)胞。這種方法接種出來的含細(xì)胞的納米纖維支架主要存在以下缺陷:(I)支架的上細(xì)胞的分辨率比較低，致部分支架部位細(xì)胞數(shù)目較多，部分地方細(xì)胞數(shù)目較小，而分布數(shù)目少的部分新生組織的生長速度會(huì)比較緩慢；
(2)支架的細(xì)胞吸附率較低，支架在逐漸講解時(shí)有可能導(dǎo)致細(xì)胞的脫落，使得纖維材料外露，而組織相容性差的材料還有可能直接導(dǎo)致纖維素的沉積和血栓的形成；(3)細(xì)胞通過支架的由表面向內(nèi)迀移生長，這種單方向生長與自然組織細(xì)胞的三維均衡環(huán)境相差很遠(yuǎn)，影響了細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-支架的相互作用，以及組織的發(fā)育；(4)只能制作出尺寸較小的支架，并且由于外部營養(yǎng)物質(zhì)的滲透能力有限，支架中心的部位細(xì)胞獲得營養(yǎng)成分較少，從而導(dǎo)致細(xì)胞營養(yǎng)不良，生長緩慢，無法形成血管化。
[0004]其二:采用細(xì)胞懸浮液與纖維支架材料進(jìn)行混合同時(shí)通過電紡絲設(shè)備紡絲出來形成含細(xì)胞的納米纖維支架。這種方法從一定意義上解決了直接接種支架存在的一些問題，但是也不可避免的存在一定的不足:細(xì)胞在與材料的混合過程中，由于采用人工方法手動(dòng)進(jìn)行混合，可能無法使細(xì)胞混合均勻，從而難以形成均一的含細(xì)胞的混合溶液，而且在電紡絲過程中，細(xì)胞與材料同時(shí)紡出，生物材料與細(xì)胞之間的相互作用會(huì)對細(xì)胞造成一定的損傷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對以上出現(xiàn)的問題，提出一種復(fù)合細(xì)胞電噴技術(shù)的納米纖維支架制備方法，其制備出來的復(fù)合支架能夠保持細(xì)胞分布的高分辨率，并且能夠有效進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸。制備方法為利用高壓電源同時(shí)電噴細(xì)胞懸浮液以及可降解的高分子生物材料，以構(gòu)建出具有生物活性的且細(xì)胞具有高分辨率的納米纖維支架，為組織修復(fù)技術(shù)提供一種更為行之有效的技術(shù)方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案: 一種復(fù)合細(xì)胞電噴技術(shù)的納米纖維支架制備方法，聚合物材料和細(xì)胞懸浮液分別通過不同的電噴裝置同時(shí)噴出制備而成，該方法包括以下步驟:
步驟一，首先取20ml左右去離子水于磁力攪拌器上加熱至沸騰狀態(tài)，然后采用電子天平稱取1.86g水溶性的可降解的高分子聚合物，在均勻攪拌情況下將加熱的去離子水緩慢加入到聚合物材料中至20g，至充分溶脹后升溫到80~100°C以加速溶解，直至充分溶解完畢；待取得均一的高分子溶液后，將溶液放置于震蕩球磨機(jī)中研磨90分鐘；
步驟二，將研磨好的高分子溶液在120°C的蒸汽壓力鍋中進(jìn)行高溫消毒半小時(shí)，消毒之后將高分子溶液吸入1ml注射器中；
步驟三，將人的細(xì)胞用4ml的含0.25%胰蛋白酶的胰蛋白酶溶液消化后再用同體積的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行中和，并將所得的混合溶液收集于50ml的離心管中，lOOOr/min離心5分鐘，去除上清液，并重新加入5ml細(xì)胞培養(yǎng)液，采用移液槍吹打形式使細(xì)胞分布均勻，形成細(xì)胞懸浮液，并將所得的細(xì)胞懸浮液吸入1ml注射器中；
步驟四，采用的電噴設(shè)備含有兩個(gè)電噴裝置，分別將高分子聚合物溶液和細(xì)胞懸浮液放置于不同的兩個(gè)電噴裝置上，兩個(gè)電噴裝置平行放置，并在注射器針頭上分別加上8KV、14KV的直流電壓，接收裝置采用圓形不銹鋼板，針頭和接收板之間的距離為15cm，并將接收板連接高壓電源的負(fù)極電位；微量泵實(shí)現(xiàn)將高分子聚合物溶液和細(xì)胞懸浮液分別以500ul/min和300ul/min的穩(wěn)定流量進(jìn)行供料，持續(xù)電噴2小時(shí)，即可得到采用復(fù)合電噴方法制備而成的含細(xì)胞的納米纖維支架。
[0007]優(yōu)選地，所述步驟一的水溶性可降解高分子聚合物為聚乙烯醇(PVA)。
[0008]優(yōu)選地，所述步驟三的細(xì)胞為人的脂肪干細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0009]優(yōu)選地，所述步驟四所采用的電噴設(shè)備包含雙路高壓電源與雙路微量泵。
[0010]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，具有以下顯而易見的突出實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著優(yōu)點(diǎn):
一，本發(fā)明將活細(xì)胞的懸浮液與高分子聚合物材料通過不同的電噴裝置同時(shí)電噴在同一個(gè)接收板上，使得細(xì)胞能夠均勻單一的分布在高分子聚合物材料形成的納米纖維支架上，顯著提高了細(xì)胞在支架上的分辨率；
二，由于細(xì)胞與支架同時(shí)制備，所以支架內(nèi)部與外部存在相同的細(xì)胞，有利于細(xì)胞之間的交互作用，便于細(xì)胞的迀移，同時(shí)也有利于支架外部營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸。
[0011]三，設(shè)備配合上位機(jī)進(jìn)行操作，簡單易行，同時(shí)也極大地提高了復(fù)合支架制備的效率，減少了支架制備時(shí)間。
【附圖說明】
[0012]圖1為制備復(fù)合細(xì)胞電噴技術(shù)的納米纖維支架的系統(tǒng)的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例結(jié)合附圖詳述如下:
如圖1所示為制備復(fù)合細(xì)胞電噴技術(shù)的納米纖維支架的系統(tǒng)示意圖。其中:計(jì)算機(jī)連接PMAC控制卡，控制卡連接雙路高壓電源、第一微量泵和第二微量泵，不銹鋼接收板放置于絕緣墊板上，位置處于兩個(gè)微量泵下方正中間部位，第一注射器連接第一微量泵，第二注射器連接第二微量泵，高壓電源的兩個(gè)正極分別加載在第一注射器的針頭和第二注射器的針頭上，負(fù)極加載在圓形的不銹鋼接收板上。第一注射器內(nèi)設(shè)有細(xì)胞懸浮液。第二注射器內(nèi)設(shè)有聚合物溶液。
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