一種靶向金銀合金納米籠的藥物遞送系統(tǒng)的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種靶向金銀合金納米籠的藥物遞送系統(tǒng)(制劑)的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]基因治療(gene therapy)是將目的基因?qū)牖颊叩奶囟ńM織和細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷或異常而引起的疾病，從而達(dá)到治療疾病的目的?；蛑委熍c傳統(tǒng)治療方法相比，具有無(wú)可爭(zhēng)議的優(yōu)越性。它從根源上修正了引起疾病的異?；颍梢赃x擇性地治療多種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病并且取得了一定的治療效果。目前，基因治療已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。然而，裸露的基因治療藥物存在易被核酶降解、細(xì)胞內(nèi)吞效果差和細(xì)胞靶向能力差等缺點(diǎn)，因此，需要尋求合適的載體，將基因治療藥物有效地輸遞到革G細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)尚效的基因治療。開(kāi)發(fā)安全、尚效的基因遞送載體成為基因治療的關(guān)鍵所在。
[0003]目前的基因載體可主要分為病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體因具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及表達(dá)效率高的特點(diǎn)，但易導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，例如毒性，免疫效應(yīng)、致癌性以及炎癥反應(yīng)等。非病毒載體是新興的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，具有低毒、低免疫反應(yīng)、外源基因整合幾率低、無(wú)基因插入片斷大小限制，以及使用簡(jiǎn)單、制備方便、便于保存和檢驗(yàn)等優(yōu)勢(shì)，因此已經(jīng)成為當(dāng)今基因治療領(lǐng)域里一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。常見(jiàn)的非病毒性載體主要有:陽(yáng)離子脂質(zhì)體、陽(yáng)離子聚合物、無(wú)機(jī)材料納米粒等。
[0004]金納米粒子具有良好的生物活性、光熱效應(yīng)以及作為藥物載體越來(lái)越受到生物醫(yī)學(xué)研究者的青睞。金銀合金納米籠狀結(jié)構(gòu)(Nanocages)代表一類新型的在紅外區(qū)域可調(diào)局域表面等離子體共振峰(LSPR)的納米金結(jié)構(gòu)，它除了獨(dú)特的空心內(nèi)部以及多孔壁特征外，還具有良好的機(jī)械柔韌性和穩(wěn)定性，LSPR峰可調(diào)控性，粒徑小，比表面積大，利于載藥，容易功能修飾以提高生物相容性和靶向性等優(yōu)勢(shì)使其在診斷治療學(xué)應(yīng)用方面獨(dú)樹(shù)一幟。金納米籠對(duì)700?IlOOnm范圍的近紅外光具有高吸收特性，同時(shí)生物系統(tǒng)對(duì)此范圍的近紅外光具有高度透過(guò)性，因此可利用金銀合金納米籠的光熱轉(zhuǎn)換特性對(duì)腫瘤進(jìn)行激光熱療。金銀合金納米籠是藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體，同時(shí)也是發(fā)揮熱療效應(yīng)的主體，可作為基因治療藥物增敏劑和靶向熱敏劑。
[0005]由于常見(jiàn)的治療會(huì)引起嚴(yán)重的全身性毒副作用，這些毒副作用病人往往難以耐受，因此其在臨床應(yīng)用受到了很大的限制。這主要是因?yàn)樗幬镞f送系統(tǒng)缺乏對(duì)腫瘤細(xì)胞的辨識(shí)能力。傳統(tǒng)注射給藥使藥物均勻分布于全身，腫瘤部位藥物濃度較低，藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也傷害了人體內(nèi)的正常細(xì)胞。因此，在腫瘤治療中如何實(shí)現(xiàn)減毒增效的目標(biāo)已成為了世界矚目的焦點(diǎn)。通過(guò)藥劑學(xué)手段開(kāi)發(fā)抗腫瘤靶向藥物遞送系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)減輕腫瘤化療藥物毒副作用、提高腫瘤藥物靶向性、增加其抗腫瘤療效的重要手段，也是目前藥劑學(xué)的研究熱點(diǎn)。目前研究最多的靶頭有葉酸(FA)、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)、精氨酸-甘氨酸_天冬酰胺(NGR)等。葉酸受體在許多癌細(xì)胞，比如肝癌，卵巢癌，肺癌，腦癌，腎癌，乳腺癌的表達(dá)顯著高于正常組織細(xì)胞，在某些情況下，甚至上調(diào)了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。葉酸與葉酸受體具有較高的親和力，即便在葉酸與葉酸共聚物濃度較低的情況下，其也可與葉酸受體高效地結(jié)合。同時(shí)，由于價(jià)格便宜，無(wú)毒，無(wú)免疫原性，易與載體結(jié)合，穩(wěn)定性高，葉酸作為配體被廣泛應(yīng)用。
[0006]目前，通過(guò)靶向金銀合金納米籠基因載體負(fù)載基因藥物形成藥物遞送系統(tǒng)，特別是在腫瘤治療藥物中的應(yīng)用尚未見(jiàn)有報(bào)道。因此，本發(fā)明的研制成功具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義和實(shí)際的臨床意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)上述情況，克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種靶向金銀合金納米籠的藥物遞送系統(tǒng)的制備方法及應(yīng)用，可有效解決現(xiàn)有腫瘤治療藥物副作用大、治療效果不佳的問(wèn)題。
本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，該系統(tǒng)是由靶向金銀合金納米籠基因載體負(fù)載基因藥物形成的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，其中，靶向金銀合金納米籠基因載體和基因藥物的質(zhì)量比為(1-12) X 16:1，所述的金銀合金納米籠基因載體是將靶向腫瘤分子葉酸和陽(yáng)離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI)以化學(xué)鍵和靜電作用的方式連接在金銀合金納米籠的表面構(gòu)成；
所述的聚乙烯亞胺(PEI)為Mw 25000的bPE1、Mw 25000的LPEI或Mw1800的bPEI中的一種；所述的基因藥物為質(zhì)粒DNA、siRNA、microRNA或IncRNA中的一種；所述的革El向金銀合金納米籠的粒徑為50-150nm，其制備方法由以下步驟實(shí)現(xiàn):
1)將8-10mg葉酸、7-8mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、4_5mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)置于20ml pH值為4_7的PBS緩沖液中，室溫磁力攪拌2_12h，得活化的葉酸溶液；
2)稱取帶有活性基團(tuán)的PEG40-60mg加入到活化的葉酸溶液中，用0.1M NaOH溶液調(diào)pH值為7-9，室溫磁力攪拌12-24h，用分子量為3500Da的透析袋透析48_72h，除去未反應(yīng)的葉酸，得帶有活性基團(tuán)PEG的SH-PEG-NH2K應(yīng)溶液；
3)取金銀合金納米籠200-300ml加入到步驟2)制備的反應(yīng)溶液中，攪拌混合均勻，用
0.1M NaOH溶液調(diào)溶液pH值為7-9，室溫磁力攪拌4_48h，12000r/min離心15_30min，得沉淀物；將沉淀物再加入到步驟2)制備的反應(yīng)溶液中，攪拌混合均勻，用0.1M NaOH溶液調(diào)溶液PH值為7-9，室溫磁力攪拌4-48h，12000r/min離心15_30min，棄去上清，得沉積物，如此重復(fù)3-5次，將沉積物用超純水分散，得PEG化的靶向金銀合金納米籠溶液；
4)稱取含有巰基的小分子化合物l_5mg溶于乙醇2-10ml中，加入到步驟3)制備的PEG化的靶向金銀合金納米籠溶液中，室溫磁力攪拌4-24h混合均勻，8000-12000r/min離心15-30min，棄去上清液，得沉積物，將沉積物用超純水重新分散；然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) 2-5mg、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) l_4mg，室溫?cái)嚢?-24h，再加入含有20-60mg的聚乙烯亞胺水溶液2_8ml，用1.2M稀鹽酸調(diào)溶液pH值為6_7，室溫?cái)嚢?.5-24h，12000r/min離心15_30min，棄去上清，得沉淀，沉淀再重新分散于超純水中，在12000r/min離心15-30min，如此重復(fù)離心3-5次，即得靶向金銀合金納米籠基因載體； 所述的巰基小分子化合物是11-巰基烷酸、硫辛酸、巰基乙酸、巰基丙酸中的一種；
5)將上述所制得的靶向金銀合金納米籠基因載體與基因藥物以質(zhì)量比為(1-12) X 16: 1，將靶向金銀合金納米籠基因載體的水溶液在渦旋的狀態(tài)下，逐滴加入到基因藥物水溶液中，渦旋30-120S，室溫孵育30-60min，即成靶向金銀合金納米籠的藥物遞送系統(tǒng)。
[0008]所述的靶向金銀合金納米籠的藥物遞送系統(tǒng)在制備抗腫瘤基因聯(lián)合熱療藥物中的應(yīng)用，可以用于靜脈注射、肌肉注射、瘤內(nèi)注射和皮下注射、透皮給藥、體內(nèi)植入。
[0009]本發(fā)明的金銀合金納米籠基因載體能夠負(fù)載基因藥物，并能夠革El向腫瘤部位，還具有光熱轉(zhuǎn)換性能，腫瘤局部激光照射，使局部溫度升高從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的光熱治療；本發(fā)明物理化學(xué)穩(wěn)定性良好，制備條件簡(jiǎn)單可行，原料來(lái)源豐富，成本低，副作用小，能有效負(fù)載基因藥物靶向腫瘤部位協(xié)同熱療抑制腫瘤細(xì)胞增殖，是腫瘤基因治療與光熱治療中載體上的創(chuàng)新。
【具體實(shí)施方式】
[0010]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0011]本發(fā)明在具體實(shí)施中可由以下實(shí)施例給出。
[0012]實(shí)施例1
本發(fā)明在具體實(shí)施中，可由以下步驟實(shí)現(xiàn):
1)將1mg葉酸、8mg1_(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽、5mg N-輕基琥珀酰亞胺置于20ml pH值為5的PBS緩沖液中，室溫磁力攪拌12h，得活化的葉酸溶液；
2)稱取帶有活性基團(tuán)的PEG60mg加入到活化的葉酸溶液中，用0.1M NaOH溶液調(diào)pH值為8，室溫磁力攪拌18h，用分子量為3500Da的透析袋透析72h，除去未反應(yīng)的葉酸，得帶有活性基團(tuán)PEG的SH-PEG-NH2K應(yīng)溶液；
3)取金銀合金納米籠300ml加入到步驟2)制備的反應(yīng)溶液中，攪拌混合均勻，用0.1MNaOH溶液調(diào)溶液pH值為9，室溫磁力攪拌48h，12000r/min離心15_30min，得沉淀物；將沉淀物再加入到步驟2)制備的反應(yīng)溶液中，攪拌混合均勻，用0.1M NaOH溶液調(diào)溶液pH值為8，室溫磁力攪拌48h，12000r/min離心15_30min，棄去上清，得沉積物，如此重復(fù)3_5次，將沉積物用超純水分散，得PEG化的靶向金銀合金納米籠溶液；
4)稱取硫辛酸1.5mg溶于乙醇5ml中，加入到步驟3)制備的PEG化的革El向金銀合金納米籠溶液中，室溫磁力攪拌24h混合均勾，8000-12000r/min離心30min，棄去上清液，得沉積物，將沉積物用超純水重新分散；然后加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽2.7mg、N-輕基琥泊酰亞胺1.6mg，室溫?cái)嚢?4h，再加入含有50mg的聚乙稀亞胺水溶液5ml，用1.2M稀鹽酸調(diào)溶液pH值為6.5，室溫?cái)嚢?4h，12000r/min離心15_30min，棄去上清，得沉淀，沉淀再重新分散于超純水中，在12000r/min離心15_30min，如此重復(fù)離心3次，即得靶向金銀合金納米籠基因載體；
5)將上述所制得的靶向金銀合金納米籠基因載體與基因藥物以質(zhì)量比為9X16:
I，將靶向金銀合金納米籠基因載體的水溶液在渦旋的狀態(tài)下，逐滴加入到基因藥物水溶液中，渦旋60s，室溫孵育30min，即成靶向金銀合金納米籠的藥物遞送系統(tǒng)。
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