一種碳納米球粒制劑及其制備方法和抗幽門(mén)螺桿菌感染實(shí)驗(yàn)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種碳納米球粒制劑及其制備方法和抗幽門(mén)螺桿菌感染實(shí)驗(yàn)方法，碳納米球粒制劑由碳納米球粒和分散液混合構(gòu)成，碳納米球粒制劑的濃度為0.1％～1.0％，其中，分散液為去離子水，95％以上的碳納米球粒的粒徑為5～30nm。其具有成本低廉、制備容易、穩(wěn)定性好、安全性高、抗幽門(mén)螺桿菌感染效果好的優(yōu)點(diǎn)。碳納米球粒制劑的制備方法具有實(shí)施容易、工藝簡(jiǎn)單、操作方便的特點(diǎn)。碳納米球粒制劑抗幽門(mén)螺桿菌感染的實(shí)驗(yàn)方法具有實(shí)施方便、科學(xué)合理的特點(diǎn)。本發(fā)明的碳納米球粒制劑可作為治療幽門(mén)螺桿菌感染的新藥開(kāi)發(fā)，為開(kāi)發(fā)抗幽門(mén)螺桿菌的藥物開(kāi)啟了新的思路，也為抗幽門(mén)螺桿菌感染的防治提供了新策略。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
-種碳納米球粒制劑及其制備方法和抗幽口螺桿菌感染實(shí)驗(yàn) 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種碳納米材料，尤其是設(shè)及一種碳納米球粒制劑及其制備方法，W 及該碳納米球粒制劑抗幽口螺桿菌感染的實(shí)驗(yàn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 幽口螺桿菌化elicobacter p^ori，化)感染性相關(guān)疾病，如胃炎、胃潰瘍、十二指 腸潰瘍和胃癌嚴(yán)重危害著人類(lèi)的身體健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)資料統(tǒng)計(jì)，全球約有50% 的人口感染幽口螺桿菌，尤其是我國(guó)的幽口螺桿菌病情較為嚴(yán)峻，大約60%的人感染幽口 螺桿菌，WHO已將幽口螺桿菌歸為胃癌的一類(lèi)致癌因子。目前，治療幽口螺桿菌感染通過(guò)采 用抗生素與胃酸抑制劑的聯(lián)合療法。但由于抗生素的耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重，致使用藥劑量加 大、療程延長(zhǎng)，并伴隨著藥物不良反應(yīng)加重、復(fù)發(fā)率依然居高不下的問(wèn)題。因此，臨床迫切需 要非抗生素的新療法W及抗幽口螺桿菌感染的新策略、新材料。
[0003] 碳納米材料是一類(lèi)新型的納米技術(shù)材料，有著多種用途。碳納米材料中的碳納米 管具有抗菌作用，而碳納米材料中的碳納米球粒(Carbon nanospheres，CNS)具有運(yùn)輸藥物 和巧光示蹤等作用。由于碳納米球粒有著獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和特性，其潛在的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用有待 開(kāi)發(fā)。目前，還沒(méi)有碳納米球?？咕饔玫难芯繄?bào)道，也沒(méi)有碳納米球?？褂目诼輻U菌的研 究報(bào)道。幽口螺桿菌對(duì)機(jī)體的危害，一方面是幽口螺桿菌本身的作用，另一方面是其代謝產(chǎn) 物如尿素酶的作用。幽口螺桿菌能產(chǎn)生大量尿素酶，尿素酶在幽口螺桿菌感染中起定植和 毒力的作用，是致病因子，同時(shí)尿素酶也是治療幽口螺桿菌的祀點(diǎn)。因此，碳納米球?；蚱?制劑如果既能直接抑制或殺滅幽口螺桿菌菌體本身，又能夠抑制或破壞幽口螺桿菌的尿素 酶，那么該碳納米球粒及其制劑就具有巨大的抗幽口螺桿菌應(yīng)用前景。
[0004] 雖然已有將碳納米材料中的納米碳粉制成幽口螺桿菌治療劑的研究，如申請(qǐng)?zhí)枮?2014104902353和2014104898659的專(zhuān)利申請(qǐng)，但其兩者選用的納米碳粉粉體粒徑95% W上 小于等于5nm;帶負(fù)電荷，其治療劑采用人體等滲溶液分散制備，其PH值被控制在7.8~9.1。 其主要存在W下幾方面的問(wèn)題：1)由于其95% W上納米碳粉粉體粒徑為小于等于5nm，因其 粒徑太小容易穿透進(jìn)入人體細(xì)胞，更容易產(chǎn)生毒性或加大毒性;2)因等滲溶液含大量陽(yáng)離 子，帶正電荷，其對(duì)富含負(fù)電荷的納米碳粉粉體的長(zhǎng)期穩(wěn)定性會(huì)產(chǎn)生一定影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種碳納米球粒制劑及其制備方法和抗幽口螺桿菌感染實(shí) 驗(yàn)方法，其中，碳納米球粒制劑具有成本低廉、制備容易、穩(wěn)定性好、安全性高的優(yōu)點(diǎn)，制備 方法具有實(shí)施容易、工藝簡(jiǎn)單、操作方便的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)方法具有實(shí)施方便、科學(xué)合理的特點(diǎn)。
[0006] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中治療幽口螺桿菌感染的傳統(tǒng)療法其存在的抗生素耐藥性越來(lái) 越嚴(yán)重，致使用藥劑量加大、療程延長(zhǎng)、藥物不良反應(yīng)加重和感染復(fù)發(fā)率居高不下的問(wèn)題， 本發(fā)明提供的一種碳納米球粒制劑，由碳納米球粒和分散液混合構(gòu)成，碳納米球粒制劑的 濃度為ο .1%~1.0%，其中，分散液為去離子水，95 % w上的碳納米球粒的粒徑為5~30nm。
[0007] 進(jìn)一步的，本發(fā)明一種碳納米球粒制劑，其中，所述碳納米球粒制劑的PH值為7.1 ~7.6。
[0008] 進(jìn)一步的，本發(fā)明一種碳納米球粒制劑，其中，所述碳納米球粒的粒徑頻數(shù)百分比 為:粒徑為5~lOnm的碳納米球粒占20~30%，粒徑為10~15nm的碳納米球粒占25~35%， 粒徑為15~20nm的碳納米球粒占15~25%，粒徑為20~25nm的碳納米球粒占6~10%，粒徑 為25~3〇11111的碳納米球粒占1~7%。
[0009] 本發(fā)明提供的一種碳納米球粒制劑的制備方法，包括W下步驟：
[0010] -、W石墨締為原始材料加工制備碳納米球粒；
[0011] 二、利用透射電鏡篩選粒徑符合要求的碳納米球粒，其中，粒徑為5~30nm的碳納 米球粒占95 % W上;碳納米球粒呈單個(gè)球形分散；
[0012] Ξ、根據(jù)濃度要求，分別稱(chēng)取經(jīng)步驟二篩選后的碳納米球粒和量取去離子水，備 用；
[0013] 四、將步驟Ξ得到的碳納米球粒和去離子水混合分散；
[0014] 五、對(duì)經(jīng)步驟四混合得到的混合液進(jìn)行攬拌處理，其中，攬拌時(shí)間為10~20分鐘， 攬拌速度為60~80r/min;
[0015] 六、對(duì)經(jīng)步驟五攬拌處理后的混合液進(jìn)行超聲處理，其中，超聲時(shí)間為15~20分 鐘，超聲強(qiáng)度為80~lOOw;
[0016] 屯、利用碳酸氨鋼一碳酸鋼緩沖液對(duì)經(jīng)步驟六超聲處理后的混合液進(jìn)行調(diào)整PH值 處理，將混合液的PH值調(diào)整為7.1~7.6，得到最終的碳納米球粒制劑。
[0017] 進(jìn)一步的，本發(fā)明一種碳納米球粒制劑的制備方法，其中，在步驟二中所述粒徑為 5~30nm的碳納米球粒占95%W上，其中，碳納米球粒的粒徑頻數(shù)百分比為:粒徑為5~1 Onm 的碳納米球粒占20~30%，粒徑為10~15皿的碳納米球粒占25~35%，粒徑為15~20nm的 碳納米球粒占15~25%，粒徑為20~25皿的碳納米球粒占6~10%，粒徑為25~30皿的碳納 米球粒占1~7 %。
[0018] 進(jìn)一步的，本發(fā)明一種碳納米球粒制劑的制備方法，其中，在步驟六中所述對(duì)經(jīng)步 驟五攬拌處理后的混合液進(jìn)行超聲處理，是在低溫水浴下進(jìn)行超聲處理的。
[0019] 進(jìn)一步的，本發(fā)明一種碳納米球粒制劑的制備方法，其中，在步驟六中所述超聲時(shí) 間為15~20分鐘，是指超聲全程時(shí)間為15~20分鐘，其中，單次超聲時(shí)間為3秒，間隙時(shí)間為 3秒。
[0020] 本發(fā)明提供的一種碳納米球粒制劑抗幽口螺桿菌感染的實(shí)驗(yàn)方法，包括W下步 驟：
[0021] I、通過(guò)體外快速尿素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)碳納米球粒制劑對(duì)幽口螺桿菌尿素酶的抑制率；
[0022] Π 、利用透射電鏡觀察碳納米球粒制劑對(duì)幽口螺桿菌的直接損傷作用；
[0023] 虹、根據(jù)步驟I和步驟Π 的結(jié)果分析確定碳納米球粒制劑抗幽口螺桿菌感染的特 性。
[0024] 進(jìn)一步的，本發(fā)明一種碳納米球粒制劑抗幽口螺桿菌感染的實(shí)驗(yàn)方法，其中，在步 驟I中所述通過(guò)體外快速尿素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)碳納米球粒制劑對(duì)幽口螺桿菌尿素酶的抑制率， 包括W下步驟：
[00巧]a、制備及稀釋樣本：用生理鹽水將化licobacter pylori SSI菌液109CFU/ml稀釋 1000倍至106CFU/ml，備用;將濃度分別為1.0%、0.5%、0.4%的^種碳納米球粒制劑用去 離子水稀釋100倍，備用，稀釋后的Ξ種碳納米球粒制劑的濃度分別為100ug/ml、50ug/ml、 40ug/ml;將尿素酶抑制劑乙酷氧朽酸先用去離子水溶解成1%，然后再用去離子水稀釋100 倍，備用;稀釋后的尿素酶抑制劑乙酷氧朽酸濃度為lOOug/ml;取去離子水，備用；其中，尿 素酶抑制劑乙酷氧目虧酸作為陽(yáng)性對(duì)照，去離子水作為陰性對(duì)照；
[0026] b、上樣:在96孔板的孔中加入lOul的106CFU/ml菌液，復(fù)Ξ孔;加完后，按照分組分 別迅速加入100ug/ml、50ug/ml、40ug/mlS種碳納米球粒制劑、去離子水、lOOug/ml乙酷氧 月虧酸各90ul;
[0027] C、解育:上樣后采用封口膜密封96孔板，并在4°C的恒溫箱中解育24小時(shí)；
[00%] d、顯色:解育完后，在相應(yīng)的孔中加入50ul的尿素試劑，并放于37°C的恒溫箱中解 育30分種顯色；
[0029] e、讀數(shù):解育30分種后，在578nm波長(zhǎng)處讀數(shù)，并記錄每組的0D值；
[0030] f、計(jì)算抑制率:抑制率=【1 -(0頓起-0D拍)/(0故服-0D拍)】X 100 %。
[0031] 進(jìn)一步的，本發(fā)明一種碳納米球粒制劑抗幽口螺桿菌感染的實(shí)驗(yàn)方法，其中，在步 驟Π 中所述利用透射電鏡觀察碳納米球粒制劑對(duì)幽口螺桿菌的直接損傷作用，包括W下步 驟：
[0032] g、菌液制備：用生理鹽水將幽口螺桿菌NTCC11637菌液10化FU/ml稀釋10倍至 10化即/ml,備用；
[0033] h、上樣：取12只1ml試管，在每管中加入360ul的10化即/ml幽口螺桿菌NTCC11637 菌液，復(fù)Ξ孔;加完后，按照分組分別迅速加入0.4%、0.1%的碳納米球粒制劑、去離子水、 0.1 %克拉霉素各40ul，混勻;其中，去離子水作為陰性對(duì)照，克拉霉素作為陽(yáng)性對(duì)照；
[0034] i、反應(yīng):上樣后采用封口膜密封孔板，先在37Γ的恒溫?fù)u床搖菌培養(yǎng)10分種，然后 取出并迅速放入37°C的恒溫箱中培養(yǎng)30分種；
[0035] j、染色:取lOOul反應(yīng)液置于透射電鏡銅網(wǎng)上，并用1.0%憐鶴酸負(fù)染色；
[0036] k、觀察:在透射電鏡下觀察幽口螺桿菌的形態(tài)特點(diǎn)，并判斷碳納米球粒制劑對(duì)幽 口螺桿菌直接損傷結(jié)果。
[0037] 本發(fā)明一種碳納米球粒制劑及其制備方法和抗幽口螺桿菌感染實(shí)驗(yàn)方法與現(xiàn)有 技術(shù)相比，具有W下優(yōu)點(diǎn)：（1)本發(fā)明提供的碳納米球粒制劑采用非抗生素的碳納米球粒為 制劑原料，而且將95% W上的球粒粒徑控制在5~30nm，避免了因粒徑過(guò)小對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性 或增大毒性的問(wèn)題，提供了安全性。（2)采用去離子水作為分散液，充分利用碳納米球粒表 面的多孔，增強(qiáng)了吸水性，使碳納米球粒在去離子水中的分散率達(dá)99.5% W上，且因去離子 水不含其他金屬陽(yáng)離子，使帶負(fù)電荷的碳納米球粒不受受陽(yáng)離子影響，在水中呈單個(gè)球形 分散，避免了球粒團(tuán)聚的問(wèn)題，保證了碳納米球粒制劑的高度穩(wěn)定性。（3)本發(fā)明通過(guò)將碳 納米球粒制劑的PH值控制在7.1~7.6，減小或排除了碳納米球粒制劑中PH(抗酸性)對(duì)幽口 螺桿菌生長(zhǎng)的影響，更能突出體現(xiàn)碳納米球粒本身對(duì)幽口螺桿菌的抗菌作用。（4)本發(fā)明的 碳納米球粒制劑具有成本低廉、制備容易、穩(wěn)定性好、安全性高的優(yōu)點(diǎn)，其制備方法具有實(shí) 施容易、工藝簡(jiǎn)單、操作方便的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)方法具有實(shí)施方便、科學(xué)合理的優(yōu)點(diǎn)。（5)實(shí)驗(yàn)表 明，本發(fā)明的碳納米球粒制劑具有突出而強(qiáng)大的抗幽口螺桿菌效果，對(duì)幽口螺桿菌尿素酶 活性抑制率高，所需劑量小;碳納米球粒對(duì)幽口螺桿菌有直接損傷效應(yīng)，對(duì)幽口螺桿菌鞭毛 和細(xì)胞膜細(xì)胞壁損傷明顯。（6)本發(fā)明的碳納米球粒制劑可作為治療幽口螺桿菌感染的新 藥開(kāi)發(fā)，為開(kāi)發(fā)抗幽口螺桿菌的藥物開(kāi)啟了新的思路，也將為抗幽口螺桿菌感染的防治提 供新的策略。
[0038] 下面結(jié)合附圖所示【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明一種碳納米球粒制劑及其制備方法和 抗幽口螺桿菌感染實(shí)驗(yàn)方法作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明：
【附圖說(shuō)明】
[0039] 圖1為通過(guò)透射電鏡(TEM)觀察碳納米球粒制劑對(duì)幽口螺桿菌的直接損傷實(shí)驗(yàn)中， 400ug/ml高劑量碳納米球粒制劑組的幽口螺桿菌形態(tài)圖；
[0040] 圖2為通過(guò)透射電鏡(TEM)觀察碳納米球粒制劑對(duì)幽口螺桿菌的直接損傷實(shí)驗(yàn)中， lOOug/ml低劑量碳納米球粒制劑組的幽口螺桿菌形態(tài)圖；
[0041] 圖3為通過(guò)透射電鏡(TEM)觀察碳納米球粒制劑對(duì)幽口螺桿菌的直接損傷實(shí)驗(yàn)中， lOOug/ml克拉霉素組的幽口螺桿菌形態(tài)圖；
[0042] 圖4為通過(guò)透射電鏡(TEM)觀察碳納米球粒制劑對(duì)幽口螺桿菌的直接損傷實(shí)驗(yàn)中， 去離子水組的幽口螺桿菌形態(tài)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 首先需要說(shuō)明的是，本發(fā)明既提供了一種碳納米球粒制劑，又提供了其制備方法， 同時(shí)還提供了碳納米球粒制劑抗幽口螺桿菌感染的實(shí)驗(yàn)方法。
[0044] 作為【具體實(shí)施方式】，碳納米球粒制劑由碳納米球粒和分散液混合構(gòu)成，并使其濃 度控制在0.1 %~1.0%。其中，分散液為去離子水，95% W上的碳納米球粒的粒徑為5~ 3化m。為減小或排除了碳納米球粒制劑中PH(抗酸性)對(duì)幽口螺桿菌生長(zhǎng)的影響，更能突出 體現(xiàn)碳納米球粒本身對(duì)幽口螺桿菌的抗菌作用，本【具體實(shí)施方式】讓碳納米球粒制劑的PH值 為7.1~7.6。
[0045] 作為優(yōu)化方案，本【具體實(shí)施方式】使碳納米球粒的粒徑頻數(shù)百分比采用W下數(shù)值： 讓粒徑為5~10皿的碳納米球粒占20~30 %，讓粒徑為10~15皿的碳納米球粒占25~35 %， 讓粒徑為15~20nm的碳納米球粒占15~25%，讓粒徑為20~25nm的碳納米球粒占6~10%， 讓粒徑為25~30nm的碳納米球粒占1~7%。
[0046] 本發(fā)明提供的碳納米球粒制劑采用非抗生素的碳納米球粒為制劑原料，而且將 95% W上的球粒粒徑控制在5~30nm，避免了因粒徑過(guò)小對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性或增大毒性的問(wèn) 題，提供了安全性。并通過(guò)采用去離子水作為分散液，充分利用碳納米球粒表面的多孔增強(qiáng) 了吸水性，使碳納米球粒在去離子水中的分散率達(dá)99.5% W上，且因去離子水不含其他金 屬陽(yáng)離子，使帶負(fù)電荷的碳納米球粒不受受陽(yáng)離子影響，在水中呈單個(gè)球形分散，避免了球 粒團(tuán)聚的問(wèn)題，保證了碳納米球粒制劑的高度穩(wěn)定性。同時(shí)，本發(fā)明提供的碳納米球粒制劑 具有成本低廉、制備容易、穩(wěn)定性好、安全性高的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的碳納米球粒 制劑具有突出而強(qiáng)大的抗幽口螺桿菌效果，對(duì)幽口螺桿菌尿素酶活性抑制率高、所需劑量 小。碳納米球粒對(duì)幽口螺桿菌有直接損傷效應(yīng)，對(duì)幽口螺桿菌鞭毛和細(xì)胞膜細(xì)胞壁損傷明 顯。本發(fā)明的碳納米球粒制劑可作為治療幽口螺桿菌感染的新藥開(kāi)發(fā)，為開(kāi)發(fā)抗幽口螺桿 菌的藥物開(kāi)啟了新的思路，也將為抗幽口螺桿菌感染的防治提供新的策略。
[0047]作為【具體實(shí)施方式】，碳納米球粒制劑的制備方法，包括W下步驟：
[004引 一、W石墨締為原始材料加工制備碳納米球粒；
[0049] 二、利用透射電鏡篩選粒徑符合要求的碳納米球粒，其中，粒徑為5~30nm的碳納 米球粒占95 % W上;碳納米球粒呈單個(gè)球形分散；
[0050] Ξ、根據(jù)濃度要求，分別稱(chēng)取經(jīng)步驟二篩選后的碳納米球粒和量取去離子水，備 用；
[0051 ]四、將步驟Ξ得到的碳納米球粒和去離子水混合分散；
[0052] 五、對(duì)經(jīng)步驟四混合得到的混合液進(jìn)行攬拌處理，其中，攬拌時(shí)間為10~20分鐘， 攬拌速度為60~80r/min;
[0053] 六、對(duì)經(jīng)步驟五攬拌處理后的混合液進(jìn)行超聲處理，其中，超聲時(shí)間為15~20分 鐘，超聲強(qiáng)度為80~lOOw;
[0054] 屯、利用碳酸氨鋼一碳酸鋼緩沖液對(duì)經(jīng)步驟六超聲處理后的混合液進(jìn)行調(diào)PH值處 理，將混合液的PH值調(diào)整為7.1~7.6，得到最終的碳納米球粒制劑。
[0055] 在上述步驟二中，所述粒徑為5~30nm的碳納米球粒占95% W上，其中，碳納米球 粒的粒徑頻數(shù)百分比為:粒徑為5~lOnm的碳納米球粒占20~30%，粒徑為10~15nm的碳納 米球粒占25~35%，粒徑為15~20nm的碳納米球粒占15~25%，粒徑為20~25皿的碳納米 球粒占6~10%，粒徑為25~30nm的碳納米球粒占1~7%。
[0056] 在上述步驟六中，所述對(duì)經(jīng)步驟五攬拌處理后的混合液進(jìn)行超聲處理，是在低溫 水浴下進(jìn)行超聲處理的。
[0057] 在上述步驟六中，所述超聲時(shí)間為15~20分鐘，是指超聲全程時(shí)間為15~20分鐘， 其中，單次超聲時(shí)間為3秒，間隙時(shí)間為3秒。
[005引實(shí)施例1:制備碳納米球粒和去離子水。
[0059] W石墨締為原始材料加工制備碳納米球粒，在透射電鏡下篩選粒徑為5~30nm的 碳納米球粒，備用。應(yīng)保證粒徑為5~30nm的碳納米球粒占總量的95 % W上。
[0060] 制備去離子水，備用。
[0061 ] 實(shí)施例2:制備1.0%的碳納米球粒制劑。
[0062] 根據(jù)1.0 %的濃度要求，取定量的碳納米球粒和去離子水混合分散，并攬拌20分 鐘，其中攬拌速度為80r/min。
[0063] 對(duì)攬拌后的混合液進(jìn)行超聲處理，其中超聲全程時(shí)間設(shè)為20分鐘，單次超聲時(shí)間 設(shè)為3秒，間隙時(shí)間設(shè)為3秒，超聲強(qiáng)度設(shè)為lOOw(低溫水浴下超聲）。
[0064] 對(duì)超聲后的混合液采用碳酸氨鋼一碳酸鋼緩沖液進(jìn)行調(diào)PH值處理，并將混合混的 最終PH值調(diào)至7.6，W得到符合要求的碳納米球粒制劑。
[0(?日]實(shí)施例3:制備0.5%的碳納米球粒制劑。
[0066] 根據(jù)0.5%的濃度要求，取定量的碳納米球粒和去離子水混合分散，并攬拌15分 鐘，其中攬拌速度為70r/min。
[0067] 對(duì)攬拌后的混合液進(jìn)行超聲處理，其中超聲全程時(shí)間設(shè)為18分鐘，單次超聲時(shí)間 設(shè)為3秒，間隙時(shí)間設(shè)為3秒，超聲強(qiáng)度設(shè)為lOOw(低溫水浴下超聲）。
[0068] 對(duì)超聲后的混合液采用碳酸氨鋼一碳酸鋼緩沖液進(jìn)行調(diào)PH值處理，并將混合混的 最終PH值調(diào)至7.4，W得到符合要求的碳納米球粒制劑。
[0069] 實(shí)施例4:制備0.2%的碳納米球粒制劑。
[0070] 根據(jù)0.2 %的濃度要求，取定量的碳納米球粒和去離子水混合分散，并攬拌10分 鐘，其中攬拌速度為60r/min。
[0071] 對(duì)攬拌后的混合液進(jìn)行超聲處理，其中超聲全程時(shí)間設(shè)為15分鐘，單次超聲時(shí)間 設(shè)為3秒，間隙時(shí)間設(shè)為3秒，超聲強(qiáng)度設(shè)為80w(低溫水浴下超聲）。
[0072] 對(duì)超聲后的混合液采用碳酸氨鋼一碳酸鋼緩沖液進(jìn)行調(diào)PH值處理，并將混合混的 最終PH值調(diào)至7.2，W得到符合要求的碳納米球粒制劑。
[0073] 實(shí)施例5:制備0.1 %的碳納米球粒制劑。
[0074] 根據(jù)0.2 %的濃度要求，取定量的碳納米球粒和去離子水混合分散，并攬拌10分 鐘，其中攬拌速度為60r/min。
[0075] 對(duì)攬拌后的混合液進(jìn)行超聲處理，其中超聲全程時(shí)間設(shè)為15分鐘，單次超聲時(shí)間 設(shè)為3秒，間隙時(shí)間設(shè)為3秒，超聲強(qiáng)度設(shè)為80w(低溫水浴下超聲）。
[0076] 對(duì)超聲后的混合液采用碳酸氨鋼一碳酸鋼緩沖液進(jìn)行調(diào)PH值處理，并將混合混的 最終PH值調(diào)至7.1，W得到符合要求的碳納米球粒制劑。
[0077] 作為碳納米球粒制劑抗幽口螺桿菌感染的實(shí)驗(yàn)方法的【具體實(shí)施方式】，包括W下步 驟：
[007引I、通過(guò)體外快速尿素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)碳納米球粒制劑對(duì)幽口螺桿菌尿素酶的抑制率；
[0079] Π 、利用透射電鏡觀察碳納米球粒制劑對(duì)幽口螺桿菌的直接損傷作用；
[0080] 虹、根據(jù)步驟I和步驟Π 的結(jié)果分析確定碳納米球粒制劑抗幽口螺桿菌感染的最 終結(jié)果。
[0081] 實(shí)施例6:通過(guò)體外快速尿素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)碳納米球粒制劑對(duì)幽口螺桿菌尿素酶的 抑制率。
[0082] 制備及稀釋樣本：用生理鹽水將Helicobacter pylori SS1菌液109CFU/ml(0D578 =0.6)稀釋1000倍至106C即/ml,備用;將濃度分別為！.0%、0.5%、0.4%的Ξ種碳納米球 粒制劑用去離子水稀釋100倍，備用，稀釋后的Ξ種碳納米球粒制劑的濃度分別為lOOug/ ml、50ug/ml、40ug/ml (用去離子水經(jīng)過(guò)100倍的稀釋后樣本呈PH中性）；將尿素酶抑制劑乙 酷氧目虧酸先用去離子水溶解成1.0%，然后再用去離子水稀釋100倍，備用;稀釋后的尿素酶 抑制劑乙酷氧目虧酸濃度為lOOug/ml;取去離子水，備用；其中，尿素酶抑制劑乙酷氧目虧酸作 為陽(yáng)性對(duì)照，去離子水作為陰性對(duì)照。
[008；3]上樣:在96孔板的孔中加入lOul的106C即/ml菌液，復(fù)立孔;加完后，按照分組分別 迅速加入100ug/ml、50ug/ml、40ug/mlS種碳納米球粒制劑、去離子水、lOOug/ml乙酷氧月虧 酸各90ul。
[0084] 解育:上樣后采用封口膜密封96孔板，并在4°C的恒溫箱中解育24小時(shí)。
[0085] 顯色:解育完后，在相應(yīng)的孔中加入50ul的尿素試劑，并放于37°C的恒溫箱中解育 30分種顯色。
[0086] 讀數(shù):解育30分種后，在578nm波長(zhǎng)處讀數(shù)，并記錄每組的0D值。
[0087] 計(jì)算抑制率:抑制率=【1-(0頓起-0輪)/(0攻順-〇輪)】乂 100%。
[008引 0D值及抑制率結(jié)果如表1
[0089] 表1:碳納米球粒制劑體外快速尿素酶抑制酶活性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表
[0090]
[0091] 通過(guò)表1所列實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本發(fā)明的抗幽口螺桿菌感染的碳納米球粒制劑對(duì)幽 口螺桿菌尿素酶有明顯的抑制作用。
[0092] 實(shí)施例7 :通過(guò)透射電鏡(TEM)觀察碳納米球粒制劑對(duì)幽口螺桿菌的直接損傷作 用。
[0093] 菌液制備：用生理鹽水將幽口螺桿菌NTCC11637菌液109CFU/ml(0D578 = 0.6)稀釋 10 倍至l〇8CFU/ml，備用。
[0094] 上樣:取12只1ml試管，在每管中加入360ul 108CFU/ml的幽口螺桿菌NTCC11637菌 液，復(fù)Ξ孔；加完后，按照分組分別迅速加入0.4%、0.1 %的碳納米球粒制劑、去離子水、 0.1%克拉霉素各40ul，并混勻;其中，去離子水作為陰性對(duì)照，克拉霉素作為陽(yáng)性對(duì)照。 [00%]反應(yīng):上樣后采用封口膜密封孔板，先在37°C的恒溫?fù)u床搖菌培養(yǎng)10分種，然后取 出并迅速放入37 °C的恒溫箱中培養(yǎng)30分種。
[0096] 染色:取lOOul反應(yīng)液置于透射電鏡銅網(wǎng)上，并用1.0%憐鶴酸負(fù)染色。
[0097] 觀察:在透射電鏡(TEM)下觀察幽口螺桿菌的形態(tài)特點(diǎn)，并判斷碳納米球粒制劑對(duì) 幽口螺桿菌直接損傷結(jié)果。
[009引透射電鏡(TEM)下，各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1至圖4所示：
[0099] 400ug/ml高劑量碳納米球粒制劑組圖1所示:幽口螺桿菌未見(jiàn)鞭毛、胞壁胞膜變薄 不完整，細(xì)菌輪廓模糊，結(jié)構(gòu)不清。
[0100] lOOug/ml低劑量碳納米球粒制劑組圖2所示:幽口螺桿菌鞭毛減少，胞壁胞膜不完 整。
[0101] lOOug/ml克拉霉素組圖3所示：幽口螺桿菌胞壁胞膜變薄不完整，鞭毛減少或消 失。
[0102] 去離子水組圖4所示:幽口螺桿菌鞭毛豐富，胞壁胞膜完整，細(xì)菌輪廓清楚，菌體正 常。
[0103] 由此可知，碳納米球粒制劑CNS對(duì)幽口螺桿菌有直接損傷作用。
[0104] W上實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行的描述，并非對(duì)本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)范圍 進(jìn)行的限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域工程技術(shù)人員依據(jù)本發(fā)明的技術(shù) 方案做出的各種形式的變形，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書(shū)確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種碳納米球粒制劑，其特征在于，所述碳納米球粒制劑由碳納米球粒和分散液混 合構(gòu)成，碳納米球粒制劑的濃度為0.1%~1.0%，其中，分散液為去離子水，95 %以上的碳 納米球粒的粒徑為5~30nm。2. 按照權(quán)利要求1所述的一種碳納米球粒制劑，其特征在于，所述碳納米球粒制劑的PH 值為7.1~7.6。3. 按照權(quán)利要求2所述的一種碳納米球粒制劑，其特征在于，所述碳納米球粒的粒徑頻 數(shù)百分比為:粒徑為5~10nm的碳納米球粒占20~30 %，粒徑為10~15nm的碳納米球粒占25 ~35 %，粒徑為15~20nm的碳納米球粒占15~25 %，粒徑為20~25nm的碳納米球粒占6~ 10%，粒徑為25~30nm的碳納米球粒占1~7%。4. 一種權(quán)利要求2所述碳納米球粒制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 一、 以石墨稀為原始材料加工制備碳納米球粒； 二、 利用透射電鏡篩選粒徑符合要求的碳納米球粒，其中，粒徑為5~30nm的碳納米球 粒占95 %以上;碳納米球粒呈單個(gè)球形分散； 三、 根據(jù)濃度要求，分別稱(chēng)取經(jīng)步驟二篩選后的碳納米球粒和量取去離子水，備用； 四、 將步驟三得到的碳納米球粒和去離子水混合分散； 五、 對(duì)經(jīng)步驟四混合得到的混合液進(jìn)行攪拌處理，其中，攪拌時(shí)間為10~20分鐘，攪拌 速度為60~80r/min; 六、 對(duì)經(jīng)步驟五攪拌處理后的混合液進(jìn)行超聲處理，其中，超聲時(shí)間為15~20分鐘，超 聲強(qiáng)度為80~100w; 七、 利用碳酸氫鈉一碳酸鈉緩沖液對(duì)經(jīng)步驟六超聲處理后的混合液進(jìn)行調(diào)整PH值處 理，將混合液的PH值調(diào)整為7.1~7.6，得到最終的碳納米球粒制劑。5. 按照權(quán)利要求4所述的一種碳納米球粒制劑的制備方法，其特征在于，在步驟二中所 述粒徑為5~30nm的碳納米球粒占95%以上，其中，碳納米球粒的粒徑頻數(shù)百分比為:粒徑 為5~10nm的碳納米球粒占20~30%，粒徑為10~15nm的碳納米球粒占25~35%，粒徑為15 ~20nm的碳納米球粒占15~25%，粒徑為20~25nm的碳納米球粒占6~10%，粒徑為25~ 30nm的碳納米球粒占1~7%。6. 按照權(quán)利要求4所述的一種碳納米球粒制劑的制備方法，其特征在于，在步驟六中所 述對(duì)經(jīng)步驟五攪拌處理后的混合液進(jìn)行超聲處理，是在低溫水浴下進(jìn)行超聲處理的。7. 按照權(quán)利要求4所述的一種碳納米球粒制劑的制備方法，其特征在于，在步驟六中所 述超聲時(shí)間為15~20分鐘，是指超聲全程時(shí)間為15~20分鐘，其中，單次超聲時(shí)間為3秒，間 隙時(shí)間為3秒。8. -種權(quán)利要求3所述碳納米球粒制劑抗幽門(mén)螺桿菌感染的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，包 括以下步驟： l、 通過(guò)體外快速尿素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)碳納米球粒制劑對(duì)幽門(mén)螺桿菌尿素酶的抑制率； Π 、利用透射電鏡觀察碳納米球粒制劑對(duì)幽門(mén)螺桿菌的直接損傷作用； m、 根據(jù)步驟I和步驟π的結(jié)果分析確定碳納米球粒制劑抗幽門(mén)螺桿菌感染的特性。9. 按照權(quán)利要求8所述的一種碳納米球粒制劑抗幽門(mén)螺桿菌感染的實(shí)驗(yàn)方法，其特征 在于，在步驟I中所述通過(guò)體外快速尿素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)碳納米球粒制劑對(duì)幽門(mén)螺桿菌尿素酶 的抑制率，包括以下步驟： a、 制備及稀釋樣本：用生理鹽水將Helicobacter pylori SS1菌液109CFU/ml稀釋1000 倍至106CFU/ml，備用;將濃度分別為1.0%、0.5%、0.4%的三種碳納米球粒制劑用去離子 水稀釋100倍，備用，稀釋后的三種碳納米球粒制劑的濃度分別為100ug/ml、50ug/ml、40ug/ ml;將尿素酶抑制劑乙酰氧肟酸先用去離子水溶解成1%，然后再用去離子水稀釋100倍，備 用;稀釋后的尿素酶抑制劑乙酰氧肟酸濃度為l〇〇ug/ml;取去離子水，備用;其中，尿素酶抑 制劑乙酰氧肟酸作為陽(yáng)性對(duì)照，去離子水作為陰性對(duì)照； b、 上樣:在96孔板的孔中加入10ul的106CFU/ml菌液，復(fù)三孔;加完后，按照分組分別迅 速加入1〇〇耶/1111、5〇耶/1111、4〇耶/1111三種碳納米球粒制劑、去離子水、1〇〇1^/1111乙酰氧0虧酸 各90ul; c、 孵育:上樣后采用封口膜密封96孔板，并在4 °C的恒溫箱中孵育24小時(shí)； d、 顯色:孵育完后，在相應(yīng)的孔中加入50ul的尿素試劑，并放于37°C的恒溫箱中孵育30 分種顯色； e、 讀數(shù):孵育30分種后，在578nm波長(zhǎng)處讀數(shù)，并記錄每組的0D值； f、 計(jì)算抑制率:抑制率=【l-(〇Dm〇D33a)/(OD*^-〇Dsa)】X 100%。10.按照權(quán)利要求8所述的一種碳納米球粒制劑抗幽門(mén)螺桿菌感染的實(shí)驗(yàn)方法，其特征 在于，在步驟Π 中所述利用透射電鏡觀察碳納米球粒制劑對(duì)幽門(mén)螺桿菌的直接損傷作用， 包括以下步驟： g、 菌液制備：用生理鹽水將幽門(mén)螺桿菌NTCC11637菌液109CFU/ml稀釋10倍至108CFU/ ml，備用； h、 上樣:取12只lml試管，在每管中加入360ul的108CFU/ml幽門(mén)螺桿菌NTCC11637菌液， 復(fù)三孔;加完后，按照分組分別迅速加入0.4%、0.1 %的碳納米球粒制劑、去離子水、0.1% 克拉霉素各40ul，混勻;其中，去離子水作為陰性對(duì)照，克拉霉素作為陽(yáng)性對(duì)照； i、 反應(yīng):上樣后采用封口膜密封孔板，先在37°C的恒溫?fù)u床搖菌培養(yǎng)10分種，然后取出 并迅速放入37 °C的恒溫箱中培養(yǎng)30分種； j、 染色:取l〇〇ul反應(yīng)液置于透射電鏡銅網(wǎng)上，并用1.0%磷鎢酸負(fù)染色； k、 觀察:在透射電鏡下觀察幽門(mén)螺桿菌的形態(tài)特點(diǎn)，并判斷碳納米球粒制劑對(duì)幽門(mén)螺 桿菌直接損傷結(jié)果。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK105998065SQ201610519621
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月30日
【發(fā)明人】田漢文
【申請(qǐng)人】成都本珍納米生物科技有限公司