一種單層熒光納米二硫化鉬的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及的是一種簡單“綠色”的方法合成單層熒光納米二硫化鉬，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。其特征是通過溶劑將粒徑為微米級別的二硫化鉬粉末分散，借助于超聲的手段，使二硫化鉬粉末分層斷裂，接著離心、真空干燥、純化從而制得納米二硫化鉬，為了增加納米二硫化鉬的溶解性，在溶劑中加入氫氧化鈉。制得的納米二硫化鉬材料單層率好，熒光穩(wěn)定性好，量子產(chǎn)率高。本方法不產(chǎn)生對環(huán)境有害的物質(zhì)，合成過程簡單，制備得到的熒光納米二硫化鉬，與其它納米載體相比，它的優(yōu)點有：載藥量大、毒性小、細胞中示蹤，受外界干擾小等。由于其較高的比表面積和自身的熒光，可以廣泛的應用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【專利說明】一種單層熒光納米二硫化纟目的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及的是一種簡單“綠色”的方法制備單層熒光納米二硫化鑰。

【背景技術(shù)】
[0002]近年來，隨著microRNA(miRNA)在生物體中所起的重要調(diào)控作用逐漸地引起廣大研究者的興趣，對miRNA在細胞內(nèi)的分析檢測要求也越來越高。常見病毒載體對人體有一定的危害，而大多數(shù)非病毒載體轉(zhuǎn)載量少，且缺少靶細胞定向能力。以無機非金屬納米材料為載體，與其它基因載體相比較在靶向運輸和細胞毒性上具有較大的優(yōu)勢因而受到各研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。
[0003]介孔二氧化硅載體作為現(xiàn)今研究比較熱門的納米材料，各種不同的方法探索合成均勻性好，純度高，成本低，方法簡單的介孔二氧化硅。介孔二氧化硅由于其球體上大量的介孔存在，比表面積增加，大大增加了其負載量。而這種納米材料主要有二氧化硅組成，其對生物體的毒性大大降低，在藥物控制釋放等領(lǐng)域得到了大量的應用。
[0004]雖然介孔二氧化硅載體具有諸多優(yōu)點，但是仍然存在一些待解決的問題限制了其在實際中的應用。介孔二氧化硅載體在轉(zhuǎn)載藥物和基因時，需用封堵劑封堵介孔，這增加了實驗步驟，且封堵劑有時對生物體也是有害的。類石墨烯納米材料，由于其極高的比表面積，有報道稱其負載量高達400%，與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體和介孔二氧化硅載體負載量的4倍多。
[0005]本發(fā)明旨在制備一種多功能基因運輸載體。采用液相超聲法制備的單層熒光納米二硫化鑰作為類石墨烯納米材料中新的一員，其自身的熒光，可以在細胞中定位，較小的尺寸對細胞的毒性也幾乎可以不計，高的負載量以提高運輸效率，是一種較好的基因載體，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域能得到廣泛的引用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)如今應用的基因載體的缺陷，發(fā)明了一種具有準零維結(jié)構(gòu)的單層熒光納米二硫化鑰載體，其細胞毒性小，負載量高，自身在細胞中定位，可以用于細胞成像，細胞內(nèi)miRNA檢測時的多功能基因載體。
[0007]為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0008]一種單層熒光納米二硫化鑰材料，其特征在于以微米級別的二硫化鑰粉末為原料，液相超聲法得到熒光納米二硫化鑰，粒徑大小為30-40nm，熒光發(fā)射峰在450_550nm范圍內(nèi)，其中最大熒光發(fā)射峰在470nm處。
[0009]本發(fā)明方法具體步驟為:
[0010]a.將二硫化鑰粉末溶解到溶劑中，配成1-lOmg/mL的懸池液A ；
[0011]b.在步驟a所得的懸濁液A中加入適量氫氧化鈉，使氫氧化鈉的濃度為lmg/mL，得到懸濁液B ；
[0012]c.將步驟b所得的懸濁液B在超聲破碎儀(功率大于100W)中超聲10小時以上，得到懸濁液C ；
[0013]d.將步驟c制得的懸濁液C離心取上清，放入真空干燥箱中干燥，得到粉末；
[0014]e.將一定體積的去離子水加入步驟d所得的粉末中，配成lmg/mL溶液，超聲輔助溶解，用0.22 μ m的過濾膜過濾得到溶液；
[0015]f.用分子量為1000的透析袋去透析步驟e所得的溶液，去除雜質(zhì)小分子，最終得到熒光納米二硫化鑰材料。
[0016]根據(jù)權(quán)利要求2所述的熒光納米二硫化鑰材料的制備方法，其特征在于步驟a中的溶劑最好為N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。
[0017]其中步驟c中超聲時間最好為20小時。
[0018]為了測試所制備多功能材料作為基因載體的實用性，本發(fā)明將單層熒光納米二硫化鑰載體以不同的濃度與HeLa細胞溫浴，并用濃度為100 μ g/mL的載體與帶有熒光集團標記的DNA共同孵育后，轉(zhuǎn)染進入HeLa細胞，最后用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染之后的細胞。本發(fā)明所制備納米二硫化鑰載體在濃度高達200 μ g/mL時，細胞存活率仍然在90%以上，而激光共聚焦顯微鏡觀察到的圖像顯示出載體與DNA在細胞中存在于不同的地方。
[0019]同其他的無機非金屬納米載體相比，我們制備的基因載體具備以下的特點，本發(fā)明制備方法的特點在于:
[0020](I)制備工藝簡單，二硫化鑰載體通過一步法制得，制備周期短，效率高；合成過程不產(chǎn)生任何對環(huán)境有害的物質(zhì)。
[0021](2)應用這種簡單的方法制備的單層熒光納米二硫化鑰單層率高，量子差率高，均一I"生好。
[0022](3)應用這種簡單的方法制備的單層熒光納米二硫化鑰應用于細胞成像和細胞內(nèi)miRNA分析時，細胞毒性小，負載量大。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1NMP為溶劑超聲剝離制備單層熒光納米二硫化鑰TEM圖片。
[0024]圖2NMP為溶劑超聲剝離制備單層熒光納米二硫化鑰AFM圖片。
[0025]圖3NMP為溶劑超聲剝離制備單層熒光納米二硫化鑰熒光圖譜。
[0026]圖4NMP為溶劑超聲剝離制備單層熒光納米二硫化鑰細胞毒性圖。
[0027]圖5NMP為溶劑超聲剝離制備單層熒光納米二硫化鑰/DNA轉(zhuǎn)染細胞激光共聚焦顯微鏡圖片。
[0028]圖6以乙醇水為溶劑超聲剝離制備單層熒光納米二硫化鑰AFM圖片。

【具體實施方式】
[0029]實施例對本發(fā)明作進一步說明，本發(fā)明的保護內(nèi)容不限于以下實例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化都包括在本發(fā)明中，并以權(quán)利要求書為保護范圍。
[0030]實施例1
[0031]以NMP為溶劑超聲剝離制備單層熒光納米二硫化鑰，具體操作步驟如下:
[0032]將10mg粒徑為1.5 μ m的二硫化鑰粉末溶解到1mL NMP中，制備10mg/mL的二硫化鑰懸濁液；在懸濁液中加入1mg氫氧化鈉，使氫氧化鈉的濃度為lmg/mL，再將懸濁液放在功率為200W的超聲破碎儀中間斷累積超聲20h ;接著將超聲得到的溶液放入5mL的離心管中，4500rpm，離心30min，收集取上清液放入真空干燥箱中，120°C干燥過夜；然后將一定體積的去離子水加入干燥所得的粉末中，超聲輔助溶解，用0.22 μ m的過濾膜過濾；最后用分子量為1000的透析袋透析過濾后的溶液，去除雜質(zhì)小分子，最終得到熒光納米二硫化鑰材料。
[0033]將制備好的熒光二硫化鑰納米粒子100μ g/mL與帶有熒光集團標記的DNA共同孵育后，轉(zhuǎn)染進入HeLa細胞，轉(zhuǎn)染12小時后用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染之后的細胞。
[0034]將制備好的熒光納米二硫化鑰溶液按不同的濃度與HeLa細胞孵育，使二硫化鑰納米粒子的最終濃度分別為10、50、100、200 μ g/mL，檢測熒光納米二硫化鑰粒子的毒性。
[0035]產(chǎn)物的TEM見圖1與AFM見圖2所示，由圖可知我們成功制備了單層熒光納米二硫化鑰，納米粒子粒徑在30-40nm之間,粒徑分布均勻,且單層率較高。圖3是制備的納米粒子的熒光光譜，隨著激發(fā)光波長的不同，納米粒子的發(fā)射光的波長也不同，其中最大激發(fā)波長為370nm，最大發(fā)射波長為470nm。圖4與圖5為細胞毒性試驗圖與激光共聚焦顯微鏡圖片，二硫化鑰納米粒子在濃度高達200 μ g/mL時，細胞存活率仍然在90%以上，說明其對細胞的毒性可以忽略不計，而激光共聚焦顯微鏡觀察到的圖像顯示出二硫化鑰納米粒子與DNA在細胞中存在于不同的地方。
[0036]實施例2
[0037]以乙醇水為溶劑超聲剝離制備單層熒光納米二硫化鑰，具體操作步驟如下:
[0038]10mL45 %的乙醇水溶液加入到10mg的二硫化鑰粉末中，并添加氫氧化鈉(lmg/mL)，超聲剝離20小時，離心、真空干燥、過濾后得到產(chǎn)物。如圖6所示，制備的納米粒子單層率較低，且粒徑分布不均勻。
[0039]實施例3
[0040]以異丙醇為溶劑超聲剝離制備單層熒光納米二硫化鑰，具體操作步驟如下:
[0041]1mL異丙醇加入到10mg的二硫化鑰粉末中，并添加氫氧化鈉(lmg/mL)，超聲剝離20小時，離心、真空干燥、過濾后得到產(chǎn)物。制備的納米粒子產(chǎn)率較低。
【權(quán)利要求】
1.一種單層熒光納米二硫化鑰材料，其特征在于以微米級別的二硫化鑰粉末為原料，液相超聲法得到熒光納米二硫化鑰，粒徑大小為30-40nm，熒光發(fā)射峰在450_550nm范圍內(nèi)，其中最大突光發(fā)射峰在470nm處。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種單層熒光納米二硫化鑰材料的制備方法，其特征在于具體步驟為: a.將二硫化鑰粉末溶解到溶劑中，配成1-lOmg/mL的懸池液A； b.在步驟a所得的懸濁液A中加入適量氫氧化鈉，使氫氧化鈉的濃度為lmg/mL，得到懸濁液B ； c.將步驟b所得的懸濁液B在功率大于10W的超聲破碎儀中超聲10小時以上，得到懸濁液C ； d.將步驟C制得的懸濁液C離心取上清，放入真空干燥箱中干燥，得到粉末； e.將一定體積的去離子水加入步驟d所得的粉末中，配成lmg/mL溶液，超聲輔助溶解，用0.22 μ m的過濾膜過濾得到溶液； f.用分子量為1000的透析袋去透析步驟e所得的溶液，去除雜質(zhì)小分子，最終得到熒光納米二硫化鑰材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熒光納米二硫化鑰材料的制備方法，其特征在于步驟a中的溶劑為N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熒光納米二硫化鑰材料的制備方法，其特征在于步驟c中超聲時間為20小時。
【文檔編號】C01G39/06GK104402051SQ201410574973
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月23日
【發(fā)明者】張學記, 代文浩, 孟祥丹, 何柄諭, 董海峰 申請人:北京科技大學