專利名稱：腫瘤壞死因子拮抗劑及其在子宮內(nèi)膜異位癥上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
以腫瘤壞死因子拮抗劑的治療有效量給藥治療和/或預(yù)防子宮內(nèi)膜異位。本發(fā)明的拮抗劑一般在多種分子中選擇。但優(yōu)選的是可溶性TNF受體。該類拮抗劑對(duì)子宮內(nèi)膜異位損害的退化有用。如與其他活性成分合用可使相關(guān)的疾病如不育癥得以改善。
背景技術(shù)：
子宮內(nèi)膜異位是婦女生殖系疾病，其特點(diǎn)為由于子宮內(nèi)膜腺和子宮內(nèi)膜腔外基質(zhì)以及子宮肌肉系統(tǒng)的存在。最常受影響的解剖學(xué)部位為卵巢、子宮骶骨的韌帶、骨盆的腹膜、直腸陰道隔、子宮頸、陰道、輸卵管及外陰。一般子宮內(nèi)膜異位似從直腸陰道隔較深地浸潤下面組織而表面看不到，有時(shí)子宮內(nèi)膜異位的病灶能出現(xiàn)于卵巢外的部位，如肺、膀胱、皮膚、胸膜及淋巴結(jié)。子宮內(nèi)膜異位是進(jìn)行性的在開始時(shí)看到為透明的囊泡，然后在數(shù)年內(nèi)變成紅色并進(jìn)展為黑色的纖維化損害(MacSwee，1993)。
子宮內(nèi)膜異位被認(rèn)為是良性疾病，但子宮內(nèi)膜的損害有時(shí)會(huì)變惡性，與其他惡性疾病一樣，由子宮內(nèi)膜異位衍生的腫瘤是由于并發(fā)活動(dòng)包括生長因子和/或致癌基因調(diào)節(jié)的變化而發(fā)生的。
子宮內(nèi)膜異位是屬于流行于育齡婦女中最常見的婦科疾病，此病見于育齡婦女的約5-10％(Barbieri，1988)。子宮內(nèi)膜組織完全依靠雌激素而繼續(xù)生長，在異位部位也是如此。因而，子宮內(nèi)膜異位在婦女缺少雌激素的月經(jīng)初期前和絕經(jīng)期后罕見，子宮內(nèi)膜的激素敏感是某些常見癥狀如骨盆疼痛和痛經(jīng)的基礎(chǔ)。
子宮內(nèi)膜異位源自于子宮內(nèi)膜細(xì)胞，從子宮播散到其他的能生存細(xì)胞可移植和生長的部位。初始細(xì)胞的散布曾有二種可能性機(jī)制解釋。逆行月經(jīng)為在有月經(jīng)周期婦女的普通現(xiàn)象，可使分離的子宮內(nèi)膜碎片通過月經(jīng)回流液到達(dá)生殖器附近的結(jié)構(gòu)，或者，子宮內(nèi)膜細(xì)胞可以通過子宮靜脈播散并經(jīng)過淋巴系統(tǒng)擴(kuò)展(血行或淋巴播散)，以解釋生殖器結(jié)構(gòu)部位外子宮內(nèi)膜異位的發(fā)生。婦科手術(shù)也能發(fā)生這些播散(MacSween，1993)。
除了子宮內(nèi)膜細(xì)胞播散外，其他因素諸如遺傳體質(zhì)(Malinak等，1980)，以及免疫學(xué)上的變化(Ho等，1997)可決定婦女對(duì)子宮內(nèi)膜異位的易感性。由于子宮內(nèi)膜細(xì)胞在所有婦女的月經(jīng)期的腹膜液中常能見到，因此，哺乳動(dòng)物應(yīng)能以與免疫系統(tǒng)有關(guān)的方法防止子宮內(nèi)膜異位的發(fā)生。一般，逃避宿主免疫反應(yīng)并有足夠雌激素刺激的子宮內(nèi)膜細(xì)胞可以增生，形成大的、肉眼可見的病灶，子宮內(nèi)膜異位因而被認(rèn)為是一種動(dòng)態(tài)過程，存在的損害可生長或被宿主的免疫反應(yīng)消滅，而新的病灶不斷地形成。
通常與子宮內(nèi)膜異位相伴隨的炎癥反應(yīng)，因其增加了腹膜液的容量及腹膜巨噬細(xì)胞的數(shù)量和活力而改變腹膜的環(huán)境。因此，有人提出單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)在子宮內(nèi)膜異位的發(fā)生中起關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞的分泌產(chǎn)物包括RANTES(Hornung等，1997)、白介素-6(Harada等，1997)、白介素-8(Arici等，1996a)、α-腫瘤壞死因子(Overton等，1996)、單核細(xì)胞趨化性蛋白-1(Arici等，1997)在患有這種疾病的婦女的腹膜液中被發(fā)現(xiàn)存在的濃度較高?；加凶訉m內(nèi)膜異位癥的婦女的免疫變化已有闡述，但它們是子宮內(nèi)膜異位的起因還是子宮內(nèi)膜異位所致炎癥的結(jié)果則未闡明(Rana等，1996)。
關(guān)子宮內(nèi)膜異位及其與其他疾病相關(guān)性的知識(shí)至今有限，甚至診斷水平亦如此。雖然子宮內(nèi)膜異位被認(rèn)為是不育癥的主要病因，但對(duì)該疾病的病理生理學(xué)研究是矛盾的且未確定的。由于早期的損害代謝活躍，疼痛或不育癥的程度與疾病的嚴(yán)重程度間的相關(guān)性不大。不育率高于正常群體，并在家兔研究中表明手術(shù)誘發(fā)子宮內(nèi)膜異位后使生育力從75％下降至25％(Hahn等，1986)?，F(xiàn)今發(fā)現(xiàn)患有骨盆疼痛的病人有71％有內(nèi)膜異位，而84％的骨盆痛及不育癥的患者診斷患有子宮內(nèi)膜異位(Koninckx等，1991)。通常當(dāng)子宮內(nèi)膜異位擴(kuò)展到正常的陰道結(jié)構(gòu)被破壞時(shí)可發(fā)生不育癥，同時(shí)當(dāng)子宮內(nèi)膜異位在最低限度時(shí)妊娠率正常。
子宮內(nèi)膜異位影響生育也有不同途徑。如白介素-6、干擾素和腫瘤壞死因子等白細(xì)胞信使都增加，反過來影響卵母細(xì)胞-精子的相互作用。從子宮內(nèi)膜異位的婦女取得的血清樣品在小鼠胚胎模型上發(fā)現(xiàn)有胚胎毒性，并在體外能抑止精子的移動(dòng)(Halme，1991)，當(dāng)加入重組α-腫瘤壞死因子后效力增強(qiáng)(Eisermann，1989)。但是，這些研究并未說明細(xì)胞因子如何影響子宮內(nèi)膜異位的進(jìn)展而僅顯示了這些分子對(duì)精子活力和胚胎細(xì)胞的影響。
激素療法和手術(shù)是當(dāng)今用于治療子宮內(nèi)膜異位的兩種治療方式，對(duì)子宮內(nèi)膜異位的現(xiàn)代藥理學(xué)治療需要抑制雌激素的產(chǎn)生，使低激素環(huán)境阻斷異位組織的生長。關(guān)于對(duì)子宮內(nèi)膜異位相關(guān)的不育癥的治療，激素療法對(duì)最輕病癥未證實(shí)其益處，而其他研究顯示它可提高妊娠率(Arici等，1996b)。
激素療法包括高劑量的孕激素、雌激素與孕酮的混合物(在一個(gè)“假妊娠”的治療方案中采用高劑量口服避孕藥丸劑或OCP)、達(dá)那唑(Danazol)(一種炔孕酮的雄激素衍生物)和最近的GnRH激動(dòng)劑。這些激素治療對(duì)骨盆疼痛有效并導(dǎo)致病灶實(shí)質(zhì)性退化，但有一些凹痕。雌激素可刺激及造成子宮內(nèi)膜異位組織的增生，可能由于其對(duì)孕酮不能反應(yīng)，甚至在高劑量亦然，因此OCP可對(duì)有限的病人提供部分的緩解(Dawood，1993)，促孕劑可引起不規(guī)則出血(50％)伴有抑郁、體重增加及液體滯留。達(dá)那唑抑制子宮內(nèi)膜異位引起的多種反應(yīng)，包括在血清中可溶性α-腫瘤壞死因子、白介素-1β和CD8水平的降低(Matalliotakis，1997；Mori，1990)，甾體重新生成的抑制和從其受體上取代雌二醇。達(dá)那唑能在近66-100％的疼痛患者中改善癥狀，但4年后自然復(fù)發(fā)率約為40-50％。達(dá)那唑治療的其他缺點(diǎn)為體重增加和雄激素類副反應(yīng)，可使多達(dá)80％的患者放棄這種治療(Barbieri，1988)。GnRH類似物較天然GnRH更為有效和長效，其作用為去除使所有雌激素敏感組織生長的雌激素刺激物。GnRH類似物的副反應(yīng)主要繼發(fā)于深度血雌激素過少，如骨密度下降，五年后的復(fù)發(fā)率高達(dá)50％(Waller和Shaw，1993)。
根據(jù)病情，如希望生育，外科手術(shù)可以保守性，嚴(yán)重病例可切除子宮、輸卵管和卵巢。在任何情況下，即使有限的外科治療也可導(dǎo)致生育率顯著下降。手術(shù)后妊娠率一般為35～65％，因此患者需要排卵誘導(dǎo)和子宮內(nèi)受精以達(dá)到正常受孕(Koninckx和Martin，1994)。臨床報(bào)告表明在剖腹術(shù)和子宮內(nèi)膜增生切除后，多達(dá)40％的患者在五年內(nèi)需再手術(shù)。甚至在過分的外科手術(shù)后，子宮內(nèi)膜異位引起的疼痛復(fù)發(fā)始終是一個(gè)顯著的問題。外科治療失敗的一些原因可能包括病灶的切除不完全，或未認(rèn)識(shí)到或完全遺漏。許多病灶是顯微的，即使用腹腔鏡放大后肉眼也不能看見。因此，單用手術(shù)不能期望能治愈該疾病(Revelli等，1995)。
由于許多子宮內(nèi)膜異位癥患者受患于傳統(tǒng)治療的缺點(diǎn)(包括激素不平衡的后果、高復(fù)發(fā)率及不育癥)，因此致力于提供子宮內(nèi)膜異位的其他治療。一種可能的治療方法為以使用免疫調(diào)節(jié)分子為代表，它能改善子宮內(nèi)膜異位損害和免疫狀況。該方法對(duì)治療一般癥狀被認(rèn)為是適宜的(Rana等，1996)，但無實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明在子宮內(nèi)膜異位后表達(dá)水平改變的一些細(xì)胞因子中何種為優(yōu)選的治療介入的目標(biāo)。
如前所述，子宮內(nèi)膜異位炎癥反應(yīng)中涉及一些巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)物之一為腫瘤壞死因子(以后簡(jiǎn)稱TNF)。TNF也定義為惡液質(zhì)素，是一種由活性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放的多效性細(xì)胞因子。TNF是干擾素、白介素和集落刺激因子細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的一員，通過誘導(dǎo)很多炎癥前變化，包括其他細(xì)胞因子和粘著分子的產(chǎn)生，而在與許多感染和炎癥的發(fā)病機(jī)理有關(guān)的信號(hào)系統(tǒng)中，TNF起著關(guān)鍵作用(Fiers，1991)。
為了方便起見，在本發(fā)明申請(qǐng)的全文中，術(shù)語TNF表示來自動(dòng)物或人的α或β-腫瘤壞死因子，及其天然存在的α-TNF等位基因的集合(Pennica等，1984)。β-TNF也名淋巴毒素，具有同樣的活性，但由不同類型細(xì)胞(淋巴細(xì)胞及天然殺傷細(xì)胞)在對(duì)抗原性或促有絲分裂的刺激發(fā)生應(yīng)答時(shí)產(chǎn)生(Gray等，1984)。
TNF作為成熟的17KDa蛋白被表達(dá)，以三聚物的形式起作用。該復(fù)合物集合細(xì)胞表面的受體而發(fā)揮其生物活性，這些受體在不同的器官及組織介導(dǎo)特定的效應(yīng)。在子宮內(nèi)膜，TNF表達(dá)是在位的和月經(jīng)周期依賴性的(Hunt等，1992)，并在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的子宮內(nèi)膜中導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡(Shalaby等，1989)。用TNF預(yù)處理間皮細(xì)胞后，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞與間皮細(xì)胞的粘連顯著地增加(Zhang等，1993)，由此支持了TNF可能對(duì)子宮內(nèi)膜異位的發(fā)生和/或發(fā)展起作用的觀點(diǎn)。
TNF通過結(jié)合一類膜結(jié)合受體分子，包括文獻(xiàn)中定義為TNF-RI的p55TNF受體I，和文獻(xiàn)中定義為TNF-RII的p75 TNF受體，以發(fā)揮其正常發(fā)育及免疫系統(tǒng)功能所需的活性(Bazzoni和Beatler，1996)。TNF-RI轉(zhuǎn)導(dǎo)TNF信號(hào)的優(yōu)勢(shì)被假定為激動(dòng)對(duì)受體特異的抗體以模擬大部分TNF誘導(dǎo)的反應(yīng)的能力(Shalaby等，1990)。TNF結(jié)合到其膜結(jié)合受體后經(jīng)過諸如TRADD和TRAP-1(TNF-RI)或TRAF-1和TRAF-2(TNF-RII)的胞漿調(diào)節(jié)劑觸發(fā)信號(hào)通道，導(dǎo)致不同的細(xì)胞反應(yīng)，如T細(xì)胞增殖、體外腫瘤細(xì)胞溶解、皮膚壞死、胰島素抗性和細(xì)胞調(diào)亡。兩種TNF受體的細(xì)胞外部分均可脫落，這些可溶性受體保持結(jié)合TNF的能力，與TNF形成高親和力的復(fù)合物使TNF失活，從而減少TNF對(duì)靶細(xì)胞膜受體的結(jié)合(Nophar等，1990)。
小鼠在給予雌二醇和/或黃體酮后，在子宮內(nèi)膜，膜結(jié)合TNF受體水平受影響，造成暫時(shí)的和細(xì)胞類型特異性TNF-RI的表達(dá)(Roby等，1996)。但是，這些研究與涉及子宮內(nèi)膜異位的各種模型上進(jìn)行的其他研究一樣，在子宮內(nèi)膜異位病灶的發(fā)展過程中，對(duì)TNF和TNF-RI的真正體內(nèi)效應(yīng)，不論是膜一結(jié)合或可溶性，都沒有給出任何提示，僅對(duì)子宮內(nèi)膜異位有關(guān)的免疫學(xué)異常作了敘述。
發(fā)明概述本專利申請(qǐng)基于這樣的假定，即TNF拮抗劑可以通過隔絕循環(huán)TNF，阻斷子宮內(nèi)膜異位損害的進(jìn)展。該假定由實(shí)施例中研究報(bào)告所確證，該報(bào)告表明在大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭蠺NF拮抗劑明顯地減小子宮內(nèi)膜異位樣病灶。作為申請(qǐng)者的研究結(jié)果，在此提供了在個(gè)體治療和/或預(yù)防子宮內(nèi)膜異位的方法，包括給予治療有效量的TNF拮抗劑。
在第二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在個(gè)體中治療和/或預(yù)防與子宮內(nèi)膜異位相關(guān)的不育癥的方法，包括以TNF拮抗劑治療有效量與其他藥物組合的給藥。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是將TNF拮抗劑與藥學(xué)上可接受的載體用于制備治療子宮內(nèi)膜異位的藥物組合物。
在本發(fā)明中，TNF拮抗劑的給藥可以是非胃腸道或其他有效的配方。非胃腸道給藥的任何方式包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)和皮下給藥都合適。除了藥學(xué)上可接受的載體外。本發(fā)明的組合物還可含有少量的添加劑，諸如穩(wěn)定劑、賦形劑、緩沖劑和防腐劑。
在本發(fā)明方法中有用的TNF拮抗劑包括可溶性TNF受體分子、抗-TNF抗體和預(yù)防和/或抑制TNF受體發(fā)出信號(hào)的化合物。可以單獨(dú)使用TNF拮抗劑或與其他TNF拮抗劑配合使用。與一種或多種藥學(xué)活性產(chǎn)品配合也可以，特別用以改善子宮內(nèi)膜異位相關(guān)的不育癥患者的狀況。
發(fā)明的描述本發(fā)明在此清楚地顯示在大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭杏肨NF拮抗劑隔絕(sequestering)TNF(此為患子宮內(nèi)膜異位癥后的腹膜液內(nèi)幾種細(xì)胞因子中唯一的其表達(dá)水平增加者)減輕子宮內(nèi)膜異位樣病灶，得到意想不到的結(jié)果。這個(gè)模型還證明了在不明顯影響激素平衡和自然殺傷細(xì)胞活力的情況下獲得此效果。用TNF拮抗劑減輕子宮內(nèi)膜異位損傷且還能改善生育率，因?yàn)樯辰Y(jié)構(gòu)的正?；谥踩肼噬嫌蟹e極的效果。
因此，本發(fā)明的主要目的是提供在個(gè)體中給予治療有效量的TNF拮抗劑以治療和/或預(yù)子宮內(nèi)膜異位的方法。
在第二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在個(gè)體中給予治療有效量的TNF拮擠劑與其他藥物的組合以治療與子宮內(nèi)膜異位相關(guān)的不育癥狀況的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是用TNF拮抗劑配以藥學(xué)上可接受的載體用于制備治療和/或預(yù)防子宮內(nèi)膜異位的藥物組合物。用這種方法制備藥物組合物也是本發(fā)明的另一個(gè)目的。
本申請(qǐng)要求保護(hù)的組合物的活性成分為TNF拮抗劑。要求保護(hù)的TNF拮抗劑以一種或兩種方式發(fā)揮其作用。第一，拮抗劑以其足夠的親和力及特異性自身結(jié)合于或隔絕TNF分子以實(shí)質(zhì)地中和負(fù)責(zé)TNF受體結(jié)合的TNF表位(以后稱為“隔絕拮抗劑”)。此外，TNF拮抗劑可以抑制在TNF結(jié)合后由細(xì)胞表面受體活化的TNF信號(hào)通道(以后稱為“信號(hào)拮抗劑”)。按照本發(fā)明，在治療子宮內(nèi)膜異位上此兩種拮抗劑不論單獨(dú)或一起使用都是有用的。
TNF拮抗劑可用常規(guī)從待選物中篩選出其在體外易感細(xì)胞系(例如人類B細(xì)胞，TNF可使增殖并分泌Ig)上對(duì)天然TNF的活性，容易地鑒別和評(píng)定其效果。測(cè)定包括不同稀釋程度的待選拮抗劑的TNF制劑，例如，在測(cè)定中所用的TNF摩爾量的0.1至100倍，對(duì)照組不加TNF或僅加拮抗劑(Tucci等，1992)。
隔絕拮抗劑是本發(fā)明的優(yōu)選TNF拮抗劑。在隔絕拮抗劑中以高親和力結(jié)合TNF和低免疫原性的多肽為優(yōu)選?？扇苄訲NF受體分子和TNF中和抗體為特別優(yōu)選?？扇苄訲NF受體分子和中和TNF抗體為特別優(yōu)選。例如，TNF-RI和TNF-RII在本發(fā)明中有用。按照本發(fā)明，這些受體的截短形含有受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)或其功能部位的為特別優(yōu)選的拮抗劑。TNF受體的截短形為可溶性的且在尿和血清中檢出為30kDa和40kDa TNF抑制結(jié)合蛋白，原名分別為TBPI和TBPII(Engelmann等，1990)。受體分子的衍生物、片斷、區(qū)域和生物活性部分功能性地組成了能用于本發(fā)明的受體分子。受體分子的一些生物活性等同物或衍生物指所述多肽的部分，或編碼受體分子的序列，其具有足夠的大小，并能與TNF結(jié)合，其親和力使與膜結(jié)合TNF受體的相互作用受抑制或阻斷。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，人可溶性TNF-RI是對(duì)患者投藥的TNF拮抗劑。天然的和重組的可溶性TNF受體分子及其制備方法在歐洲專利申請(qǐng)EP308,378，EP98,327和EP433,900中已有闡述。
本發(fā)明方法中有用的受體分子的另一些例子是TNF受體多亞基(multimeric)分子和TNF免疫受體融合分子。本發(fā)明中有用的TNF受體多亞基分子包括通過一個(gè)或多個(gè)多肽連接物連接的兩個(gè)或多個(gè)TNF受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)的全部或一個(gè)功能部分。多亞基分子還可包括一個(gè)分泌性蛋白的信號(hào)肽以直接表達(dá)多亞基分子。這些多亞基分子及其產(chǎn)生方法已在歐洲專利申請(qǐng)EP526,905中敘述。
本發(fā)明方法中有用的TNF免疫受體融合分子含有一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白分子的至少一部分及一個(gè)或多個(gè)TNF受體的全部或功能性部分。這些免疫受體融合分子可以裝配成單體或異多亞基或同多亞基。免疫受體融合分子亦可為單價(jià)或多價(jià)。TNF免疫受體融合分子及其產(chǎn)生方法曾在歐洲專利申請(qǐng)EP620,739，相應(yīng)于PCT專利申請(qǐng)WO94/06476中敘述。
本發(fā)明方法中有用的另一類隔絕拮抗劑以抗TNF抗體為代表，包括單克隆、嵌合人源化和重組抗體及其片斷，其特征為在體內(nèi)高親和力地與TNF結(jié)合和低毒性。可用于本發(fā)明的抗體其特征是對(duì)患者進(jìn)行足夠時(shí)間的治療使子宮內(nèi)膜異位的損害退化有效至良效，減輕癥狀和低毒性。中和抗體可由TNF免疫兔或小鼠等動(dòng)物而容易地產(chǎn)生。免疫小鼠特別有用于提供B細(xì)胞的來源，用于制造雜交瘤，再經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生大量的抗TNF單克隆抗體。嵌合抗體為免疫球蛋白分子，其特征為具有二個(gè)或多個(gè)來自不同動(dòng)物種族的片段或部分。通常嵌合抗體的可變區(qū)來自非人類的哺乳動(dòng)物抗體如鼠單克隆抗體，免疫球蛋白恒定區(qū)來自人的免疫球蛋白分子。優(yōu)選地，二個(gè)區(qū)域及其組合具有常規(guī)測(cè)定的低免疫原性(Elliott等，1994)。人源化抗體是由基因工程技術(shù)制造的免疫球蛋白分子，其中鼠恒定區(qū)用人的對(duì)應(yīng)部分替代而保留鼠的抗原結(jié)合區(qū)域。生成的鼠—人嵌合抗體對(duì)人類有降低免疫原性及改善藥代動(dòng)力學(xué)(Knight等，1993)。在本發(fā)明方法中有用的優(yōu)選的高親和力單克隆抗體及其嵌合衍生物的例子在歐洲專利申請(qǐng)EP186,833和PCT專利申請(qǐng)WO92/16553中敘述。
TNF拮抗劑可由多種途徑對(duì)個(gè)體給藥。給藥途徑包括皮內(nèi)、經(jīng)皮(例如，在緩釋制劑中)，肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈、皮下、口服、硬膜外、局部及鼻腔內(nèi)途徑。任何其他治療有效的給藥途徑均可應(yīng)用，例如通過上皮或內(nèi)皮組織吸收或通過基因治療，其中，將編碼TNF拮抗劑的DNA分子對(duì)患者投藥(如通過載體)使TNF拮抗劑在體內(nèi)表達(dá)和分泌。此外，TNF拮抗劑可與其他生物活性劑如藥學(xué)上可接受的表面活性劑、賦形劑、稀釋劑或任何其他載體一起給藥。
“藥學(xué)上可接受”的定義指包括任何不影響活性成分生物活性的有效性和對(duì)服藥的宿主無毒性的載體。例如，TNF拮抗劑可在諸如鹽水、右旋糖溶液、血清白蛋白及林格氏液中配制成單劑量注射劑型供非胃腸道給藥。
TNF拮抗劑可與藥學(xué)上可接受的非胃腸道用載體(如水、鹽水、右旋糖溶液)和維持等滲的添加劑(如甘露醇)或化學(xué)穩(wěn)定劑(如防腐劑和緩沖劑)一起配伍成溶液、混懸劑、乳劑或凍干粉，供非胃腸道(如靜脈、皮下、肌內(nèi))給藥。制劑用常用技術(shù)滅菌。
可用接合方法使在人體內(nèi)的半衰期增加而改善TNF拮抗劑的生物利用度，例如在PCT專利申請(qǐng)WO92/13095所述將此分子與聚乙二醇結(jié)合。
TNF拮抗劑的治療有效量是許多變量的函數(shù)，包括拮抗劑的類型、拮抗劑對(duì)TNF的親和力、拮抗劑顯示的任何殘留細(xì)胞毒性、給藥途徑、患者的臨床狀況(包括維持內(nèi)源性TNF活性的無毒性水平的需要性)、隔絕劑中多個(gè)TNF結(jié)合部位的存在，如抗體。
“治療有效量”為注射后該TNF拮抗劑引起TNF生物活性抑制的劑量。給予個(gè)體單劑或多劑量時(shí)，給藥劑量根據(jù)多種因素而不同，包括TNF拮抗劑的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、給藥途徑、患者狀況和特性(性別、年齡、體重、健康狀況、體型)、癥狀程度、并存的治療、治療頻率和期望的效果。已建立的劑量范圍的調(diào)節(jié)和操作是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)及測(cè)定個(gè)體TNF抑制的體外和體內(nèi)方法范圍內(nèi)的。
由于在人臨床試驗(yàn)中TNF最大耐受劑量范圍達(dá)約25微克/米2體表面/24小時(shí)，拮抗劑的給藥劑量通常不需要超過中和該TNF量計(jì)算所得的劑量。因而TNF拮抗劑的摩爾劑量可以變化約從0.001至10倍于TNF最大耐受摩爾劑量，盡管如上所述它在很大程度上受治療離散性的影響。
此外，在臨床研究中所得的數(shù)據(jù)，其中罹患子宮內(nèi)膜異位婦女的腹膜液中TNF濃度的增加已用多種方案證明(Eisermann等，1988；Halme，1991；Overton等，1996)，也可用于對(duì)擬給藥的TNF拮抗劑有效劑量的測(cè)定。
通常活性成分的每日劑量可為每公斤體重約0.01至100毫克。一般每日每公斤體重1-40毫克，分次或以緩釋劑型給藥，可有效地得到期望的結(jié)果。對(duì)個(gè)體的第二次或以后的給藥可以用相同的、少于或大于開始劑量或以前的劑量。第二次或以后的給藥可以在子宮內(nèi)膜異位或有關(guān)癥狀復(fù)發(fā)前給藥。術(shù)語“復(fù)發(fā)”或“再出現(xiàn)”定義為包括子宮內(nèi)膜異位癥狀的一次或更多次的出現(xiàn)。
TNF拮抗劑可以對(duì)個(gè)體在以其他治療方案或制劑(如多種藥物治療方案)治療之前、同時(shí)或相繼以治療有效量進(jìn)行預(yù)防或治療，特別對(duì)不育癥的治療。TNF拮抗劑在與其他治療劑同時(shí)給藥時(shí)可以同一組合物或不同的組合物給藥。特別在希望治愈子宮內(nèi)膜異位伴有的不育癥時(shí)，可以給予生物活性人絨毛膜促性腺激素(hCG)、黃體化激素(LH)或卵泡刺激素(FSH)，以天然的高度純化形式或以重組形式給藥。這些分子及其制備方法曾在歐洲專利申請(qǐng)EP160,699，EP211,894和EP322,438中敘述。
本發(fā)明現(xiàn)在可用實(shí)施例說明，該實(shí)施例并不企圖以任何方式限制本發(fā)明，并參照附圖進(jìn)行說明。


圖1表示抗排卵肽(2毫克/公斤，每3日皮下給予)，重組可溶性TNF-RI(10毫克/公斤，一星期內(nèi)分二個(gè)日劑量皮下給予)對(duì)實(shí)驗(yàn)性子宮內(nèi)膜異位大鼠在最后一次治療后2天及9天的移植物大小的治療效果。這些數(shù)據(jù)得自每組6個(gè)動(dòng)物的第一次處死時(shí)間點(diǎn)和每組5個(gè)動(dòng)物的第二次處死時(shí)間點(diǎn)，代表平均抑制百分率±SEM。
圖2表示重組可溶性TNF-RI(10毫克/公斤皮下注射，一周內(nèi)分二次每日劑量給藥)和抗排卵肽(2毫克/公斤皮下注射，每三日給藥一次)在最后治療后二天(組A)和9天(組B)大鼠脾細(xì)胞對(duì)YAC細(xì)胞的大鼠NK活性(釋放51Cr)的效應(yīng)。數(shù)據(jù)代表平均溶解百分率±SEM。
圖3表示與對(duì)照組及抗排卵肽(2毫克/公斤皮下注射，每3天給藥一次)相比，重組可溶性TNF-RI(10毫克/公斤皮下注射在一周內(nèi)分二個(gè)日劑量給予)對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性子宮內(nèi)膜異位的17β-雌二醇血清水平的影響。數(shù)據(jù)代表17β-雌二醇的平均濃度±SEM。
實(shí)施例材料及方法動(dòng)物雌性Sprague-Dawley大鼠(250-275克)購自意大利Charles River(Calco，Lecco，意大利)。動(dòng)物在如下環(huán)境中飼養(yǎng)溫度22±2℃，相對(duì)濕度55±10％，通過HEPA99.997％過濾器以每小時(shí)15±3次換氣通風(fēng)，用24小時(shí)周期內(nèi)12小時(shí)(700-1900)進(jìn)行人工照明。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物在該環(huán)境中適應(yīng)至少一周。動(dòng)物用標(biāo)準(zhǔn)粒狀飼料任意進(jìn)食飼養(yǎng)。
研究藥物抗排卵肽由Bachem(加州，美國)制備和提供，實(shí)施例中所用的人重組可溶性TNF-RI分子具有相當(dāng)于人TNF-RI片段20-180的序列(Nophar等，1990)，在CHO細(xì)胞中制備并由Interpharm Laboratories Ltd.(以色列)以r-hTBP-1的名稱提供。
材料通用細(xì)胞培養(yǎng)材料系購自Gibco BRL，Life Technologies(Paisley，英國)。17β-雌二醇RIA藥盒購自DPC(Los Angeles CA，美國)。Inoketam購自Virbac(Carros，法國)。[51Cr]鉻酸鈉購自NEN Dupont(Boston，MA，美國)。Rompun購自Bayer AG(Leverkusen，德國)。絲縫線7.0購自Ethicon(Pomezia，意大利)。
大鼠子宮內(nèi)膜異位實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀靡郧霸鴶⑹鲞^的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?Jones，1987)經(jīng)過稍許改良以探查重組可溶性TNF-RI在子宮內(nèi)膜異位中的作用。在Inoketam/Rompun的麻醉下，從右子宮角切下自體子宮內(nèi)膜組織片段(長1公分)放入37℃的PBS中?？v向切開子宮部分，不除去子宮肌層而將5×5厘米的切片四角用非吸收性絲縫線移植至腹壁內(nèi)表面上。
子宮內(nèi)膜異位實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭醒芯克幬镄Ч奶讲煨g(shù)如上所述，在麻醉大鼠上手術(shù)引發(fā)實(shí)驗(yàn)性子宮內(nèi)膜異位。此外，另一組大鼠從一個(gè)子宮角同樣移除一個(gè)片段，但植入5×5厘米見方的子宮周圍的脂肪(假手術(shù)組)。另一組大鼠不經(jīng)任何手術(shù)作為正常對(duì)照組。在引發(fā)子宮內(nèi)膜異位后三個(gè)星期，動(dòng)物接受第二次剖腹(治療前剖腹)以評(píng)價(jià)異位子宮內(nèi)膜組織的大小和存活力。用卡尺測(cè)量并記錄表面積(長×寬)。移植物存活的動(dòng)物如表1中所示歸納入指定的治療組，由此在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)得到第一次處死時(shí)間點(diǎn)每組六個(gè)動(dòng)物及第二次處死時(shí)間點(diǎn)每組五個(gè)動(dòng)物。治療在一周的恢復(fù)期后開始進(jìn)行。對(duì)照組單給鹽水，另一組用以前提出的給藥方案每三天接受皮下注射抗排卵肽2毫克/公斤共三次，以抑制卵巢和下丘腦的活性(Sharpe等，1990)。另外一組在一星期內(nèi)接受10毫克/公斤重組可溶性TNF-RI，分成兩個(gè)日劑量給藥。
表1

(1)從手術(shù)移植之日起(第1天)在指定的處死時(shí)間點(diǎn)(末次治療后的第2和第9天，即手術(shù)移植后的36和43天)，將動(dòng)物麻醉，從腹主動(dòng)脈采集血樣，分離出血清貯于-20℃直至測(cè)定雌二醇-17β水平。切下脾臟，用于測(cè)量自然殺傷細(xì)胞(NK)活性。在每個(gè)處死時(shí)間點(diǎn)測(cè)定子宮內(nèi)膜異位樣病灶的表面積。為了使數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)治療前剖腹值的變化百分率由下式計(jì)算X-XoXo×100]]>式中Xo為治療前剖腹時(shí)的大小，X是處死時(shí)的大小，然后計(jì)算每組中變化百分率的平均值。
NK活性測(cè)定用51Cr-釋放試驗(yàn)測(cè)定NK活性程度。在對(duì)數(shù)生長期收集小鼠淋巴瘤YAC-1細(xì)胞，用培養(yǎng)基(RPMI1640，含青霉素/鏈霉素、L-谷氨酰胺和10％熱滅活的胎牛血清)洗滌一次。細(xì)胞小粒用100微居里的[51Cr]-鉻酸鈉于37℃、5％CO2中培養(yǎng)2小時(shí)。然后用10ml的試驗(yàn)培養(yǎng)基將細(xì)胞洗滌三次，再以合適的濃度重新懸浮并在大鼠脾細(xì)胞存在下加至測(cè)定平板中。在加入51Cr-標(biāo)記靶細(xì)胞前將其以合適濃度(2×106毫升)再懸浮在試驗(yàn)培養(yǎng)基中，在U形底的96孔平板中以一式三份用試驗(yàn)培養(yǎng)基進(jìn)行系列稀釋。測(cè)定板每個(gè)孔中加入51Cr-標(biāo)記的靶細(xì)胞(5×103)。每個(gè)樣品以三種效應(yīng)物靶比例(200∶1，100∶1和50∶1)進(jìn)行測(cè)定，含效應(yīng)物靶細(xì)胞混合物的板以200×g離心4分鐘后在37℃、5％CO2中培養(yǎng)4小時(shí)。再將板在200×g離心4分鐘后，從每個(gè)孔中取出20微升上清液移至玻璃纖維濾器中，用β-計(jì)數(shù)器估測(cè)其相應(yīng)的放射性。
按下式計(jì)算溶解百分率 此處cpm樣品＝有效應(yīng)細(xì)胞存在下的51Cr釋放平均值cpmspont＝在培養(yǎng)基存在下的51Cr釋放平均值cpm總＝有1％Triton-X100存在下靶細(xì)胞的51Cr釋放平均值17β-雌二醇的測(cè)定用市售藥盒測(cè)定血清17β-雌二醇濃度可不經(jīng)提取步驟以定量血清中的雌二醇(DPC，Los Angeles，CA，美國)。簡(jiǎn)言之，125I-標(biāo)記的雌二醇與血清樣品中的雌二醇競(jìng)爭(zhēng)抗體位置。培養(yǎng)后用傾出法從游離的雌二醇中隔絕出結(jié)合的雌二醇。試管在伽碼計(jì)數(shù)器(LKB-Pharmacia Wallak)中計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)值與血清樣品中存在的雌二醇量呈逆相關(guān)。將計(jì)數(shù)值與校正曲線比較，測(cè)得樣品中雌二醇的量。抗血清對(duì)雌二醇高度特異，較其他天然來源的甾體有相對(duì)低的交叉反應(yīng)性。從同一實(shí)驗(yàn)活動(dòng)中來的樣品在一次免疫測(cè)定中進(jìn)行分析。
統(tǒng)計(jì)分析用Statgraphics Plus軟件(1.4版)中的ANOVA對(duì)治療組中觀察到的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性評(píng)價(jià)，進(jìn)行Tukey’s多重范圍試驗(yàn)(p＜0.05)。
結(jié)果實(shí)驗(yàn)性子宮內(nèi)膜異位中重組可溶性TNF-RI作用的探察大鼠手術(shù)移植子宮內(nèi)膜異位組織的成功生長和發(fā)育提供了研究模型用于研究不能在人類中恰當(dāng)研究的子宮內(nèi)膜異位的某些方面(Dudley等，1992)。以前的大鼠實(shí)驗(yàn)性子宮內(nèi)膜異位研究表明抗排卵肽可以恰當(dāng)?shù)赜米麝栃詫?duì)照(Sharpe等，1990)。在本實(shí)施例中，將抗排卵肽的效果與用重組可溶性TNF-RI所得的治療前后移植物尺寸大小進(jìn)行比較。結(jié)果總結(jié)于表II。
表II

圖1中的結(jié)果表示為移植的子宮內(nèi)膜片段的平均抑制百分率(計(jì)算如上述)。
抗排卵肽在縮小子宮內(nèi)膜樣病灶上有效(圖1)，在停止治療后于二個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)均能導(dǎo)致幾乎完全的(與原來尺寸相比分別為94％和88％)以及統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.05，ANOVA和Tukey’s試驗(yàn))的緩解。用人重組可溶性TNF-RI(10毫克/公斤，二個(gè)日劑量)治療一星期，結(jié)果在二種觀察時(shí)間點(diǎn)時(shí)子宮內(nèi)膜異位樣病灶的大小均有明顯減縮(與原來相比分別為33％和64％)。但僅在第9天有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(P＜0.05，ANOVA和Tukey’s試驗(yàn))。在假手術(shù)動(dòng)物中任何時(shí)候均未觀察到移植物。
NK細(xì)胞活力評(píng)價(jià)用脾細(xì)胞對(duì)YAC細(xì)胞的體外試驗(yàn)評(píng)測(cè)NK細(xì)胞活力，各組間沒有顯示任何差異(圖2)。與在狒狒上觀察到的相同，在有或無子宮內(nèi)膜異位的狒狒上未見抗子宮內(nèi)膜細(xì)胞毒性和NK細(xì)胞活力的差異(D’Hooghe等，1995)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)與人的數(shù)據(jù)相反，曾有報(bào)導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位患者的NK活性抑制，腹膜NK活力的降低與子宮內(nèi)膜異位的嚴(yán)重程度顯著相關(guān)(Oosterlynck等，1992)。
血清17β-雌二醇的評(píng)價(jià)在兩個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)均用放射免疫法測(cè)定血清17β-雌二醇濃度。在第二個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)抗排卵肽治療組與未治療的對(duì)照組有明顯差異，而重組可溶性TNF-RI與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差別(圖3；p＜0.05，ANOVA和Turkey試驗(yàn))。
結(jié)論在子宮內(nèi)膜異位的大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，給予TNF拮抗劑，即可溶性TNF-RI，首次對(duì)這種病理學(xué)狀況提供了以細(xì)胞因子為基礎(chǔ)的、非激素相關(guān)性治療潛在有效性的證據(jù)。因此TNF拮抗劑在降低副反應(yīng)方面作為現(xiàn)有醫(yī)學(xué)治療的一個(gè)替代物。這些結(jié)果評(píng)估了TNF拮抗劑在治療子宮內(nèi)膜異位相關(guān)性不育癥上的應(yīng)用。
本技術(shù)領(lǐng)域的熟練人員將知道或能肯定，此處用不多于常規(guī)的實(shí)驗(yàn)敘述了許多相當(dāng)于本發(fā)明的具體實(shí)施方案，這些和所有其他的相當(dāng)部分均包含在以下權(quán)利要求中。
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權(quán)利要求
1.TNF拮抗劑與一種藥學(xué)上可接受的載體在制備治療和/或預(yù)防子宮內(nèi)膜異位的藥物組合物上的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的TNF拮抗劑是一種可與TNF特異性表位結(jié)合的多肽，其結(jié)合方式使TNF不能再與膜結(jié)合的TNF受體相結(jié)合。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中TNF拮抗劑是結(jié)合于TNF的一種受體分子、其衍生物或其片段。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中受體分子選自包括TNF-RI和TNF-RII的一組。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中受體分子是TNF-RI的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)。
6.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中受體分子是人可溶性重組TNF-RI。
7.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中受體分子是TNF受體多亞基分子或其功能部分。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中TNF受體多亞基分子包含通過1個(gè)或多個(gè)多肽連接物連接的2個(gè)或更多個(gè)TNF受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)的全部或一個(gè)功能部分。
9.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中受體分子是一種免疫受體融合分子或其功能部分。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中所述免疫受體融合分子包含TNF受體的全部或功能部分和一個(gè)免疫球蛋白鏈。
11.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中TNF拮抗劑是一個(gè)抗TNF抗體或其片段。
12.如權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其中單克隆抗體選自嵌合的單克隆抗體、人源化單克隆抗體或其片段。
13.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中TNF拮抗劑預(yù)防或抑制TNF受體信號(hào)。
14.TNF拮抗劑與藥學(xué)上可接受的載體在制備用于治療和/或預(yù)防子宮內(nèi)膜異位相關(guān)的不育癥的藥物組合物上的應(yīng)用。
15.治療和/或預(yù)防子宮內(nèi)膜異位的方法，該方法包括給予患者治療有效劑量的TNF拮抗劑。
16.治療和/或預(yù)防子宮內(nèi)膜異位的藥物組合物，含有TNF拮抗劑與藥學(xué)上可接受的載體。
17.治療和/或預(yù)防子宮內(nèi)膜異位相關(guān)的不育癥的藥物組合物，含有TNF拮抗劑與藥學(xué)上可接受的載體。
18.如權(quán)利要求16或17所述的藥物組合物，其中TNF拮抗劑具有 1-13之一所述的特征。
全文摘要
腫瘤壞死因子拮抗劑以治療有效劑量給藥以治療和/或預(yù)防子宮內(nèi)膜異位。本發(fā)明的拮抗劑一般選自各類分子但優(yōu)選的為可溶性TNF受體。該拮抗劑對(duì)子宮內(nèi)膜異位損害的消退有用,如與其他活性成分合用可改善相關(guān)的疾患,例如不育癥。
文檔編號(hào)C07K14/715GK1337883SQ00803030
公開日2002年2月27日 申請(qǐng)日期2000年1月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月22日
發(fā)明者F·博雷利列, M·德安東尼奧, F·馬爾泰利 申請(qǐng)人:應(yīng)用研究系統(tǒng)Ars股份公司