專利名稱：：嚙齒類有害動物防治的制作方法嚙齒類有害動物防治本發(fā)明涉及新型嚙齒類動物防治劑，其包含結(jié)合在嚙齒類動物中表達的蛋白質(zhì)的抗體或其抗原結(jié)合片段，特別是結(jié)合在嚙齒類動物胃腸(GI)道中表達的蛋白質(zhì)的抗體或抗原結(jié)合片段，以及涉及制備此類新型嚙齒類動物防治劑的方法。本發(fā)明進一步擴展至在嚙齒類動物防治中使用的新型抗體和抗原結(jié)合片段，以及涉及通過使用此類抗體、抗原結(jié)合片段和新型嚙齒類動物防治劑來防治嚙齒類動物的方法。嚙齒類動物長久以來被認(rèn)為是有害動物并且引起各種問題。它們經(jīng)常從預(yù)定用于人和家養(yǎng)動物消耗的食物中覓食，因此它們不僅對生長中的作物還對貯存的食物材料造成損害和污染(由于尿、糞便和疾病)。嚙齒類動物還已知是廣泛多樣的疾病的攜帶者，所述疾病包括例如，旋毛蟲病、鉤端螺旋體病、霍亂、腺鼠疫、斑疹傷寒、痢疾、漢坦病毒、沙門氏菌病、巴斯德氏菌病、弓形體病和鼠咬熱，其可以通過:糞便、一尿和/或唾液，和/或靠嚙齒類動物為生或;靠嚙齒類動物提供食物來源的昆蟲等產(chǎn)生的灰塵)接觸進行傳播。此外，嚙齒類動物通過咬蝕和挖洞經(jīng)常造成財產(chǎn)、裝置和設(shè)備的物理損害。因此，由于防治嚙齒類動物的方法已經(jīng)過數(shù)年發(fā)展，并且逸些方法一般可以分為3類i)誘捕；U)通過暴露于化學(xué)劑而殺死；和iii)絕育或降低嚙齒類動物生育的能力。所有這3種方法都具有一種或多種缺陷。例如，設(shè)計為捕捉和/或殺死嚙齒類動物的機械陷阱由于其性質(zhì)而在其使用方面收到它們可處理的動物數(shù)量的限制，即在它們需要人類干預(yù)以重新設(shè)定之前它們每次只能處理1只動物。當(dāng)考慮到嚙齒類動物可以以高速率繁殖時(平均胎仔數(shù)為6-8只，并且每年產(chǎn)10-l2胎，一對大鼠一年可以產(chǎn)生多達15000個后代)，可以看出誘捕并不適合于大量的侵襲。此外，誘捕是相對勞動密集型的，需要定期的人類干預(yù)，并且這不僅導(dǎo)致有害動物防治的成本增加，而且還經(jīng)常將被陷阱靶向的嚙齒類動物嚇跑。使用化學(xué)殺嚙齒類劑目前是由于在城市和農(nóng)業(yè)環(huán)境中的實際嚙齒類動物防治程序的主要方法。一般而言，化學(xué)殺嚙齒類劑在其作用方面是急性或慢性的，即在嚙齒類動物已攝取有效劑量后，化學(xué)藥品快速或緩慢地介導(dǎo)中毒。急性殺嚙齒類劑包括磷化鋅、磷化三鋅(trizincphosphide)、紅海蔥(有效成分為紅海蔥糖苷)、(單)氟乙酸鈉、氟乙酰胺、oc氯醛糖和硫酸鉈。某些殺嚙齒類的化學(xué)藥品，例如麥角鈣化固醇、溴鼠胺和氟鼠啶，可以描述為亞急性殺嚙齒類劑，因為致死劑量在最初24小時內(nèi)攝入，但發(fā)生重復(fù)進食并且死亡通常延遲數(shù)天，然而急性和亞急性殺嚙齒類劑之間的區(qū)別不一定清晰。盡管急性殺嚙齒類劑由于其非?？焖俚匕l(fā)揮作用而有利，但它們一般是非常毒的化學(xué)藥品，并且存在與其使用相關(guān)的安全和環(huán)境擔(dān)憂。此外，急性毒斜的存活者可能變得對斜有戒心，從而減少了這種嚙齒類動物防治方法的整體功效。慢性殺嚙齒類劑通過充當(dāng)抗凝劑來介導(dǎo)其效應(yīng)，其例子包括第一代抗凝劑羥基香豆素類(例如殺鼠靈、氯滅鼠靈、克鼠靈、殺鼠醚)和茚滿二酮類(例如鼠完、敵鼠、氯鼠酮)；和第二代抗凝劑溴敵隆、溴鼠靈、鼠得克、氟鼠靈和噻鼠靈。第二代殺嚙齒類劑的使用在最近20-30年中已是普遍的，而第一代抗凝劑的使用時間甚至更長(30-50年)。因此，嚙齒類動物種群已有充足的時間來形成針對這種防治方法的抗性，并且在各種嚙齒類動物種群和/或種類中已報告了針對上文提及的每一種有效成分的抗性/耐受性(參見Kerrins等人，2001，"DistributionofresistancestoanticoagulantrodenticidesinEngland,1995-98"，第149-159頁，Proceedings,AdvancesinVertebratePestManagementII，SecondEuropeanVertebratePestManagementConference,Braunschweig,Germany)。第二代抗凝劑的另一個缺點源于與其廣泛使用相關(guān)聯(lián)的其非物種特異性作用模式。許多年來已為消滅攜帶抗凝劑殘留的嚙齒類動物的捕食性和清除性哺乳動物和鳥類的二次中毒而擔(dān)心。溴鼠靈和氟鼠靈在英國已被限制于在室內(nèi)使用，因為它們被認(rèn)為如果在戶外使用會造成其程度無法接受的高的二次中毒風(fēng)險。然而，針對更廣泛使用的鼠得克和溴敵隆的普遍抗性可能鼓勵其使用被限制于室內(nèi)的更有效抗凝劑的誤用。近來，已在廣泛范圍的具有相當(dāng)大的保護重要性的非靶標(biāo)物種中觀察到低水平的殘留和此類殘留的致死影響，所述非靶標(biāo)物種例如為倉鸮、白鼬、黃鼠狼、臭鼬和紅隼。已提出但仍未達到任何實際商業(yè)成功的第三種嚙齒類動物防治方法依賴于降低嚙齒類動物的出生率。生殖抑制劑例如避孕藥和殺配子劑的使用，以及生物學(xué)和化學(xué)不育劑的使用都已被研究。然而，每種方法均具有某些缺點。例如，盡管使用化學(xué)或類固醇化合物作為抗生育劑已證明對于被俘獲的動物是成功的，但它們更難以用于自由活動的有害動物種群。所述化合物是不好吃的，因而難以確保嚙齒類動物獲得足夠劑量。殺配子劑OC氯乙醇已作為毒性不育劑上市，然而，它在不同物種中具有可變的效應(yīng)并且在較高劑量上是有毒的(導(dǎo)致高達50%的死亡率)。最近的研究已檢查作為嚙齒類動物防治方法的免疫避孕(參見，例如美國專利申請?zhí)?005/0009188;Moore和Wongl997，ReproductionFertility&Development9:125-9;Smith等人，1997，Reproduction,Fertility&Development,9:85-9)。然而，當(dāng)施用途徑是口服時，由于口服耐受性的問題，存在與功效相關(guān)的困難，并且可能需要佐劑。因此需要克服了當(dāng)前嚙齒類動物防治方法所具有的某些缺點的新型嚙齒類動物防治劑(即能夠防治嚙齒類動物種群的試劑，例如通過殺死嚙齒類動物或通過調(diào)節(jié)嚙齒類動物種群生育的能力)。本發(fā)明通過提供包含抗體組分的新型嚙齒類動物防治劑而解決了這個需要，所述抗體組分結(jié)合在嚙齒類動物中表達的蛋白質(zhì)(此類蛋白質(zhì)在本文中稱為靶蛋白)的細胞外表位。因此，在本發(fā)明的第一個方面中，提供了包含抗體組分的嚙齒類動物防治劑，所述抗體組分結(jié)合在嚙齒類動物中表達的蛋白質(zhì)的細胞外表位。通過將所述嚙齒類動物防治劑靶向嚙齒類動物中的特定蛋白質(zhì)和/或特定組織，例如，靶向在嚙齒類動物腸組織/嚙齒類動物GI道中表達的蛋白質(zhì)，所述新型嚙齒類動物防治劑與嚙齒類動物腸接觸的時間長度相對于非特異性嚙齒類動物防治劑來說增加了，非特異性嚙齒類動物防治劑僅僅通過腸而不會經(jīng)特異性結(jié)合而延遲。這反過來可導(dǎo)致新型嚙齒類動物防治劑效力的有效增加，從而使得其能夠在比傳統(tǒng)非特異性殺嚙齒類劑，例如抗凝劑殺嚙齒類劑更低的濃度下使用。優(yōu)選地，抗體組分賦予所述新型嚙齒類動物防治劑對于嚙齒類動物超過非靶標(biāo)動物(例如，人、鳥、伴侶動物、家畜和不是有害動物的野生動物)的選擇性。這種超過非靶標(biāo)物種的對于嚙齒類動物組織/嚙齒類動物蛋白質(zhì)的選擇性是進一步有利的，因為它可能減少對解毒劑的需要，并且有可能減少所述新型嚙齒類動物防治劑對非靶標(biāo)物種的環(huán)境影響。當(dāng)抗體組分識別在嚙齒類動物中執(zhí)行非必需功能的靶蛋白時，所述嚙齒類動物防治劑必需進一步包含毒性組分或避孕組分。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含連接至毒性組分或避孕組分的抗體組分的嚙齒類動物防治劑。此類新型嚙齒類動物防治劑可以是融合蛋白的形式，其中所述毒性組分或避孕組分是經(jīng)由肽鍵直接或間接(即經(jīng)由肽連接體)連接至抗體組分的蛋白質(zhì)或肽部分；或者是蛋白質(zhì)綴合物的形式，其中所述毒性或避孕組分是直接化學(xué)綴合至抗體組分的小分子(即非蛋白質(zhì)性質(zhì)的化學(xué)實體)或蛋白質(zhì)或肽部分。當(dāng)所述抗體組分識別在嚙齒類動物中執(zhí)行必需功能的靶蛋白(例如，在嚙齒類動物的Gl道中執(zhí)行必需功能的蛋白質(zhì))時，抗體組分作為單獨的功能劑可以完成嚙齒類動物防治功能。此類嚙齒類動物防治抗體組分來介導(dǎo)其效應(yīng)。因此，在一個進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了包含抗體組分的嚙齒類動物防治劑，所述抗體組分結(jié)合在嚙齒類動物中表達的蛋白質(zhì)的細胞外表位，其中所述蛋白質(zhì)在嚙齒類動物中執(zhí)行必需功能。根據(jù)本發(fā)明的這個方面的抗體組分所結(jié)合的合適耙蛋白(并且因此其將用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的這個方面的抗體組分)的例子包括嚙齒類動物SoxlO基因產(chǎn)物、嚙齒類動物內(nèi)皮素-B受體(EDNRB)、嚙齒類動物內(nèi)皮素-3配體(EDN3)、嚙齒類動物CFTR(關(guān)于更多細節(jié)參見下表1和實施例)、嚙齒類動物IL-2、嚙齒類動物IL-IO、嚙齒類動物T-細胞受體cx和/或P鏈、嚙齒類動物的II類主要組織相容性復(fù)合物的組分。技術(shù)人員將理解，上述基因產(chǎn)物/蛋白質(zhì)中的某些在嚙齒類動物的上皮表面上不容易接近，因此在它們能夠介導(dǎo)其活性之前需要內(nèi)在化。在此類情況下，可能需要將針對上述蛋白質(zhì)之一的抗體組分與增強內(nèi)在化概率的另外的靶向性抗體組分相組合。因此，兩種或更多種抗體組分，其中一種針對前述蛋白質(zhì)之一和第二種充當(dāng)導(dǎo)向合適的上皮靶的靶向性抗體以增強內(nèi)在化，可以經(jīng)由綴合或依靠下文所述的融合蛋白進行連接。術(shù)語"抗體組分"在本文中用于指抗體或其抗原結(jié)合片段，其結(jié)合在嚙齒類動物中表達的蛋白質(zhì)的細胞外表位。優(yōu)選地，抗體組分所結(jié)合的表位具有只在嚙齒類動物蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列，即所述抗體結(jié)合嚙齒類動物特異性表位或RSE?？梢杂糜诋a(chǎn)生在本發(fā)明的嚙齒類動物防治劑中使用的抗體組分、并且本發(fā)明的嚙齒類動物防治劑與之結(jié)合的嚙齒類動物特異性表位(RSEs)，形成了本文描述的發(fā)明的第二個方面。結(jié)合RSEs的抗體組分#:視為本文描述的發(fā)明的第三個方面。RSE將是細胞外的以有利于抗體(或抗原結(jié)合片段)接近其結(jié)合位點。優(yōu)選地，提供RSE的靶蛋白將在嚙齒類動物的上皮表面中或其上表達，包括例如鼻、口、眼、胃腸道、生殖泌尿道和表皮的上皮。最優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)將在嚙齒類動物的胃腸道上皮中(或其上)表達。在一個實施方案中，RSE將由連續(xù)的(即相繼)的肽序列(即表位的第一個氨基酸殘基將經(jīng)由肽鍵直接連接至表位的第二個氨基酸殘基，表位的第二個氨基酸殘基將經(jīng)由肽鍵直接連接至第三個氨基酸殘基，等等)提供。此類連續(xù)的肽表位在本文中稱為嚙齒類動物特異性肽表位或RSPE。本發(fā)明的抗體組分所結(jié)合的、并因而可以用于產(chǎn)生本發(fā)明抗體組分(以及還有嚙齒類動物防治劑)的RSPEs，可以如此來確定進行由文獻和數(shù)據(jù)庫信息所表明的在所需耙組織/細胞層中表達的蛋白質(zhì)的比較生物信息學(xué)分析，隨后進行證實性的免疫學(xué)分析。RSPEs,如RSEs—樣，在自然界中只在嚙齒類動物蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)。RSPE在本文中定義為靶蛋白的寡肽片段，其中所述寡肽序列代表了細胞外連續(xù)肽表位，其與來自非靶標(biāo)動物(即非嚙齒類動物，例如，人)的同源蛋白質(zhì)的相應(yīng)線性肽序列具有60%或更低的同一性百分比。在本文中所使用的術(shù)語"寡肽片段"指靶蛋白的片段，所述片段由至少約4個和至多約50個氨基酸組成。優(yōu)選地，所述寡肽片段的長度將為9-45個(包括端點)氨基酸，并且更優(yōu)選地，所述寡肽片段的長度將為9-30個(包括端點)氨基酸。在具體實施方案中，所述寡肽片段長度將為9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、24或44個氨基酸。優(yōu)選地，RSPE和非靶蛋白之間的同一性百分比將是這樣的，即使得本發(fā)明的抗體組分對RSPE具有高度特異性和親和力，并且將不與和RSPE所來源于的蛋白質(zhì)屬于相同類別/家族的非嚙齒類動物蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)。在優(yōu)選實施方案中，RSPE和非靶蛋白之間的同一性百分比，或相繼)肽序列之間的同一性百分比低于或等于50%、45%、40%、35%、30%或25%。優(yōu)選地，RSPEs在所有靶嚙齒類動物物種中將是高度保守的，特別是在大鼠和小鼠之間是高度保守的，尤其是在黑家鼠(h〃i/s)、褐家鼠(/or^7ci/s)和小家鼠(/z^cw/i/s)/家鼠(M^^/Z/"〃CM)中的兩種或更多種之間。高度保守指來自一種嚙齒類動物物種的RSPE和來自另一種嚙齒類動物物種的相應(yīng)RSPE之間的同一性百分比#高。優(yōu)選地，兩種嚙齒類動物RSPEs之間的同一性百分比為至少75%。更優(yōu)選地，同一性百分比將大于或等于80%、85%、90%或95%、96%、97%、98%或99%。最優(yōu)選地，RSPE在兩種或更多種嚙齒類動物物種之間將是100%相同的。盡管如上文討論的，RSPE之間的同一性百分比優(yōu)選在兩種或更多種物種之間是高度保守的，但如果沒有觀察到所需高水平的保守性，那么可以使用來自兩種或更多種嚙齒類動物物種的蛋白質(zhì)(同源或不同)的不同RSPEs以產(chǎn)生不同的抗體組分，其隨后可以如下文所述組合在嚙齒類動物防治劑中(例如每種抗體組分連接至毒性/避孕組分，因而所述嚙齒類動物防治劑包括多種不同的抗體-毒素/避孕劑分子，或者所述嚙齒類動物防治劑包括連接至兩種或更多種不同抗體組分的毒性/避孕組分，所述兩種或更多種抗體組分中的每一種識別來自不同嚙齒類動物物種的蛋白質(zhì)的RSPE)。在一個具體實施方案中，在本發(fā)明的嚙齒類動物防治劑中，識別小鼠MDR1(SEQIDNO:8)的抗體組分可以與識別大鼠MDR1(SEQIDNO:9)的抗體組分相組合。本發(fā)明的抗體組分所結(jié)合的、并可以用于生產(chǎn)或鑒定本發(fā)明抗體組分的耙蛋白的例子在表l中給出。這個表還提供了可能來源于示例性蛋白質(zhì)的具體RSPEs的例子。技術(shù)人員將理解，表l中給出的蛋白質(zhì)列表或從中衍生的RSPEs列表均不是毫無遺漏的。另外合適的RSPEs可以在給定的蛋白質(zhì)(它們都在GI道中表達)中鑒定，并且另外的蛋白質(zhì)，例如來自其他嚙齒類動物靶組織如鼻上皮、口腔上皮、表皮、生殖泌尿道上皮和眼上皮的蛋白質(zhì)也可用于生產(chǎn)本發(fā)明的抗體組分。表1.可以被本發(fā)明抗體靶向的蛋白質(zhì)的例子，以及可能來源于此類蛋白質(zhì)的RSPEs的具體例子。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>在本發(fā)明中使用的優(yōu)選靶蛋白的例子是大鼠寡肽轉(zhuǎn)運蛋白PepTl、大鼠CD155、大鼠GTR2、大鼠CFTR、大鼠CNT2、大鼠CATB(0)+、大鼠MDR1、小鼠MDR1、大鼠蔗糖酶-異麥芽糖酶、小鼠GLUT7、大鼠OATP-B、大鼠ENT1、大鼠GCC、大鼠PLB、大鼠LPH、大鼠AMPN、大鼠MCDL和大鼠SCAB。本發(fā)明的優(yōu)選的RSPEs具有SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、26、27、28、29、31、32和34。在本發(fā)明中使用的特別優(yōu)選的靶蛋白是大鼠寡肽轉(zhuǎn)運蛋白PepTl、大鼠CD155、大鼠CFTR、大鼠CNT2、小鼠GLUT7、大鼠GCC、大鼠PLB和大鼠LPH。本發(fā)明的特別優(yōu)選的RSPEs具有SEQIDNO:1、3、5、6、11和27、28和29。技術(shù)人員將理解，抗體識別蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，并且表位可以包括分布遍及蛋白質(zhì)一級氨基酸序列而同時在結(jié)構(gòu)上來說彼此緊密接近的氨基酸殘基。因此，在一個進一步的實施方案中，本發(fā)明的抗體組分(以及因此還有嚙齒類動物防治劑)可以識別不連續(xù)的細胞外RSE。在本發(fā)明中使用的抗體可以是多克隆或單克隆的。此類抗體可以通過用如上所述的RSPE免疫接種動物，或通過用完整的嚙齒類動物乾蛋白免疫接種動物來獲得。本發(fā)明的多克隆抗體可以從此類經(jīng)免疫接種的動物的血清中獲得，參見例如實施例2。識別RSPE或嚙齒類動物靶蛋白但不識別來自非靶標(biāo)動物的同源蛋白質(zhì)的多克隆抗體可以使用標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)技術(shù)(例如通過ELISA，和/或通過針對合適的組織來源的免疫組織化學(xué))來鑒定。在本發(fā)明中使用的單克隆抗體可以通過下列方法獲得從用RSPE或嚙齒類動物靶蛋白進行免疫接種的動物的脾臟中分離B-淋巴細胞，并使用此類淋巴細胞制備雜交瘤細胞系。隨后在所述雜交瘤細胞系中篩選分泌識別所述RSPE或嚙齒類動物靶蛋白但不識別來自非靶標(biāo)動物的同源蛋白質(zhì)的抗體的那些雜交瘤，參見例如實施例。在本發(fā)明中使用的優(yōu)選多克隆和單克隆抗體在本文實施例中描述。在本發(fā)明中使用的抗體和抗原結(jié)合片段還可從抗體或抗原結(jié)合片段的噬菌體展示文庫(首次用于實驗的或免疫的)中，或從抗體或抗原結(jié)合片段的類似的酵母或細菌展示文庫中，或從抗體或抗原結(jié)合片段的核糖體展示文庫中分離。通常，將篩選此類展示文庫以鑒定所展示出來的結(jié)合RSPEs或嚙齒類動物靶蛋白的蛋白質(zhì)。技術(shù)人員會非常熟悉用于篩選此類文庫、在文庫中鑒定結(jié)合伙伴和隨后分離此類成員的方法。可以用于篩選的抗體和抗原結(jié)合片段展示文庫及其構(gòu)建已在本領(lǐng)域中描述(參見例如國際專利公開號WO01/90190和W093/19172;美國專利號5，759，808和6,517,829;由Hoogenboom1997，TrendsinBiotechnology15(2):62-70所作的綜述;Dooley等人，2003MolecularImmunology40:25-33;Nutall等人，2001MolecularImmunology2001,38:313-326;和Hanes等人，1998ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA95:14130-14135)。此夕卜可以檢查以這種方法鑒定的抗體或抗原結(jié)合片段以證實它們不結(jié)合來自非靶標(biāo)動物的同源蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中使用的抗體可以是任何免疫球蛋白類別，例如它們可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體是IgG抗體。本發(fā)明的抗體可以是包括重鏈和輕鏈的免疫球蛋白分子，或它們可以是單鏈抗體。本文所使用的術(shù)語"單鏈抗體"涵蓋了天然存在的只由單一類型的鏈組成的抗體，例如駱駝科或軟骨魚綱(篁魚)來源的抗體，其缺乏輕鏈，以及只由單一多肽鏈組成的經(jīng)改造的抗體。此類經(jīng)改造的抗體的例子包括例如在國際專利公開號W094/09817中所描述的單鏈抗體或"微型抗體"，和單鏈可變區(qū)片段(scFv)。本發(fā)明的抗體優(yōu)選是單鏈抗體。在一個優(yōu)選實施方案中，抗體是scFv。在另一個優(yōu)選實施方案中，抗體是缺乏輕鏈的單鏈抗體，最優(yōu)選駱駝科來源的抗體(例如在國際專利公開號W094/04678中所迷的)。在本發(fā)明中使用的抗原結(jié)合片段包括免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白重鏈、Vh結(jié)枸域、Vt結(jié)構(gòu)域、Fvs、Fabs、di-Fabs、Fab's、F(ab')2S、Vhh結(jié)枸域、IgNARV結(jié)構(gòu)域和CDRs。技術(shù)人員會非常熟悉抗原結(jié)合片段例如免疫球蛋白輕鏈和重鏈、VH和、結(jié)構(gòu)域、Fvs、Fabs、di-Fabs、Fab's、F(ab')2s、和CDRs，及其制備。VHH結(jié)構(gòu)域是駱駝科抗體的可變結(jié)構(gòu)域。VHH結(jié)構(gòu)域及其分離在本領(lǐng)域中進行了描述，參見例如國際專利公開號W094/04678、國際專利公開號WO01/90190以及其中包含的參考文獻。IgNAR抗體是來自鯊魚的單鏈抗體，其與駱駝科抗體一樣缺乏輕鏈(參見Greenberg等人，1995Nature374:168-173)。這些抗體的抗原結(jié)合區(qū)域，IgNAR可變結(jié)構(gòu)域(IgNARV結(jié)構(gòu)域)，已在本領(lǐng)域中描述，參見例如Dooley等人，2003(MolecularImmunology40:25-33)以及其中引用的參考文獻。在某些實施方案中，在本發(fā)明中使用的抗體組分將是駱駝科抗體或Vhh結(jié)枸域，其識別上文所述的優(yōu)選靶蛋白之一。特別地，結(jié)合SEQIDNO:1、3、5、6、11或27中任何一個的駱駝科抗體或V冊結(jié)構(gòu)域是優(yōu)選的，而結(jié)合SEQIDNO:5、6、11或27中任何一個的VHH結(jié)構(gòu)域是特別優(yōu)選的。在本發(fā)明中使用的抗體和抗原結(jié)合片段還可進行改造以增加其穩(wěn)定性，例如它們可以通過二硫橋來穩(wěn)定化(參見例如Reiter等人，1996，NatureBiotechnology14(10):1239-1245)。如上所述，抗體組分可以通過使用完整的嚙齒類動物蛋白質(zhì)或RSEs(這個術(shù)語包括RSPEs)作為抗原或用于篩選合適的抗體/抗原結(jié)合片段來獲得，所述完整的嚙齒類動物蛋白質(zhì)或RSEs已被選擇為與來自非靶標(biāo)動物(即非嚙齒類動物，例如，人)的同源蛋白質(zhì)具有低的同一性百分比。因此減少了本發(fā)明的抗體組分與來自非靶標(biāo)物種的同源蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)的概率。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，抗體組分(以及因此還有本發(fā)明的嚙齒類動物防治劑)顯示出對于嚙齒類動物靶蛋白上的表位而不是來自非靶標(biāo)動物的同源蛋白質(zhì)上的相應(yīng)表位的選擇性。換言之，本發(fā)明的優(yōu)選抗體組分通過以比來自非靶標(biāo)動物的同源蛋白質(zhì)上的相應(yīng)表位(或同源蛋白質(zhì))大的親和力與RSE結(jié)合而顯示出對RSE(或RSE所來源的嚙齒類動物蛋白質(zhì))的選擇性。非靶標(biāo)動物包括人、鳥、伴侶動物、家畜和不是有害動物的野生動物。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體組分將顯示出減少的與來自人的同源蛋白質(zhì)的結(jié)合，和更加優(yōu)選地不結(jié)合來自人的同源蛋白質(zhì)。更加優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體組分將不僅顯示出減少的與來自人的同源蛋白質(zhì)的結(jié)合(或不結(jié)合來自人的同源蛋白質(zhì))，而且還顯示出減少的與來自至少一種其他非靶標(biāo)動物的同源蛋白質(zhì)的結(jié)合(或不結(jié)合來自至少一種其他非靶標(biāo)動物的同源蛋白質(zhì))。為了避免疑問，就此而言，術(shù)語"結(jié)合"在本文中用于以定性或定量方式描述本發(fā)明的抗體組分與表位或蛋白質(zhì)的相互作用。當(dāng)定性地使用該術(shù)語時，關(guān)于結(jié)合靶蛋白、RSE或RSPE的特異性可以通過抗體組分以可替換的方式結(jié)合靶蛋白、RSE或RSPE的能力來證實，其中抗體結(jié)合的替換是由于存在針對其而產(chǎn)生或篩選出了所述抗體組分的抗原(在下文中稱為"特異性抗原")而引起的。如果沒有觀察到此類靶蛋白/RSE/RSPE特異性抗體組分與非靶蛋白(或來自非靶蛋白的相應(yīng)表位)的結(jié)合，或如果觀察到不能通過特異性抗原進行替換的某些與非靶蛋白(或來自非靶蛋白的相應(yīng)表位)的結(jié)合，那么該抗體組分將,皮認(rèn)為顯示出對于靶蛋白、RSE或RSPE(適當(dāng)時)的選擇性，因為抗體組分以比非靶蛋白或來自非靶蛋白的相應(yīng)表位大的親和力結(jié)合靶蛋白/RSE/RSPE。特異性和選擇性因此可以通過合適組織樣品的免疫組織化學(xué)分析和/或通過^f吏用合適樣品的ELISA來測定。當(dāng)定量地使用術(shù)語"結(jié)合"時，它表示抗體組分對于與其相互作用的表位或蛋白質(zhì)具有至少l(T6M的親和力。優(yōu)選地，親和力為至少10—7M，更優(yōu)選10—8M,更優(yōu)選1(TM，更加優(yōu)選10—'。M，和最優(yōu)選1011M或更大。因此，當(dāng)抗體組分結(jié)合RSE或RSPE(或RSE或RSPE所來源的蛋白質(zhì))時，它將具有至少10—6M的親和力，并且在進一步的實施方案中，它將具有至少1(TM、至少10—8M、至少10—9M和至少10—1QM的親和力。在優(yōu)選的實施方案中，抗體組分將不結(jié)合來自一種或多種非靶標(biāo)物種(優(yōu)選人)的同源蛋白質(zhì)上的相應(yīng)表位，即抗體組分對于來自非靶標(biāo)物種的同源蛋白質(zhì)的親和力將少于10—6M，或它將顯示出減少的與其的結(jié)合，即抗體組分對于來自非靶標(biāo)物種的同源蛋白質(zhì)的親和力將比對于靶嚙齒類動物蛋白質(zhì)的小至少10倍。因此，在優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)本發(fā)明的抗體組分對于RSE或RSPE(或RSE或RSPE所來源的蛋白質(zhì))具有至少10"M的親和力時，抗體組分對于來自非靶標(biāo)物種的同源蛋白質(zhì)的親和力將少于10"M，并優(yōu)選10—5M或更少；當(dāng)本發(fā)明的抗體組分對于RSE或RSPE(或RSE或RSPE所來源的蛋白質(zhì))具有至少1(T7M的親和力時，抗體組分對于來自非靶標(biāo)物種的同源蛋白質(zhì)的親和力將為10"M或更低；當(dāng)本發(fā)明的抗體組分對于RSE或RSPE(或RSE或RSPE所來源的蛋白質(zhì))具有至少10—8M的親和力時，抗體組分對于來自非靶標(biāo)物種的同源蛋白質(zhì)的親和力將為l(T7M或更低，和優(yōu)選10-6M或更低；當(dāng)本發(fā)明的抗體組分對于RSE或RSPE(或RSE或RSPE所來源的蛋白質(zhì))具有至少1(TM的親和力時，抗體組分對于來自非靶標(biāo)物種的同源蛋白質(zhì)的親和力將為10—8M或更低，和優(yōu)選10—6M或更低?？贵w組分對靶和非耙蛋白(以及源于其的表位)的親和力可以使用任何合適的技術(shù)來測定；例如通過使用表面等離子共振(例如使用BIAcore"。在本發(fā)明的一個實施方案中，嚙齒類動物防治劑是融合蛋白的形式，其中所述融合蛋白包含第一種蛋白質(zhì)組分和第二種蛋白質(zhì)組分，所述第一種蛋白質(zhì)組分是如上文所述的抗體組分，和所述第二種蛋白質(zhì)組分選自毒素、免疫原和激素。第一種蛋白質(zhì)組分可以直接連接至第二種蛋白質(zhì)組分，然而，優(yōu)選地，這兩種組分將經(jīng)由連接體肽而間接連接。一般地，連接體肽的長度足夠第一種組分和第二種組分如所需地起作用，而一種組分不會不利地影響另一種的功能(例如通過空間位阻)。適合于在本發(fā)明這個方面中使用的常用連接體肽的例子是(Gly4Ser)n連接體，其中"n"是大于或等于1的整數(shù)。通常，n大于或等于3。優(yōu)選地，連接體肽的一級序列被設(shè)計成在苛刻的水解和熱環(huán)境中是穩(wěn)定的。這可以通過去除或突變在連接體中充當(dāng)用于經(jīng)由例如蛋白水解機制而加工連接體的識別位點的殘基而達到。合適的連接體肽的另外例子是Gustavsson等人，2001(ProteinEngineering14:711-715);Hennecke等人，1998(ProteinEngineering11:405-410);和Huston等人，1991(MethodsinEnzymology203:46-88)描述的那些。在一個進一步的實施方案中，希望將特定的不穩(wěn)定性改造到連接體肽中，從而使得在將融合蛋白遞送至合適部位后實現(xiàn)受控制的所述兩種蛋白質(zhì)組分的分離/第二種蛋白質(zhì)組分的釋放，例如一旦融合蛋白被內(nèi)在化，第二種蛋白質(zhì)組分就可以在細胞內(nèi)釋放。所述的分離控制可以用于增強某些融合蛋白的活性。如上文提及的，在融合蛋白的一個實施方案中，第二種蛋白質(zhì)組分是毒素。毒素賦予所述融合蛋白殺嚙齒類活性它經(jīng)由外部或內(nèi)部介導(dǎo)的作用方式來實現(xiàn)針對所靶向的嚙齒類動物細胞的毒性。在本發(fā)明這個方面中使用的合適毒素包括尤其是破裂膜的蛋白質(zhì)、核糖基轉(zhuǎn)移酶、絲氨酸蛋白酶、鳥苷酸環(huán)化酶激活物、參與ATP酶介導(dǎo)的離子轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)、鈣調(diào)蛋白依賴性腺苷酸環(huán)化酶、RNA糖苷酶和核糖核酸酶。合適的毒素的具體例子在下表2中給出。技術(shù)人員將意識到，表2中列出的某些毒素是毒素分子家族的代表，并且在這種情況下，那些成員中的任何一個都可以在本發(fā)明中使用。表2.可以在本發(fā)明融合蛋白中用作毒素的蛋白質(zhì)的例子。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>肺炎球菌溶血素膽固醇依賴性成孔溶細胞素P11990X52474鏈球菌溶血素0膽固醇依賴性成孔溶細胞素P21131M18638熱穩(wěn)定型直接溶血素(神奈川毒素)成孔溶細胞素P19249D90101鉤端螺旋體溶血素成孔/破裂膜034095U89708Cry毒素，例如CrylAc成孔溶細胞素P05068M11068炭疽毒素靶細胞中激酶的蛋白水P15917/M29081/解攻擊/鈣調(diào)蛋白依賴P13423/M22589/性腺苦酸環(huán)化酶P40136M23179假單胞菌外毒素ANAD-依賴性ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶P11439K01397芽孢桿菌RNA酶核糖核酸酶P00648M14442VIP3成孔溶細胞素(J45792L48811硫素細胞溶解性植物毒素P01543AF004018l型核糖體滅活蛋白，例rRNAN-糖*酶P33186L12243如白樹毒蛋白P-噪呤硫素細胞溶解性植物毒素P01543AF00術(shù)8在本發(fā)明的實施方案中使用的優(yōu)選毒素包括粒酶B、cyt2A、P-噤呤硫素、VIP2A、白樹毒蛋白和粒溶素。特別優(yōu)選的毒素選自粒酶B、cyt2A、p-嘌呤石克素、VIP2A和白樹毒蛋白。如上所述的蛋白質(zhì)毒素可以整體引入本發(fā)明的融合蛋白中。備選地，當(dāng)此類毒素的結(jié)構(gòu)域或片段賦予毒性活性時，那種結(jié)構(gòu)域或片段可以月作融合蛋白中的第二種蛋白質(zhì)組分。在另一個實施方案中，本發(fā)明融合蛋白中的第二種蛋白質(zhì)組分是免疫原，即能夠在嚙齒類動物中引發(fā)免疫應(yīng)答的多肽或寡肽。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的免疫原-融合蛋白將能夠充當(dāng)免疫避孕劑，并且將因此通過阻止繁殖而充當(dāng)嚙齒類動物防治劑。因此，精子或卵子特異性抗原，例如，乳酸脫氫酶C、精子抗原PH-20(Primakoff等人，1988Nature335:543-6)、受精蛋白(PH-30)和透明帶抗原是在本發(fā)明融合蛋白中用作第二種蛋白質(zhì)組分的合適免疫原。在另外一個實施方案中，本發(fā)明融合蛋白中的第二種蛋白質(zhì)組分是激素或蛋白質(zhì)性質(zhì)的激素模擬物。在這個實施方案中，第二種蛋白質(zhì)組分將干擾和阻止嚙齒類動物中的繁殖，并且融合蛋白因此通過阻止生育而充當(dāng)嚙齒類動物防治劑?？梢栽诒景l(fā)明的這個實施方案中使用的激素的例子包括促性腺激素釋放激素。在進一步的實施方案中，如上所述的融合蛋白可以包含至少一種另外的蛋白質(zhì)組分。這種(或這些)另外的蛋白質(zhì)組分可以是如上所述的毒素、免疫原、激素或蛋白質(zhì)性質(zhì)的激素模擬物。因此，可以構(gòu)建包含抗體組分和至少2種另外的蛋白質(zhì)組分的融合蛋白，其中另外的蛋白質(zhì)組分中的每一種賦予融合蛋白以嚙齒類動物防治(即毒性或避孕，或兩者)功能。第二種和另外的蛋白質(zhì)組分可以各自具有相同或不同的嚙齒類動物防治功能(即它們可以各自獨立地是毒性的或避孕的)，并且當(dāng)它們具有相同功能時，它們可以各自具有相同的或獨立地不同的作用方式。當(dāng)另外的蛋白質(zhì)組分具有相同的嚙齒類動物防治功能并且其中至少一種另外的蛋白質(zhì)組分具有不同于第二種蛋白質(zhì)組分的作用方式時，可以增強嚙齒類動物防治劑的功效(相對于包含賦予嚙齒類動物防治活性的單一蛋白質(zhì)組分的嚙齒類動物防治劑)。例如融合蛋白，其中第二種蛋白質(zhì)組分是細胞破裂性毒素(例如選自產(chǎn)氣莢膜梭菌細胞溶素0、a溶血素、鞘磷脂酶、5-溶血素、ot毒素、cyt毒素、粒溶素、蜂毒肽、穿孔素、?？舅?、李斯特菌溶胞素、氣單胞菌溶素、溶血素A、變形蟲通道蛋白、ElTor溶血素、美人魚弧菌溶血素、肺炎球菌溶血素、鏈球菌溶血素0、神奈川毒素、鉤端螺旋體溶血素、cry毒素、VIP3、硫素和P-嘌呤硫素)并且另外的蛋白質(zhì)組分可以是為了活性而需要在細胞內(nèi)內(nèi)在化的毒素(例如選自粒酶B、白喉毒素、霍亂內(nèi)毒素、VIP2、附屬腸毒素、大腸桿菌素E1、CTXIV、2型核糖體失活蛋白例如蓖麻毒素、炭疽毒素、假單胞菌外毒素A、芽孢桿菌RNA酶、1型核糖體失活蛋白例如白樹毒蛋白)，可以是特別有效的嚙齒類動物防治劑，因為由第二種蛋白質(zhì)組分所賦予部來幫助另外;蛋白質(zhì)組分的功能活性。在優(yōu)選的實施方案中，融合蛋白將包含選自cyt2A、p-嘌呤硫素和粒溶素的至少一種毒素組分；和選自粒酶B、VIP2A和白樹毒蛋白的至少一種毒素組分。本發(fā)明的融合蛋白可以如此構(gòu)建，即使得第一種蛋白質(zhì)組分(抗體組分)處于第二種蛋白質(zhì)組分的N-末端，備選地，它們可以如此構(gòu)建，即使得第二種蛋白質(zhì)組分處于第一種蛋白質(zhì)組分的N-末端。如前文提及的，在某些實施方案中，希望經(jīng)由連接體肽間接連接所述兩種蛋白質(zhì)組分。因此，本發(fā)明的融合蛋白從N到C末端可以包括，經(jīng)由肽鍵連接至連接體肽的第一種蛋白質(zhì)組分，所述連接體肽接著經(jīng)由肽鍵連接至第二種蛋白質(zhì)組分，或者它們從N到C末端可以包括，經(jīng)由肽鍵連接至連接體肽的第二種蛋白質(zhì)組分，所述連接體肽接著經(jīng)由肽鍵連接至第一種蛋白質(zhì)組分。當(dāng)融合蛋白包含另外的蛋白質(zhì)組分時，另外的蛋白質(zhì)組分可以處于第一種組分的N-末端，即另外的蛋白質(zhì)組分通過其C-末端殘基經(jīng)由肽鍵直接連接至第一種蛋白質(zhì)組分的N-末端殘基，或經(jīng)由肽連接體(或另外的蛋白質(zhì)組分)間接連接至第一種蛋白質(zhì)組分的N-末端殘基。在一個進一步的實施方案中，另外的蛋白質(zhì)組分處于第二種蛋白質(zhì)組分的N-末端，即另外的蛋白質(zhì)組分通過其C-末端殘基經(jīng)由肽鍵直接連接至第二種蛋白質(zhì)組分的N-末端殘基，或經(jīng)由肽連接體(或另外的蛋白質(zhì)組分)間接連接至第二種蛋白質(zhì)組分的N-末端殘基。在更進一步的實施方案中，另外的蛋白質(zhì)組分可以i)處于第一種組分的C-末端，即另外的蛋白質(zhì)組分通過其N-末端殘基經(jīng)由肽鍵直接連接至第一種蛋白質(zhì)組分的C-末端殘基，或經(jīng)由肽連接體(或另外的蛋白質(zhì)組分)間接連接至第一種蛋白質(zhì)組分的C-末端殘基；或ii)處于第二種蛋白質(zhì)組分的C-末端，即另外的蛋白質(zhì)組分通過其N-末端殘基經(jīng)由肽鍵直接連接至第二種蛋白質(zhì)組分的C-末端殘基，或經(jīng)由肽連接體(或另外的蛋白質(zhì)組分)間接連接至第二種蛋白質(zhì)組分的C-末端殘基。本發(fā)明的抗體組分和/或融合蛋白可以通過在任何合適的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)中表達編碼它們的核酸來產(chǎn)生。因此，在一個進一步的方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸。編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸可以通過將編碼第一種蛋白質(zhì)組分的核酸按閱讀框架與編碼第二種蛋白質(zhì)組分的核酸克隆在一起來獲得。當(dāng)?shù)谝环N和第二種蛋白質(zhì)組分經(jīng)由肽連接體間接連接時，編碼所述連接體的核酸將分隔融合蛋白的兩種蛋白質(zhì)組分，并且與它們處于閱讀框架內(nèi)。編碼抗體組分的核酸可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)從表達本發(fā)明抗體的雜交瘤細胞中分離。備選地，編碼抗體組分的核酸可以再次使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)從編碼本發(fā)明抗體或抗原結(jié)合片段的噬菌體展示或其他文庫克隆中獲得。編碼第二種蛋白質(zhì)組分(毒性或避孕組分)的例子的核酸序列是本領(lǐng)域可獲得的，參見，例如表2中的EMBL數(shù)據(jù)庫參照符號。編碼連接體肽的核酸可以從頭合成，例如從編碼所述連接體肽序列的寡核苷酸合成。為了使抗體組分或融合蛋白在合適的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)中表達，將編碼融合蛋白的核酸可操作地連接至合適的啟動子，以及任選地連接至合適的轉(zhuǎn)錄終止子。一般而言，編碼融合蛋白的核酸所可操作地連胞中表達的任何啟動子。因此，如果需要在細菌細胞中表達抗體組分或融合蛋白，那么啟動子將是在那種細菌細胞中可運作的。類似地，如果需要在真菌表達系統(tǒng)中表達抗體組分或融合蛋白，那么啟動子將是在真菌細胞中可運作的，并且如果構(gòu)建體被引入哺乳動物細胞培養(yǎng)表達系統(tǒng)或植物表達系統(tǒng)中，那么可采用相同的邏輯類推。當(dāng)抗體組分或融合蛋白在植物細胞和/或植物中表達時，種子特異性啟動子的使用是特別希望的。當(dāng)本發(fā)明的核酸可操作地連接至合適的轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)域時，所述轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)域?qū)⑹墙閷?dǎo)在其中待表達本發(fā)明抗體組分或融合蛋白的宿主細胞中的轉(zhuǎn)錄終止的轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)域。適合用于這個目的的轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)域在本領(lǐng)域中進行了描述。用于表達本發(fā)明抗體組分和/或融合蛋白的合適表達系統(tǒng)包括，微生物表達系統(tǒng)例如細菌系統(tǒng)(例如大腸桿菌(Aco//)、芽孢桿菌表達系統(tǒng))，和真菌系統(tǒng)如酵母(例如釀酒酵母(Sacc力aro邁/cescere7/siae)、粟酒裂歹直酵母(Sc力/zc^accAaro邁/ces/70邊6e)、畢赤酵母屬(P/c力/a)物種、漢遜酵母屬(^3/^e/zw/a)物種)和其他真菌表達系統(tǒng)(例如來源于曲霉屬(J"e^/7"s)物種、里氏木霉(7Wc力c^/er鵬reese/)和粗糙脈孢菌(勘"rospora"as^s)的絲狀真菌表達系統(tǒng))；哺乳動物表達系統(tǒng)例如CHO細胞；和植物表達系統(tǒng)。在表達本發(fā)明融合蛋白中使用的優(yōu)選植物和植物細胞包括小麥、大麥、玉米、高粱、燕麥、水稻和粟。技術(shù)人員會熟悉在本領(lǐng)域中充分描述的這些表達系統(tǒng)。本文所述的新型嚙齒類動物防治劑還可以是蛋白質(zhì)綴合物的形式。因此，在一個進一步的方面，本發(fā)明提供了包含化學(xué)綴合至毒性組分或避孕組分的本文所述的本發(fā)明抗體組分的蛋白質(zhì)綴合物。在一個實施方案中，毒性組分或避孕組分將是小的化學(xué)實體，而在一個進一步的實施方案中，毒性組分或避孕組分將是上文在關(guān)于本發(fā)明融合蛋白時所描述的蛋白質(zhì)或肽。當(dāng)毒性組分是小的化學(xué)實體時，在本發(fā)明的這個方面中使用的合適毒性化合物的例子包括秋水仙素；多柔比星；加利車霉素；非類固醇抗炎藥(NSAID)類的分子；松胞菌素；抗凝劑例如溴鼠靈、鼠得克、溴敵隆、氟鼠靈、噻鼠靈、羥基香豆素類和茚滿二酮類；麥角鈣化固醇；溴鼠胺；氟鼠啶；磷化鋅；紅海蔥糖普；(單)氟乙酸鈉；氟乙酰胺；a氯醛糖；硫酸鉈。當(dāng)避孕組分是小的化學(xué)實體時，在本發(fā)明的這個方面中使用的合適的激素和激素樣化合物包括例如黃體酮和雌激素(合成的和天然的)和diazacon(即，20，25-二氮雜膽固醇)。蛋白質(zhì)綴合物的抗體組分可以如前文所述獲得，并且可以直接化學(xué)綴合至毒性組分或避孕組分。通常，這種綴合物將涉及導(dǎo)致二硫鍵或硫醚鍵的異雙功能試劑的使用，如本領(lǐng)域中所述的(參見，例如Hermanson，G.T."BioconjugateTechniques"AcademicPress,London,1996，forstandardmethodologiesrelatingtotheuseofcross-linkingreagents)。在一個進一步的實施方案中，當(dāng)毒性或避孕組分是小的化學(xué)實體時，毒性化合物、激素或激素樣化合物可以包入膠囊，并且膠囊可以連接至本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段。在一個具體實施方案中，膠囊可以如上文所討論的經(jīng)由化學(xué)綴合進行連接。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段可以經(jīng)由肽鍵而化學(xué)綴合或融合至結(jié)合膠嚢的第二種結(jié)合性組分。例如，本發(fā)明的抗原結(jié)合片段可以用于提供雙特異性或甚至多特異性結(jié)合分子中的一種特異性，其中第二種(或另外的)特異性是對于膠嚢的，并且這種第二種(或另外的特異性)由特異性地結(jié)合膠嚢的分子(例如抗原結(jié)合片段)來提供。在一個進一步的方面，將蛋白質(zhì)綴合物的抗體組分化學(xué)綴合至兩種或更多種毒性或避孕組分。另外的毒性或避孕組分可以是蛋白質(zhì)或肽部分的形式或者是小化學(xué)實體的形式。當(dāng)至少一種另外的毒性或避孕組分是蛋白質(zhì)或肽部分時，所述另外的組分可以是如前文所述的毒素、免疫原、激素或蛋白質(zhì)性質(zhì)的激素模擬物。當(dāng)至少一種另外的毒性或避孕組分是小的化學(xué)實體時，它可以是如上文所述的毒性化合物或激素或激素樣化合物。在本發(fā)明這個方面的某些實施方案中，制備包含化學(xué)綴合至至少兩種另外組分的、如本文所述的抗體組分的蛋白質(zhì)綴合物，所述至少兩種另外組分中的每一種賦予所述蛋白質(zhì)綴合物以嚙齒類動物防治(即毒性或避孕，或兩者)功能。第二種另外組分(和另外的組分)可以(各自)具有與第一種另外組分相同或不同的嚙齒類動物防治功能，并且當(dāng)它(它們)具有相同功能時，它(它們)可以具有相同或不同(獨立地不同)的作用方式，如上文關(guān)于本發(fā)明融合蛋白時所述的。在一個具體實施方案中，蛋白質(zhì)綴合物將包含如上文所述的抗體組分，其化學(xué)綴合至第二種毒性或避孕組分中的一種或多種分子。綴合位點將取決于用于綴合反應(yīng)的化學(xué)作用。當(dāng)希望將兩種不同的另外組分綴合至第一種(抗體)組分時，可能希望對于每種另外組分使用不同的化學(xué)綴合方法，以便確保不同的另外組分不會互相竟?fàn)幘Y合第一種組分上的相同位點。在本發(fā)明的更進一步的方面，提供了包含如上文所述的融合蛋白或蛋白質(zhì)綴合物的嚙齒類動物防治劑，其中所述融合蛋白或蛋白質(zhì)綴合物包含至少兩種抗體組分。在一個實施方案中，每種抗體組分結(jié)合相同的靶蛋白，從而增加嚙齒類動物防治劑結(jié)合其耙組織的概率并還可能增加嚙齒類動物防治劑的結(jié)合親合力。在此類實施方案中，抗體組分可以是相同或不同的。當(dāng)抗體組分不同時，這包括，結(jié)合耙蛋白中相同RSE或RSPE的不同抗體組分，或更優(yōu)選地其中每種抗體組分結(jié)合相同靶蛋白內(nèi)的不同RSE或RSPE的不同抗體組分。在一個進一步的實施方案中，嚙齒類動物防治劑將包含結(jié)合至少兩種不同靶蛋白的抗體組分。包含結(jié)合單個靶蛋白內(nèi)的不同RSEs或RSPEs的抗體組分和/或包含結(jié)合不同靶蛋白的抗體組分的實施方案，在延遲針對所述嚙齒類動物防治劑而出現(xiàn)的抗性發(fā)作中或在抵制于潛在靶位點之一上的抗性中可能特別有用。本發(fā)明的抗體、抗原結(jié)合片段、融合蛋白和蛋白質(zhì)綴合物可用于防治嚙齒類動物，例如它們可以在殺死嚙齒類動物的方法中或在阻止嚙齒類動物生育的方法中使用。因此，在一個進一步的方面，提供了包含或由本文所述的抗體、抗原結(jié)合片段、融合蛋白或蛋白質(zhì)綴合物組成的嚙齒類動物防治劑。其中第二種蛋白質(zhì)組分是毒素或其中將抗體或抗原結(jié)合片段綴合至毒性化合物或蛋白質(zhì)/肽毒素的本發(fā)明融合蛋白和蛋白質(zhì)綴合物，將通過殺死嚙齒類動物來達到嚙齒類動物防治(即，此類融合蛋白和蛋白質(zhì)綴合物在其作用方式方面是殺嚙齒類的)。當(dāng)抗體或抗原結(jié)合片段組分識別在嚙齒類動物GI道上皮中表達的蛋白質(zhì)時，融合蛋白或蛋白質(zhì)綴合物將結(jié)合上皮。取決于融合蛋白/蛋白質(zhì)綴合物中存在的毒素或毒性化合物的類型，毒素或毒性化合物可以破裂細胞膜。GI道上皮的完整性因此受損，并且在GI道中出現(xiàn)的損傷將導(dǎo)致嚙齒類動物死亡。備選地，當(dāng)毒素或毒性化合物通過細胞內(nèi)作用方式介導(dǎo)中毒時，結(jié)合的融合蛋白或蛋白質(zhì)綴合物依賴于通過內(nèi)吞作用的內(nèi)在化。一旦融合蛋白或蛋白質(zhì)綴合物進入細胞，毒素/毒性化合物將能夠介導(dǎo)中毒，這將最終導(dǎo)致嚙齒類動物死亡。其中第二種蛋白質(zhì)組分是免疫原的融合蛋白也需要攝入到嚙齒類動物細胞中。一旦存在于嚙齒類動物細胞內(nèi)，就激起針對該免疫原的免疫應(yīng)答。因此，當(dāng)免疫原是卵子或精子特異性抗原時，這導(dǎo)致產(chǎn)生阻止繁殖發(fā)生的免疫應(yīng)答。有利地，融合蛋白的抗體或抗原結(jié)合片段將增加吸收到嚙齒類動物中(通過內(nèi)吞作用)的免疫原的量，并且還可充當(dāng)佐劑，從而增加激起合適的免疫應(yīng)答的可能性。其中第二種蛋白質(zhì)或綴合的組分是激素或激素樣組分的本發(fā)明融合蛋白和蛋白質(zhì)綴合物同樣需要攝入到嚙齒類動物細胞中。一旦存在于嚙齒類動物細胞中，激素/激素樣化合物就會干擾繁殖的激素調(diào)節(jié)，并因而通過阻止生育來防治嚙齒類動物。本文描述的融合蛋白和蛋白質(zhì)綴合物的抗體/抗原結(jié)合部分的嚙齒類動物特異性賦予了本發(fā)明嚙齒類動物防治劑幾個優(yōu)點。對于嚙齒類動物組織的高特異性意味著，嚙齒類動物防治劑特異地被靶向嚙齒類動物組織，從而促進毒性/免疫原性/激素組分的攝入/活性。反過來，這種特異性靶向意味著，對于有效防治可能需要更少的嚙齒類動物防治劑，在環(huán)境中存在更少的嚙齒類動物防治劑，以及在環(huán)境中存在的嚙齒類動物防治劑對非靶標(biāo)物種不是特異性的，并因此較不可能被其吸收和對其造成損害。本發(fā)明的嚙齒類動物防治劑可以配制成包括本發(fā)明融合蛋白或蛋白質(zhì)綴合物作為有效成分以及至少一種添加劑、稀釋劑和/或載體的組合物。合適的添加劑例如包括充當(dāng)嚙齒類動物引誘劑的化合物，使得所述組合物對嚙齒類動物來說更可口的化合物，另外的嚙齒類動物防治劑，和用于穩(wěn)定或保護所述嚙齒類動物防治劑的化合物。合適的引誘劑化合物包括食物材料例如小麥、大麥、玉米、高粱、燕麥、水稻和粟。在本發(fā)明中使用的合適的可口性增強化合物包括增甜劑(例如乙酰舒泛鉀、阿力坦、阿斯巴甜、brazzein、環(huán)己烷氨基磺酸鹽、糖精、三氯蔗糖(sucralose)、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、奇異果甜蛋白、莫內(nèi)甜蛋白、益壽糖(isomalt)和異麥芽酮糖(isomaltulose))、植物或動物油(例如玉米、大豆和花生油，魚油)和干酵母。合適的穩(wěn)定性增強/保護性化合物包括保護或防護嚙齒類動物防治劑在被嚙齒類動物攝食后免于蛋白水解或水解的那些化合物，例如anatacids，和可以在pH釋放膠嚢的形成中使用的化合物。在本發(fā)明組合物中使用的合適稀釋劑和載體包括在已知嚙齒類動物防治劑中用作稀釋劑和/或載體的那些，例如蠟，和結(jié)合劑例如纖維素醚、淀粉、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、瓜爾膠、角叉菜聚糖、明膠、刺梧桐樹膠、黃原膠、阿拉伯膠、槐豆膠、黃蓍膠、果膠和聚丙烯酸酯。本發(fā)明組合物可以包括除了上述添加劑、稀釋劑或栽體中任何一種以外的和/或代替其的另外嚙齒類動物防治劑，例如上文在本發(fā)明引言中提及的那些。特別地，本發(fā)明還包括本文描述的一種或多種新型嚙齒類動物防治劑與至少一種第一代抗凝劑和/或至少一種第二代抗凝劑相組合的混合物。在本發(fā)明這個方面中使用的優(yōu)選第一代抗凝劑包括羥基香豆素類和茚滿二酮類，其中殺鼠靈、氯滅鼠靈、克鼠靈和殺鼠醚是特別優(yōu)選的羥基香豆素，和鼠完、敵鼠和氯鼠酮是特別優(yōu)選的茚滿二酮。在本發(fā)明這個方面中使用的優(yōu)選第二代抗凝劑包括溴敵隆、溴鼠靈、鼠得克、氟鼠靈和噻鼠靈。本發(fā)明還包括至少兩種上文描述的新型嚙齒類動物防治劑的混合物，以及包含此類混合物的組合物(如上文所述)。例如，當(dāng)嚙齒類動物防治劑是結(jié)合在嚙齒類動物中表達的蛋白質(zhì)的細胞外表位的抗體組分(即抗體組分本身是功能性嚙齒類動物防治劑)時，該嚙齒類動物防治劑可以與一種或多種另外的嚙齒類動物防治劑相組合，其中另外的嚙齒類動物防治劑包含抗體組分以及一種或多種毒性或避孕組分(即一種或多種另外的嚙齒類動物防治劑是本文所述的融合蛋白或蛋白質(zhì)綴合物)。在進一步的實施方案中，混合物將包括如本文所述的兩種或更多種融合蛋白和/或蛋白質(zhì)綴合物。在一個實施方案中，在植物中生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白，并將包含表達的融合蛋白的植物材料用作用于嚙齒類動物防治的飾。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，優(yōu)選地，生產(chǎn)融合蛋白的植物將是能夠充當(dāng)嚙齒類動物食物來源的植物，例如小麥、大麥、玉米、高粱、燕麥、水稻和粟都是用于表達本發(fā)明融合蛋白的合適植物。在一個實施方案中，特別優(yōu)選地，融合蛋白將在植物種子中表達。以這種方式，來自表達本發(fā)明融合蛋白的植物的谷粒可以直接用作辨。如上文所提及的，本發(fā)明組合物以及包含本發(fā)明融合蛋白的植物和/或谷?？梢杂米鲊X類動物防治劑。因此，在一個更進一步的方面，本發(fā)明提供了殺死嚙齒類動物的方法，包括將嚙齒類動物防治劑置于嚙齒類動物經(jīng)常出現(xiàn)的區(qū)域，從而使得在所述嚙齒類動物防治劑被所述嚙齒類動物攝食后，所述嚙齒類動物被殺死。技術(shù)人員還將意識到，本發(fā)明還提供了阻止嚙齒類動物生育的方法，包括將嚙齒類動物防治劑置于嚙齒類動物經(jīng)常出現(xiàn)的區(qū)域，從而使得在所述嚙齒類動物防治劑被所述嚙齒類動物攝食后，所述嚙齒類動物的生殖能力被抑制。為了測試本發(fā)明嚙齒類動物防治劑的功效，可以進行各種體外和體內(nèi)研究。合適的體外測試的例子是如Heylings1991(Toxicol.Appl.Pharmacol.107:482-293)和實施例9中所述的腸環(huán)測定法(gutloopassay)。用于體內(nèi)評估本發(fā)明嚙齒類動物防治劑的殺嚙齒類特性的典型策略基于下列要求1)最小化測試中使用的動物數(shù)量，2)使成本下降，3)快速產(chǎn)生有用信息，4)不拒絕可能有希望的活性物質(zhì)。最初的測試通常將在實驗室中進行，因為可以小心地控制測試條件。使用級聯(lián)測試程序。這個級聯(lián)允許通過使用順次決定過程來接受或拒絕活性物質(zhì)。通常的測試受試者是褐家鼠和家鼠。屋頂鼠是另一種重要的測試受試者，但因為它不能作為實驗室品系獲得，所以它只在評估程序的較后階段進行測試。對于抗凝劑具有抗性的嚙齒類動物品系也可在實驗室程序的較后階段中使用，以便測試針對這些動物的功效。然后，可以在野外評估在實驗室測試中具有活性并且顯示出希望的本發(fā)明嚙齒類動物防治劑。野外試驗在各種自然環(huán)境中針對所有重要有害嚙齒類動物物種進行。技術(shù)人員可參考容易獲得的指導(dǎo)性文獻，所述文獻闡述了在實驗室中(EPP0/0EPP.1999.Laboratorytestsforevaluationofthetoxicityandacceptabilityofrodenticidesandrodenticidepreparations;OEPP/EPPOPP1/113(2):89-101)和在野外(EPPO/OEPP.1999.GuidelinesfortheEfficacyEvaluationofPlantProtectionProducts:Field—testsagainstsynanthropicrodents腸顏cw/ws，Aa〃i/"or^/,,i.r"to;OEPP/EPPOPP1/114(2):102-113)的用于殺嚙齒類劑的合理測試程序。還可以獲得對于滿足英國(Anonymous.2005.GuidelinesontheEfficacyDataRequirementsforApprovalofNon-agriculturalPesticideProductsRodenticides.HealthandSafetyExecutive,Bootle，UK.第30頁)、歐盟(Anonymous.2002.TechnicalnotesforguidanceinsupportoftheAnnexVIofDirective98/8/ECoftheEuropeanParliamentandtheCouncilconcerningtheplacingofbiocidalproductsonthemarket.Coimnonprinciplesandpracticalproceduresfortheauthorisationandregistrationofproducts.EuropeanCommission,July2002.第215頁)和美國的規(guī)章要求的測試程序的建議。在實驗室可以遵循以便評估本發(fā)明嚙齒類動物防治劑功效的典型級聯(lián)測試可以包括口部插管測試、無選擇飼養(yǎng)測試和選擇祠養(yǎng)測試。這些測試的進一步細節(jié)在下文概述?？诓坎骞苡糜诖_定活性物質(zhì)效力的最初測試涉及使用管飼法將在惰性液體例如聚乙二醇中攜帶的活性物質(zhì)直接遞送至測試受試者的胃中。可以以這種方式遞送準(zhǔn)確的劑量，以便確定致死劑量百分位數(shù)統(tǒng)計學(xué)。該測試提供了關(guān)于活性物質(zhì)在受試者物種的腸中存在的條件下保持活性的能力以及關(guān)于其穿過腸膜進行轉(zhuǎn)移的信息。該測試還提供了關(guān)于活性物質(zhì)的固有毒性的信息。無選擇飼養(yǎng)測試事實上所有市售殺嚙齒類劑產(chǎn)品都作為配制好的斜呈現(xiàn)。測試級聯(lián)的下一個階段涉及制備包含活性物質(zhì)(在這種情況下是本發(fā)明的嚙齒類動物防治劑)的飾。首先進行其中個別籠養(yǎng)的測試受試者只有給予它們的實驗餌的'無選擇，測試，以確定活性物質(zhì)在作為可食用的辨進行遞送時是否具有活性。測試斜通常可隨意獲得。除了如在口部插管測試中獲得的信息外，無選擇飼養(yǎng)測試提供了關(guān)于活性物質(zhì)通過受試者物種的消化過程從飾中移出的能力的信息。選擇飼養(yǎng)測試為了能夠被在配制飾中的活性物質(zhì)控制，嚙齒類動物必須消耗足夠量的斜以在可替代的天然食物存在下獲取致死劑量。因此，活性物質(zhì)(即本發(fā)明的嚙齒類動物防治劑)的可口性是評估的重要方面。進行選擇測試，其中將活性物質(zhì)以計量濃度加入斜基質(zhì)中。然后，向個別籠養(yǎng)的測試受試者提供在包含活性物質(zhì)的測試斜和不含活性物質(zhì)的相同飾之間的選擇。進行一系列此類測試以確定被測試受試者所察覺的活性物質(zhì)的濃度。通常地，此類檢測通過厭惡包含活性物質(zhì)的仵來證明。評估中的重要考慮是，被測試受試者所察覺和引發(fā)明顯厭惡的濃度低于在測試辨中遞送致死劑量所需的濃度。進一步的選擇測試對在商業(yè)制劑開發(fā)中生產(chǎn)的實驗辨來進行。這些選擇測試涉及實驗制劑的呈現(xiàn)和'挑戰(zhàn)飲食(challengediet)，。挑戰(zhàn)飲食如此構(gòu)成，即使得它呈現(xiàn)為實驗制劑的適度可口的可替代物。在此類測試中使用的典型'挑戰(zhàn)飲食，是'EPA餐，。這是包含固定量的燕麥、粗碾玉米、糖和油的制劑。符合通常實踐的是，其的消耗包括最少30%的組合挑戰(zhàn)飲食的實驗制劑以及由測試受試者所消耗的實驗制劑將被考慮為用于野外試驗的潛在候選物。實驗室測試后，可以在野外環(huán)境中測試功效。嚙齒類動物具有復(fù)雜和高度適應(yīng)性行為，這些行為只在天然條件下才完全展現(xiàn)。因此，可以進行野外試驗以便評估殺嚙齒類的活性物質(zhì)和配制的產(chǎn)品在野外條件下的效果。通常地，野外試驗在各種天然環(huán)境下針對一系列靶物種進行，所述天然環(huán)境是在其中可能進行實際的嚙齒類動物防治處理的那些環(huán)境的典型代表。野外試驗可以在產(chǎn)品開發(fā)的早期階段使用不希望用于商業(yè)化的實驗制劑來進行，以便研究當(dāng)它們以包含活性物質(zhì)的典型辨進行呈遞時靼嚙齒類動物物種中的天然行為過程。隨后，野外試驗還可對商業(yè)辨產(chǎn)品來進行，以證實其在實際條件下的功效。本發(fā)明的各個方面和實施方案現(xiàn)在將通過實施例更詳細地舉例說明。應(yīng)當(dāng)理解，可進行細節(jié)修飾而不背離本發(fā)明的范圍。為了避免疑問，在本申請文本中引用了書面參考文獻、專利申請或?qū)＠?，所述引用的完整文本引入本文作為參考。附圖簡述圖1:重組白樹毒蛋白對螢光素酶翻譯的抑制。圖2:抗CNT2多克隆抗體-重組白樹毒蛋白綴合物對螢光素酶翻譯的抑制。庫A樣品對應(yīng)于來自IMAC純化、確定包含游離抗體的合并級分。庫B樣品對應(yīng)于來自IMAC純化、確定包含抗體-毒素綴合物的合并級分。實施例實施例1:RSPEs的產(chǎn)生和制備1.1.肽的選擇和合成在嚙齒類動物腸上皮上存在的潛在蛋白質(zhì)靶通過文獻和生物信息學(xué)方法來鑒定?；谙铝袠?biāo)準(zhǔn)在這些蛋白質(zhì)中鑒定出嚙齒類動物特異性肽表位(RSPEs):在小鼠和大鼠序列之間的高序列同一性(優(yōu)選80-100%的同一性)以及在嚙齒類動物和人序列之間的低序列同一性(優(yōu)選0-40%的同一性)，并且使用BLAST比對與其他物種沒有顯著命中；其親水性特征(表面可能性(surfaceprobability)的指征)；彈性和二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。用于預(yù)測親水性、彈性和二級結(jié)構(gòu)的算法由DNAstar和VectorNTI程序套件中的程序提供。一旦鑒定出合適的RSPE，就可以4吏用Fmoc固相合成來合成肽并純化至約90%的純度。已經(jīng)合成了下表3中顯示的肽。合適時，向所述序列加入N-末端半胱氨酸以使得能夠定向綴合至載體蛋白。備選地，合適時，合成N-末端氨基酸保持未封閉的序列，以使得能夠定向綴合至載體蛋白。當(dāng)不需要綴合時，N-末端氨基酸通過乙?；忾]。另外，C-末端氨基酸用酰胺基團封閉。表3.已合成的RSPEs<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>1.2.肽與BSA的綴合使用異雙功能交聯(lián)劑間-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯將包含N-末端半胱氨酸殘基的肽偶聯(lián)至BSA。如Kitagowa和Aikawa.J.Biochemistry第79巻第233-236頁(1976)所述，偶聯(lián)經(jīng)由BSA中賴氨酸殘基上的伯胺和所述肽中半胱氨酸殘基上的巰基。在0.2M磷酸鈉(pH7.0)中制備25mg/ml的BSA(Sigma，Poole，Dorset)溶液，并在二甲基甲酰胺(Sigma)中制成25mg/ml的MBS(Perbio,Cheshire)溶液。在進行混合的情況下將30plMBS溶液逐滴加入lmlBSA溶液中，并在黑暗中于室溫下孵育45分鐘。隨后將經(jīng)活化的BSA溶液向下經(jīng)過PD10凝膠過濾柱(GEHealthcare,Buckinghamshire),所述柱先前已用G.2M砩酸鈉(pH7.0)平衡。包含BSA的級分通過280nm處的吸光度來鑒定，并合并在一起。將2mg肽溶解于1邁l50mM磷酸鈉(pH7.5)中。將足夠的經(jīng)活化的BSA溶液加入肽中以達到肽BSA為30:1的摩爾比。該混合物在室溫下孵育4小時，隨后于41C在黑暗中在進行混合的情況下孵育過夜。將綴合的肽貯存于-20"C。使用2-步戊二醛法將在N-末端包含賴氨酸殘基或伯胺的肽偶聯(lián)至BSA。基于Bio-conjugateTechniques,AcademicPress1996，第583-584頁中的方法來進行BSA和肽中的伯胺基團之間的偶聯(lián)。在0.1M磷酸鈉，0.15M氯化鈉(pH6.8)中制成10mg/ml的BSA溶液。加入戊二醛(Sigma)至1.25%的最終濃度，并將混合物在進行混合的情況下在室溫下孵育12小時。將經(jīng)活化的BSA溶液向下經(jīng)過PD10凝膠過濾柱，所述柱先前已用PBS平衡。包含BSA的級分通過280nm處的吸光度來鑒定，并合并在一起。將2mg肽溶解于1ml0.5M碳酸鈉(pH9.5)中，并向肽中加入足夠的經(jīng)活化的BSA溶液以達到肽BSA為至少10:1的摩爾比?；旌衔镉?匸孵育過夜。過量的反應(yīng)位點通過加入40jal1M乙醇胺(Sigma)來封閉。將綴合的肽貯存于-20。C。實施例2:抗體組分的產(chǎn)生將如上面實施例1中所述已合成并綴合至BSA的肽用于產(chǎn)生結(jié)合在嚙齒類動物中表達的蛋白質(zhì)的細胞外表位的抗體。2.1，兔免疫接種方案新西蘭白兔用于多克隆抗體生產(chǎn)。對于第一劑，使用弗氏完全佐劑(Sigma)，通過皮下施用100ng蛋白質(zhì)來免疫接種兔。在這之后為在第28、56和84天時的3次加強免疫接種，包括在弗氏不完全佐劑(Sigma)中的皮下施用的IOOjug蛋白質(zhì)。在初次免疫接種前獲取預(yù)放血獲得物(Pre-bleeds)，在第三劑后10-14天獲取測試放血獲得物(testbleeds)，和在第四劑后10-14天獲取收獲放血獲得物(harvestbleeds)。對于下列RSPEs中的每一種，免疫接種2只兔子并產(chǎn)生多克隆抗體血清SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6;SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:15。對于下列RSPEs中的每一種，免疫接種1只兔子SEQIDNO:27、SEQIDNO:28;SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34。2.2.小鼠/倉鼠免疫接種方案小鼠和倉鼠用于單克隆抗體生產(chǎn)，對于第一劑，通過皮下施用在弗氏完全佐劑中的20pg蛋白質(zhì)來進行免疫接種。在這之后為在第28和56天時皮下施用20蛋白質(zhì)的2次免疫接種。在第28天時在弗氏不完全佐劑中施用劑量，和在第56天時在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中施用劑量。在第三劑后7天獲取測試放血獲得物。在第三劑后至少6周，小鼠通過在PBS中靜脈內(nèi)施用20pg蛋白質(zhì)來進行加強。4天后收獲脾以用于融合。小鼠已用下列RSPEs中的每一種進行免疫接種，并產(chǎn)生了多克隆抗體血清SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29。2.3.單克隆抗體的生產(chǎn)4吏用基于KohlerG.和MilsteinC.Nature256，495-497(1975)的方法產(chǎn)生單克隆抗體。使用由具有20號針頭的注射器遞送的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Invitrogen,Paisley)從收獲的脾臟中洗滌出淋巴細胞。NSO骨髓瘤細胞(EuropeanCollectionofCellCultures,PortonDown,Salisbury)在包含10%(v/v)胎牛血清(PAA，Yeovil，Somerset)、2mML-谷氨酰胺、1xHT補充物以及50單位/ml青霉素和50ug/ml鏈霉素(全都來自Invitrogen)的DMEM中，于37"€在5%C02中培養(yǎng)至5x105/ml的密度。將來自單個脾臟的淋巴細胞(大約2xl08)與2xl(TNS0骨髄瘤細胞混合。在2000xg下離心4分鐘后，將細胞沉淀輕輕地重懸浮，并通過經(jīng)過1分鐘逐滴加入1ml在75mMHEPES緩沖液pH8(Roche,Lewes,EastSussex)中的50%(w/v)聚乙二醇(1500)而進行融合。在數(shù)分鐘內(nèi)緩慢加入補充有HI克隆補充物(Roche)的完全培養(yǎng)基(如上所述)，至50ml的最終體積。所得到的融合溶液在5個無菌微量滴定細胞培養(yǎng)板(Nunclon,Fisher,Loughborough,Leicestershire)中以100ul/孔在37t:和5%C02下培養(yǎng)4小時，在這之后，加入包含4。/。(v/v)lxHAT選擇培養(yǎng)基(Invitrogen)的100ul/孔的完全培養(yǎng)基。融合后14天，基于EngvallE.和PerlmannP.I咖unochemistry8，871-874(1971);HarlowE.等人，Antibodies-ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,1988，第182-183頁描述的方法，特異性抗體。經(jīng)由至少2輪通過有限稀釋的克隆以及隨后的再測定來獲取所選擇的雜交瘤細胞，以確保雜交瘤的克隆性(clonality)和穩(wěn)定性。冷凍的雜交瘤文庫在由在胎牛血清中的10%(v/v)DMSO(Sigma,Poole，Dorset)構(gòu)成的冷凍培養(yǎng)基中以1C/分鐘的冷凍速率經(jīng)過80分鐘來制備，隨后貯存于液氮中。所選擇的單克隆抗體的生產(chǎn)通過按比例擴大的組織培養(yǎng)來完成。使用來自用SEQIDNO:1、SEQIDNO:5、SEQIDNO:11、SEQIDNO:6和SEQIDNO:27免疫接種的小鼠脾臟的淋巴細胞已獲得了雜交瘤融合物。已分離、培養(yǎng)和冷凍了產(chǎn)生針對來自小鼠GLUT7的RSPE(SEQIDNO:11)的抗體的4個穩(wěn)定的單克隆細胞系。已分離了產(chǎn)生針對來自大鼠CFTR的RSPE(SEQIDNO:5)的抗體的4個穩(wěn)定的單克隆細胞系。已分離、培養(yǎng)和冷凍了產(chǎn)生針對來自大鼠PepTl的RSPE(SEQIDNO:1)的抗體的7個陽性單克隆細胞系。2.4.來自噬菌體展示文庫的抗體組分的鑒定和分離2.4.1.首次用于實驗的駱駝科VHH噬菌體展示文庫的篩選如上文實施例1.2中所述，通過化學(xué)合成和隨后綴合至BSA來制備RSPEs以用于篩選首次用于實驗的駝羊(Wfl鵬^a則)VHHMU絲狀噬菌體展示儲庫。噬菌體所展示的免疫結(jié)合結(jié)構(gòu)域儲庫的篩選遵循已建立的程序，例如由McCafferty和Johnson所描述的那些("PhageDisplayofPeptidesandProteins"，第98-100頁，Eds.Kay，Winter和McCafferty，1996，AcademicPress,Inc.)。RSPE::BSA綴合物通過以100jig/ml的濃度施加在50mM碳酸氫鈉pH9.6緩沖液中并過夜賻育而粘附至MaxisorbImmunotubes(Nunc)的內(nèi)表面。游離的RSPE::BSA綴合物通過在PBS中漂洗3次而去除，然后通過加入PBS/2%脫脂牛奶蛋白(PBSM)并于37X:孵育2小時來封閉表面。在免疫管(immunotube)用所需RSPE敏化后，通過加入在4mlPBSM中的1012-1013噬菌體并在室溫下孵育2小時來進行"淘選"。這個步驟后，抽吸出管內(nèi)容物并使用PBS/0.1%TweenM將管洗滌20次，隨后使用PBS再洗滌20次。隨后通過加入1ml100mM甘氨酸pH3.0并經(jīng)過10分鐘來洗脫免疫管所結(jié)合的噬菌體(代表大多數(shù)RSPE::BSA-特弄性Vhh結(jié)合物)。將溶液轉(zhuǎn)移至包含0.5ml1MTris-HClpH7.4的新試管中以進行中和。然后，將洗脫的噬菌體用于通過混合并于37匸孵育30分鐘來感染對數(shù)期TGI大腸桿菌細胞，隨后涂布在"x24cm2xTY/2。/。葡萄糖/100jig/ml氨千青霉素平板(NuncBioAssayDish)上，其隨后于371C孵育過夜。第二天，刮板以取出包含對RSPE::BSA綴合物具有結(jié)合特異性的序列的細胞(其代表了富集的、增加的噬菌?？寺∪后w)。為了進一步篩選/選擇來自該群體的展示出對于RSPE的高親和力的克隆，通過加入輔助噬菌體例如M13-K07或VCS-M13來"營救"噬菌體顆粒。簡言之，將來自最后一個步驟的細胞接種到在250ml錐形燒瓶中的50ml2xYT/2%葡萄糖/100pg/ml氨爺青霉素中，并于30r孵育直至0D6。。為約0.5。然后，加入輔助噬菌體以提供1:1的輔助噬菌體與細菌比率，通常為2xl01。pfu/50ml，隨后于37。C孵育l小時。接下來，細胞通過在3000g下離心IO分鐘來沉淀，棄去上清液，將細胞沉淀重懸浮并用于接種在2升燒瓶中的新鮮培養(yǎng)基500ml2xYT/100pg/ml氨芐青霉素/50yg/ml卡那霉素(無葡萄糖)。這種培養(yǎng)物于30TC伴隨劇烈振蕩來孵育過夜，隨后通過于4TC加入100ml20%PEG/2.5MNaCl30分鐘來收獲噬菌體-VHH顆粒。然后，通過在4000g下離心10分鐘來收集沉淀的噬菌體，并重懸浮于5mlPBS中，準(zhǔn)備用于下一輪篩選。選擇過程的效率可以通過減少在每輪淘選中用于敏化免疫管的RSPE::BSA綴合物的量來改進。另外，選擇過程可以調(diào)整至包括偏向選擇顯示出某些物理化學(xué)特征例如蛋白水解穩(wěn)定性的噬菌體-VHH顆粒的步驟。例如，已知M13噬菌體顆粒對由某些蛋白水解酶例如胰蛋白酶和糜蛋白酶所進行的蛋白水解有抗性(Schwind等人，1992，Eur.J.Biochem.210:431-436)，并且這個特性可以在噬菌體展示中用于選擇結(jié)構(gòu)上穩(wěn)定的變體(Kristensen和Winter,1998，F(xiàn)olding&Design,3:321-328)。為了選擇顯示出所需的對于RSPE的親和力和選擇性的單個顆粒，挑選在2xTY/2o/。葡萄糖/100pg/ml氨千青霉素板上的獨特克隆(從在淘選步驟后被洗脫的噬菌體感染的TG1大腸桿菌的系列稀釋樣品中獲得)，并排列在每孔包含150]ul2xTY/2y。葡萄糖/100pg/ml氨芐青霉素的96孔培養(yǎng)區(qū)塊中，并且伴隨振蕩于30t:進行孵育直至0D6。。達到約0.5。然后，將輔助噬菌體加入每個孔中以提供1:1的輔助噬菌體細菌比率，隨后伴隨振蕩于37X:再孵育1小時。然后，在通過以3000g離心來沉淀細胞后去除培養(yǎng)基，并用1.5ml2xYT/100jig/ml氨芐青霉素/50jug/ml卡那霉素(無葡萄糖)替換，并且伴隨劇烈振蕩于30X:繼續(xù)孵育過夜。然后通過使用20%PEG/2.5MNaCl于41C下30分鐘而從每個孔中收獲噬菌體顆粒，隨后在4000g下離心并重懸浮于PBS中。這些克隆噬菌體樣品用于ELISA中以使用抗噬菌體抗體-HRP復(fù)合物來測定對于固定的RSPE的相對結(jié)合親和力，或者備選地，通過用所述噬菌體感染非琥珀阻抑子大腸桿菌宿主(例如菌株HB2151)來表達可溶性VHH。然后，使用IPTG誘導(dǎo)使得能夠進行可溶性的、分泌的V冊的96孔培養(yǎng)和表達，并且將粗培養(yǎng)基(包含可溶性VHH)或IMAC-純化的VHH(借助于完整的六組氨酸標(biāo)簽)用于ELISA中以測定與固定的RSPE的結(jié)合。在這種情況下，合適的檢測抗體是9E10-HRP(RocheMolecularBiochemicals),其檢測在可溶性VHH蛋白上存在的c-Myc標(biāo)簽。最初，作為針對如上所述的首次用于實驗的駱駝科噬菌體展示文庫的RSPE::BSA綴合物來篩選下列RSPEs;具有SEQIDNO5的RSPE，具有SEQIDNO6的RSPE，具有SEQIDNO11的RSPE和具有SEQIDN027的RSPE。隨后，將從這種篩選中鑒定出的V冊克隆用于生產(chǎn)本文所述的融合蛋白和抗體綴合物。2.5.重組抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的克隆和表達為了舉例說明形成單鏈抗體(更特別地scFv)的過程，將來自雜交瘤HB-8766(美國典型培養(yǎng)物保藏中心；Rettig等人，1989，US4851332)的SV63小鼠單克隆抗體(MAb)(識別來自由某些結(jié)腸直腸胂瘤表達的人堿性磷酸酶的細胞表面表位)用作模型細胞表面抗原結(jié)合蛋白質(zhì)。為了從這種IgGlMAb衍生scFv分子，用在文獻(例如Dubel等人1994，JournalofImmunologicalMethods175:89-95;McCafferty和Johnson"PhageDisplayofPeptidesandProteins"，第95頁，Eds.Kay，Winter和McCafferty,1996，AcademicPress,Inc.)中所述的嚙齒類動物Fv和恒定結(jié)構(gòu)域特異性引物組，采用RT-PCR從所述雜交瘤中克隆出Fv序列，釆用了在文獻中說明的對于個別引物的修飾。在這個實施例中使用的引物序列在下表4中給出。表4.在從雜交瘤ATCCHB-8766中克隆SV63scFvs之中使用的引物引物序列5'至3'SEQIDRoPro-9AGGTSCAGCTGCAGSAGTCWGGSEQIDNO:37RoPro-28CCAGGGGCCAGTGGATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTSEQIDNO:38RoPro-6GAGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGACCTAGCCTGGTGSEQIDNO:39RoPro-25TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCSEQIDNO:40RoPro-3GGTGATATCGTKCTCACYCARTCTCCAGCAATSEQIDNO:41RoPro-4GGGAAGATGGATCCAGTTGGTGCAGCATCAGCSEQIDNO:42scFvoligo1AGCCCGCCATGGCCGATATCGTTCTCACTCAATCSEQIDNO-43scFvoligo2CGCCAGAGCCACCGCCACCGCTACCGCCACCGCCCTTGATCTCCAGTTTGGTGCCTCSEQIDNO:44scFvoligo3AGCGGTGGCGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGTAGCGAGGTCCAGCTGCAGGAGTCTGGSEQIDNO:45scFvoligo4CTATGAATTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCSEQIDNO-46scFvoligo5AGCCCGCCATGGCCGAGGTCCAGCTGCAGGAGTCTGSEQIDNO:47scFvoligo6CGCCAGAACCACCTCCGCCGCTTCCGCCACCGCCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCCSEQIDNO:48scFvoligo7AGCGGCGGAGGTGGTTCTGGCGGTGGCGGAAGCGATATCGTTCTCACTCAATCTCSEQIDNO:49scFvoligo8GTATGAATTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCCTTGATCTCCAGTTTGGTGCCTCSEQIDNO:502.5.1.雜交瘤RNA的分離和cDM的合成離心雜交瘤細胞(107)并重懸浮于lmlTrizorM和200|u1氯仿中。將樣品在室溫下劇烈混合15分鐘，隨后在12000g和4T下離心15分鐘。移去水層并加入等量的異丙醇。樣品在12，000rp邁和4匸下離心15分鐘以沉淀RNA,其在70%乙醇中洗滌并隨后重懸浮于不含RNA酶的水中。通過在包含5n1RNA、0.1U不含RNA酶的DNA酶I(Ambion)和1URNasin的10jj1反應(yīng)體系中用不含RNA酶的DNA酶進行處理而從RNA中去除痕量的基因組DNA。將混合物置于371c下30分鐘，隨后于80匸孵育5分鐘。然后，在制造商的標(biāo)準(zhǔn)條件(1.5nlRNA，50nl總反應(yīng)體積，oligo-dT引物)下，將經(jīng)DNA酶I處理的RNA用于Accuscript(Stratagene)反應(yīng)中以產(chǎn)生第一條鏈cDNA。2.5.2.SV63Vh區(qū)的分萬和克隆使用1ju1來源于SV63RNA的經(jīng)oligo-dT引發(fā)的第一條鏈cDNA作為模板以及寡核苷酸RoPro-9(SEQIDNO:37)和RoPro-28(SEQIDNO:38)來進行PCR。采用RocheGC-RICHPCRSystem,其中以在25p1反應(yīng)體積中0.5M的濃度使用GC-RICH解析緩沖液(resolutionbuffer)。在StratageneRobocycler中使用下列循環(huán)條件進行反應(yīng)循環(huán)l-5循環(huán)6-35最后延伸94X:30秒94"C30秒30秒60X:30秒72°C60秒72*C60秒72X:300秒從這個反應(yīng)中，PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量非常低。因此，進行第二次PCR以進一步擴增所產(chǎn)生的分子。使用來自上述反應(yīng)的2ju1PCR產(chǎn)物作為模板，使用下列寡核苷酸引物對來建立2個反應(yīng)URoPro-6(SEQIDNO39，特異性低于RoPro-9(SEQDINO37)和RoPro-25(SEQIDNO:40,3'嵌套的);和ii)RoPro-9(SEQ:IDNO37)和RoPro-28(SEQIDNO:38)。如上所述進行PCR。當(dāng)上述反應(yīng)的樣品在1%瓊脂糖/TBE凝膠上電泳并用溴化乙錠染色時，2個PCRs包含大約400bp的DM片段。使用GenecleanSpin試劑盒來分離和純化由上述反應(yīng)2產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物，并克隆到pCRTOPOBluntII(Invitrogen)中。8個TOPO克隆通過DM測序進行充分表征，這些克隆中的一個具有通過UniProt/IPI數(shù)據(jù)庫的BLASTP分析所測定的典型(但獨特的)Vh序列的特征。2.5.3.SV63Vl區(qū)的分萬和克隆使用2jn1來源于SV63RNA的經(jīng)oligo-dT引發(fā)的第一條鏈cDNA作為模板以及寡核苷酸RoPro-3(SEQIDNO:41)和RoPro-4(SEQIDNO:42)來進行PCR。在50ja1反應(yīng)體積中l(wèi)吏用StratagenePfuUltraDNA聚合酶，并且反應(yīng)在MJResearchDyad熱循環(huán)儀中4吏用下列循環(huán)條件來進行95*C，1分鐘，隨后[95X:，1分鐘；52X:，1分鐘；68<formula>formulaseeoriginaldocumentpage44</formula>，3分鐘]40個循環(huán)，隨后為68C，IO分鐘的最后延伸。上述反應(yīng)的樣品在1%瓊脂糖/TBE凝膠上進行分析并用溴化乙錠染色，觀察到大約350bp的片段。使用QiaQuick(Qiagen)凝膠洗脫來分離和純化這個PCR產(chǎn)物，并克隆到pCRT0P0BluntII(Invitrogen)中。5個T0P0克隆通過DNA測序進行充分表征，這些克隆中的4個是(但獨特的)Vl序列的特征。所述5個克隆中的1個包含與M0PC21k輕鏈可變序列(Swissprot:P01634)相同的序列，從在雜交瘤制備中所使用的骨髓瘤融合伙伴擴增出的無關(guān)序列。2.5.4.將Vh和W序列裝配到scFv構(gòu)建體中PCR-重疊延伸(也稱為"剪接-重疊延伸，，；SOE)用于制備2個方向的SV63scFv:(i)VH-[Gly4Ser]3連接體-VL，和(ii)VL-[Gly4Ser]3連接體-Vh),每個在大腸桿菌表達載體pDGF(來源于NEB載體pMALc-2,pDGF包括pMALc-2的所有特征，除了編碼麥芽糖結(jié)合蛋白的序列外，其已被切除)和pIMS147(Hayhurst和Harris,1999,ProteinExpressionandPurification15:336-343)中包含N-末端PelB前導(dǎo)序列以及C-末端FLAG和六組氨酸標(biāo)簽。下表5說明了所使用的寡核苦酸引物及其目的。表5.用于將Vh和Vl序列裝配到scFv構(gòu)建體中的引物引物目的SEQIDNO:scFvoligo1SV63scFVVL::VH方向PelB:Vl正向引物43scFvoligo2SV63scFvVL::VH方向Vl:GlySer反向引物44scFvoligo3SV63scFvVL::VH方向GlySer:Vh正向引物45scFVoligo4SV63scFvVL::VH方向Vh:FLAG:His反向引物46scFvoligo5SV63scFvVH::VLscFvoligo6SV63scFvVH::VLscFvoligo7SV63scFvVH::VLscFvoligo8SV63scFvVH::VL方向PelB:Vh正向引物47方向Vh:GlySer反向引物48方向GlySer:VI正向引物49方向VI:FLAG:His反向引物50為了制各Vl-[Gly4Ser〗3連接體-VhscFv序列,以2個步驟進行PCR。第一個步驟由2個反應(yīng)組成，使用i)scFvoligo's1和2(分別為SEQIDNO:43和44)和作為模板的pCRTOPOBluntllSV63W克隆，以擴增構(gòu)建體的5'—半；ii)scFvoligo、3和4(分別為SEQIDNO:45和46)和作為才莫板的pCRTOPOBluntllSV63Vh克隆，以擴增構(gòu)建體的3'—半。第二個步驟使用S0E以通過下列方法來連接來自(i)和(ii)的2個片段退火其互補的3'和5'末端(分別地)，并通過加入聚合酶而延伸成全長產(chǎn)物，隨后使用scFvoligo'sl和4(分別為SEQIDNO:43和46)進行擴增。Vf[Gly4Ser]3連接體-、scFv序列以類似方法制備。第一個步驟由2個反應(yīng)組成，使用i)scFvoligo's5和6(分別為SEQIDNO:47和48)和作為模板的pCRTOPOBluntllSV63Vh克隆，以擴增構(gòu)建體的5'—半；ii)scFvolig(Zs7和8(分別為SEQIDNO:49和50)和作為模板的pCRTOPOBluntllSV63Vl克隆，以擴增構(gòu)建體的3'一半。第二個步驟使用S0E以通過下列方法來連接來自(i)和(ii)的2個片段退火其互補的3'和5'末端(分別地)，并通過加入聚合酶而延伸成全長產(chǎn)物，隨后使用scFvoligo's5和8(分別為SEQIDNO:47和50)進行擴增。使用RocheGCRICH試劑盒和制造商的條件，用在25pl反應(yīng)體積中0.5M濃度的GC-RICH解析緩沖液來進行第一個步驟反應(yīng)。在StratageneRobocycler中使用下列循環(huán)條件進行反應(yīng)循環(huán)l-2循環(huán)3-27最后延伸94°C30秒94X:30秒54*C30秒65t:30秒60秒72匸60秒300秒上述反應(yīng)的樣品在1%瓊脂糖/TBE凝膠上進行分析并用溴化乙錠染色，這些揭示出已產(chǎn)生了所有4個預(yù)期的DNA片段。第二個步驟SOE反應(yīng)通過下列方式來進行使用制造商的條件，用在25p1體積中0.5M濃度的GC-RICH解析緩沖液，在RocheGCRICH試劑盒反應(yīng)中以大約相等的量混合合適的片段。使用下面的2步循環(huán)條件來進行反應(yīng)循環(huán)l-2941C30秒65。C30秒72°C60秒這個反應(yīng)充當(dāng)用于產(chǎn)生全長融合物的引物延伸。然后加入寡核苷酸引物以使用下列循環(huán)條件來PCR擴增全長分子。循環(huán)3-15最后延伸94。C30秒30秒72"C60秒72匸300秒當(dāng)上述SOE反應(yīng)的樣品在1%瓊脂糖/TBE凝膠上進行分析并用溴化乙錠染色時，2個反應(yīng)均顯示出包含大約750bp(預(yù)期大小)的DNA片段。使用GenecleanSpin試劑盒分離并純化SOE產(chǎn)物，并克隆到pCRT0P0BluntII(Invitrogen)中。對于每種S0E產(chǎn)物(VH->VL和V「>VH)，T0P0克隆通過DNA測序來進行充分表征。然后，通過使用i^/el和fcoRI從pCRTOPOBluntil中切出scFv序列，并隨后連接到類似制備的pDGF載體主鏈DNA中來制備pDGF表達構(gòu)建體(pDGF-SV63-VHVL和pDGF-SV63-VLVH)。還通過使用和fcoRI從pCRTOPOBluntII中切出scFv序列，并隨后連接到類似制備的pIMS147載體主鏈DM中來產(chǎn)生pIMS147表達構(gòu)建體(pIMS-SV63-VHVL和pIMS-SV63-VLVH)。根據(jù)制造商的說明書將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10細胞(Invitrogen)中，并鑒定轉(zhuǎn)化體。通過DNA序列分析來鑒定正確的pIMS147-SV63scFv和pDGF-SV63scFv克隆，以證實閱讀框的保留和序列的精確度。2.5.5.重組scFv蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達根據(jù)Charlton("AntibodyEngineering:methods&protocols"第245-254頁，Ed.B.K.C.Lo，HumanaPress,2004)所描述的指南，就可溶性scFv蛋白質(zhì)的表達來測試pIMSSV63-scFv大腸桿菌TOP10克隆。簡言之，將所選擇的克隆的過夜培養(yǎng)物用于接種在2.5L燒瓶中的500ml2TY(amp/glu)(1升中含16g細菌用蛋白胨/5g酵母提取物/5gNaCl/2%(w/v)葡萄糖，pH7.5，+lOOjug/ml氨芐青霉素)，其隨后在37C和250rpffl下孵育直至0D,達到約0.8。在這個點上，通過在3000g下離心來收獲細胞，并轉(zhuǎn)移至在2.5L燒瓶中的500ml新鮮2TY(amp/sue)(1升中含16g細菌用蛋白胨/5g酵母提取物/5gNaCl/0.4M蔗糖，pH7.5，+lOOyg/ml氨芐青霉素)之中。隨后在30X:和250rpm下開始孵育1小時，然后加入IPTG至1mM的最終濃度。然后再孵育16小時，在這個點上收獲細胞和培養(yǎng)基，并使用SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡程序就重組scFv的存在進行分析。其中與BMPOD生色底物溶液(Roche)相組合地使用抗FLAGMhHRP抗體(Sigma)的蛋白質(zhì)分析表明，對于兩個方向的scFv，在可溶性細胞裂解物和培養(yǎng)基樣品中均存在重組蛋白質(zhì)的良好表達水平(具有大約30kDa的預(yù)期大小分子量)。使用IMAC柱色鐠法來純化重組scFv蛋白質(zhì)，并在使用Caco2Bbel細胞(CRL-2102,美國典型培養(yǎng)物保藏中心)的免疫細胞化學(xué)測定法中通過與親本SV63MAb竟?fàn)幗Y(jié)合抗原來測試功能性。觀察兩個方向的scFv以抑制親本SV63MAb與細胞表面的結(jié)合，這表明在經(jīng)改造的scFv中保留了抗原結(jié)合表面。實施例3:抗體純化3.1.肽親和柱的制備為了從多克隆血清中純化出肽特異性抗體，制備肽親和柱。取決于肽的N-末端殘基，使用用于柱制備的兩種方法中的一種。這些使用SulfoLink或AminoLink偶聯(lián)凝膠作為親和基質(zhì)。SulfoLink偶聯(lián)凝膠(Perbio)允許含巰基的肽共價固定至瓊脂糖凝膠支持物以在親和純化程序中使用。使用由制造商提供的和下文概述的方案將RSPEs偶聯(lián)至這種凝膠。10mlSulfoLink凝膠漿(5ml凝膠床體積)平衡至室溫。將凝膠漿傾入柱中，并用20ml偶聯(lián)緩沖液(50mMTris，5mMEDTApH8.5)(Sigma)平衡。將1mg合成肽溶解于5ml偶聯(lián)緩沖液中并加入柱中。密封柱，并在室溫下伴隨顛倒混合來孵育15分鐘，隨后允許凝膠穩(wěn)定30分鐘。排出過量緩沖液，然后用15ml偶聯(lián)緩沖液洗滌柱。用5ml在偶聯(lián)緩沖液中的50mML-半胱氨酸鹽酸鹽(Sigma)封閉非特異性結(jié)合位點。如上所述，密封柱并在進行混合或不進行混合的情況下進行孵育。柱用30mlIM氯化鈉(Sigma)洗滌，并通過施加10ml包含0.05%疊氮化鈉(Sigma)的除氣PBSpH7.2進行制備以用于jj^存。偶聯(lián)的柱貯存于4r。AminoLink偶聯(lián)凝膠(Perbio)允許肽經(jīng)由伯胺共價固定至瓊脂糖凝膠支持物以在親和純化程序中使用。使用由制造商提供的和下文概述的方案將RSPEs偶聯(lián)至這種凝膠。10mlAminoLink凝膠漿(5ml凝膠床體積)平衡至室溫。將凝膠漿傾入柱中，并用20ml偶聯(lián)緩沖液(0.1M磷酸鈉，pH7.5，0.05%疊氮化鈉)平衡。將lmg合成肽溶解于5ml偶聯(lián)緩沖液中。隨后向肽溶液中加入250pi在0.01M氫氧化鈉(Sigma)中制成的1M氰基硼氫化鈉，將溶液傾入柱中。密封柱，并在室溫下伴隨顛倒混合來孵育6小時。讓柱站立，并隨后去除上清液。加入5ml1MTris-HClpH7.4(Sigma)和250pi在0.01M氫氧化鈉中制成的1M氰基硼氫化鈉。密封柱，并在室溫下伴隨顛倒混合來孵育30分鐘。柱用30ml1M氯化鈉洗滌，并通過施加10ml包含0.05%疊氮化鈉的除氣PBS進行制備以用于貯存。偶聯(lián)的柱貯存于4x:。3.2.從多克隆血清中純化肽特異性抗體多克隆兔血清在2500xg下離心IO分鐘，使用0.45微米膜過濾，并隨后用PBS進行1:1稀釋。讓肽親和柱達到室溫，并隨后用4柱體積的PBS平衡。將制得的血清溶液加入柱，將流出液再施加至柱上。柱用6柱體積的PBS洗滌。通過將O.1M甘氨酸-HC1pH3.0(Sigma)施加至柱并在包含O.1ml1MTris-HClpH8.0的管中收集1ml級分來洗脫肽特異性抗體。隨后通過在280nm處的吸光度來鑒定包含蛋白質(zhì)的級分，并將它們合并在一起。使用具有10,000分子量截止值的Slide-a-Lyser盒(Perbio)將純化的抗體透析到PBS中，并貯存于-20X:。同時，柱用3柱體積的0.1M甘氨酸-HClpH2.5，隨后為8柱體積的PBS來再生。3.3.單克隆抗體的純化使用HiTrapG蛋白HP1ml柱(GEHealthcare)通過G蛋白親和色鐠法從培養(yǎng)物上清液中純化出單克隆IgG。將培養(yǎng)物上清液在2500xg下離心IO分鐘，并在使用前用0.45微米膜過濾。最大流速自始至終為1ml/分鐘。柱用10柱體積的PBSpH7平衡，并加載樣品。柱用IO柱體積的PBS洗滌。通過將0.1M甘氨酸-HClpH3.0(Sigma)施加至柱上并在包舍O.1ml1MTris-HClpH8.O的管中收集lml級分來洗脫抗體。隨后通過在280nm處的吸光度來鑒定包含蛋白質(zhì)的級分，并將它們合并在一起。使用具有io，ooo分子量截止值的Slide-a-Lyser盒(Perbio)將純化的抗體透析到PBS中，并貯存于-20匸。同時，柱用IO柱體積的0.1M甘氨酸pH2.5再生，用10柱體積的PBS洗滌，并于4X:貯存在20%乙醇中。實施例4:抗體表征4.1.通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)來滴定抗-肽抗體基于EngvallE.和PerlmannP.Immunochemistry8，871-874(1971);HarlowE.等人，Antibodies-ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,1988，笫182-183頁描述的方法，通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定從用肽綴合物免疫接種的兔、小鼠或倉鼠獲得的血清以測定抗體應(yīng)答的相對量級。在35mM碳酸氫鈉，15mM碳酸鈉(pH9.5)中2pg/ml的肽溶液以lOOju1/孔加入96孔微量滴定板中，并于4T孵育至少4小時。板隨后用PBS，0.05%Tween20(PBST)(Sigma)洗滌3次。剩余的結(jié)合位點用200ul/孔的包含1%脫脂奶粉Marvel，PremierFoods,StAlbans)的PBS在室溫下封閉30分鐘。如上洗滌后，以100jil/孔向板中加入PBST。將最初的血清稀釋物加入在第1列中的一式兩份孔中，并隨后跨越板的孔進行兩倍稀釋，留下第12列中的孔只包含PBST。板在室溫下孵育2小時。進一步如上洗滌后，板在室溫下與在PBST中稀釋至1/10，000的合適的經(jīng)綴合的抗-物種抗體一起孵育1小時。兔血清樣品與山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(HRP)綴合物(Sigma)一起孵育；倉鼠血清與兔抗敘利亞倉鼠IgG-HRP綴合物(Stratec，Soham,Cambridgeshire)—起孵育；并且小鼠血清樣品將與兔抗小鼠IgG-HRP綴合物(Sigma)和山羊抗小鼠IgGFc片段-HRP綴合物(Sigma)一起孵育。通過在10ml的24mM檸檬酸、60mM磷酸鈉pH5.0中稀釋包含1mg3，3'，5，5'四甲基聯(lián)苯胺二鹽酸鹽(Sigma)的一個藥片并加入2pi30%過氧化氫溶液(Sigma)來制備底物溶液。進一步洗滌后，將新鮮底物溶液以lOO]u1/孔加入板中，并將板置于黑暗中和室溫下30分鐘。所得到的顏色形成通過加入50ju1/孔的3M硫酸來中止。隨后使用微量滴定板閱讀器在450nm處讀取板的光密度。4.2.EILSA結(jié)果4.2.1.來自兔的多克隆抗血清如上文實施例4.1中所述，通過肽EILSA來測定在第3劑后從用來自下列靶蛋白的RSPEs免疫接種的兔(參見上文實施例2.1)中獲取的血清大鼠寡肽轉(zhuǎn)運蛋白PepTl、大鼠CD155(PVR-脊髓灰質(zhì)炎病毒受體；Tage4)、大鼠GTR2、大鼠CFTR、大鼠CNT2、大鼠MDR1、小鼠MDR1、大鼠蔗糖酶-異麥芽糖酶、小鼠GLUT7、大鼠GTR5、大鼠0ATP-B、大鼠GCC、大鼠PLB、大鼠LPH、大鼠AMPN、大鼠MCDL和大鼠SCAB。來自每只兔的測試和免疫前血清通過針對它們的免疫接種肽(immunisingpeptide)的滴定來進行測定。免疫應(yīng)答通過計算50%結(jié)合滴度值(減少最大信號至50%所需的稀釋度)來評估。結(jié)果概述于下表6中。表6.ELISA結(jié)果，顯示出已產(chǎn)生了針對指定RSPEs的兔多克隆抗體來源蛋白質(zhì)免疫接種RSPE~~50%結(jié)合滴度(稀釋倍數(shù))<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>測試18，000來自每一種測試放血獲得物的血清如實施例3.2中所述進行親和純化，并隨后如先前所述通過ELISA進行測試。結(jié)果在下表7中給出。表7.關(guān)于從兔測試血清獲得的經(jīng)親和純化的抗體的ELISA結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>用來自大鼠CNT2核苷轉(zhuǎn)運蛋白的RSPE免疫接種的兔的收獲放血獲得物也進行親和純化，并通過ELISA進行測試。來自兔l的收獲放血獲得物以0.86mg/ml的濃度在36.5ml中洗脫，并測得50%結(jié)合滴度為1/47,000。來自兔2的收獲放血獲得物以0.57mg/ml的濃度在27.5ml中洗脫，并測得50%結(jié)合滴度為1/44，000。使用A蛋白柱(Amersham)進一步純化來自兔1的經(jīng)親和純化的多克隆抗體，逆著磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)進行透析，并通過ELISA進行測試。這產(chǎn)生13ml的經(jīng)進一步純化的針對CNT2來源的RSPE(SEQIDNO:6)的多克隆IgG，其具有1.97mg/ml的濃度和1/90，000的50%結(jié)合滴度。4.2.2.來自小鼠的多克隆抗血清如上文實施例4.1中所述，通過肽EILSA來測定在第3劑后從用來自下列靶蛋白的RSPEs免疫接種的小鼠(參見上文實施例2.2)中獲取的血清大鼠寡肽轉(zhuǎn)運蛋白PepTl、大鼠CD155(PVR-脊髓灰質(zhì)炎病毒受體；Tage4)、大鼠GTR2、大鼠CFTR、大鼠CNT2、大鼠MDR1、小鼠MDR1、大鼠蔗糖酶-異麥芽糖酶、小鼠GLUT7、大鼠GCC、大鼠PLB和大鼠LPH。來自每只小鼠的測試血清通過針對它們的免疫接種肽的滴定來進行測定。免疫應(yīng)答通過計算50%結(jié)合滴度值(減少最大信號至50%所需的稀釋度)來評估。結(jié)果概述于下表8中。表8.ELISA結(jié)果，顯示出已產(chǎn)生了針對指定RSPEs的小鼠多克隆抗體來源蛋白質(zhì)免疫接種RSPE小鼠血清樣品50%結(jié)合滴度(稀釋倍數(shù))大鼠寡肽轉(zhuǎn)運蛋白PepTlSEQIDNO:11>100,000270，000370，0004〉100，000大鼠寡肽轉(zhuǎn)運蛋白PepTlSEQIDNO:21-210，00034一大鼠CD155(PVR，Tage4)SEQIDNO:313，000262，000341，0004—大鼠GTR2(GLUT2)葡萄糖SEQIDNO:412,000轉(zhuǎn)運蛋白22,0003-4一67,00077,00084,000<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>4.2.3.針對來自大鼠寡肽轉(zhuǎn)運蛋白PepTl的RSPE的單克隆抗體來自7種陽性單克隆細胞系(其產(chǎn)生針對具有SEQIDNO1的RSPE的抗體(參見上文實施例2.3))中每一種的40ml培養(yǎng)物上清液如實施例3.2中所述進行親和純化，并隨后如上文實施例4.1中所述通過ELISA進行測試。純化的單克隆抗體通過針對免疫接種肽(SEQIDNO:1)的滴定來進行測定。免疫應(yīng)答通過計算50%結(jié)合滴度值(減少最大信號至50%所需的稀釋度)來評估。結(jié)果概括于下表9中。表9.來自雜交瘤細胞系的經(jīng)親和純化的培養(yǎng)物上清液的ELISA結(jié)果，所述雜交瘤細胞系從用來自大鼠寡肽轉(zhuǎn)運蛋白PepTl的RSPE免疫接種的小鼠產(chǎn)生_雜交瘤細胞系洗脫體積(ml)濃度(mg/ml)50%結(jié)合滴度_(稀釋倍數(shù))1645.142.002^El300，0001644.112.04041.112,5001645.451.20920.1-1647.372.24531.292,0001646.461.14420.08-1647.449.04720.09-1646.240.20620.1-雜交瘤細胞系1645.142，002、1644.112.040和1647.372，245清楚地產(chǎn)生了單克隆抗體，其識別具有來源于大鼠PepTl的SEQIDNO1序列的RSPE。4,2.4.針對來自小鼠GLUT7轉(zhuǎn)運蛋白的RSPE的單克隆抗體來自4種陽性單克隆細胞系(其產(chǎn)生針對具有SEQIDNO11的RSPE的抗體(參見上文實施例2.3))中每一種的40ml培養(yǎng)物上清液如實施例3.2中所述進行親和純化，并隨后如上文實施例4.1中所述通過ELISA進行測試。純化的單克隆抗體通過針對免疫接種肽(SEQIDNO:11)的滴定來進行測定。免疫應(yīng)答通過計算50%結(jié)合滴度值(減少最大信號至50%所需的稀釋度)來評估。關(guān)于4種抗-GLUT7單克隆抗體中的2種的結(jié)果概括于下表10中。表10.來自雜交瘤細胞系的經(jīng)親和純化的培養(yǎng)物上清液的ELISA結(jié)果，所述雜交瘤細胞系從用來自小鼠GLUT7轉(zhuǎn)運蛋白的RSPE免疫接種的小鼠產(chǎn)生<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>4.3.嚙齒類動物腸組織切片的免疫組織化學(xué)將大鼠腸組織速凍在液氮中，并貯存于-80'C直至使用。所有組織于-20匸在恒冷切片機上進行切片，并將組織置于帶正電荷的載玻片上，在水冷的丙酮中固定IO分鐘并讓其風(fēng)干。載玻片貯存于-20"C并在切片的l個月內(nèi)使用。在開始免疫組織化學(xué)之前，讓所有載玻片升熱直至室溫。隨后將它們加栽到Sequenza上，用于執(zhí)行手動IHC。所有載玻片通過在室溫下施加過氧化物酶封閉物(在DakoEnvision試劑盒中提供)6分鐘來封閉內(nèi)源性過氧化物酶。隨后，載玻片在具有吐溫20(0.1%)的TRIS-緩沖鹽水(10mM)(TBST)中洗滌5分鐘。非特異性蛋白質(zhì)通過在室溫下加入5%牛奶蛋白質(zhì)(Marvel)30分鐘來封閉。栽玻片在TBST中洗滌5分鐘。施加一抗(在含1%Marver的TBST中制成，以表中所示的稀釋度)，并將載玻片在室溫下孵育1小時。隨后將載玻片在TBST中洗滌(2x5分鐘)。施加Envision⑧兔聚合物，并在載玻片上于室溫下孵育30分鐘。在TBST中洗滌載玻片(2x5分鐘)。在室溫下施加DAB5分鐘。在經(jīng)蒸餾的H20中洗滌載玻片，通過分級乙醇和二曱苯進行脫水，并隨后置于DPX中。表11.針對特定RSPE產(chǎn)生的兔多克隆抗體的免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)的概括<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>9小鼠MDR1多藥抗性轉(zhuǎn)運蛋白1:1:10-200無染色無染色10大鼠蔗糖酶-異麥芽糖酶1:1:10-200無染色無染色11小鼠GLUT7葡萄糖1:25-1:50十二指腸腺上隱窩上皮細胞隱窩上皮細隱窩上皮細胞用過量肽成轉(zhuǎn)運蛋白200有染色染色胞染色染色功地阻斷了染色12小鼠GLUT7/大鼠GTR5(GLUT5)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1:1:10-200無染色無染色15大鼠OATP-B(SLC2U9)有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽1:1:10-200可能的隱窩上皮染色27大鼠GCC(鳥苷酸環(huán)1:25-1:25隱窩上皮細胞隱窩上皮細胞隱窩上皮細隱窩上皮細胞用過量肽成化酶)1:200和絨毛上皮細胞染色和絨毛上皮細胞染色胞和絨毛上皮細胞染色和絨毛上皮細胞染色功地阻斷了染色28大鼠PLB(磷脂酶1:25-1:50絨毛和隱窩上絨毛和隱窩上絨毛和隱窩絨毛和隱窩上用過量肽沒1:200皮細胞染色皮細胞染色上皮細胞染色皮細胞染色有成功阻斷染色-提示看到了非特異性染色29大鼠LPH(乳糖酶-1:25-1:25可能的隱窩和可能的隱窩和無染色無染色用過量肽成根皮苷水解酶)1:200絨毛上皮細胞染色絨毛上皮細胞染色功地阻斷了在十二指腸和空腸中的染色31大鼠AMPN(氨肽酶1:1:25-200無染色無染色無染色無染色200680013523.3ss士-遂「、&溜步被54/71到<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>使用封閉肽(blockingpeptide)來評估特異性染色。在產(chǎn)生最佳染色的稀釋度上的一抗與10倍過量的肽一起于室溫下在含1%Marvel的TBS中孵育2小時，然后施加于載玻片上，其余方案如上所述。結(jié)果概述于上表11中。實施例5:重組蛋白質(zhì)毒素的產(chǎn)生5.1.重組白樹毒蛋白的產(chǎn)生編碼具有251個氨基酸的白樹毒蛋白的基因(參見Nolan等人，1993，Gene134:223-227)連同/e/5前導(dǎo)序列和C-末端六組氨酸標(biāo)簽一起對于大腸桿菌表達進行密碼子優(yōu)化，并在處于混合"c啟動子控制下的條件下克隆到到大腸桿菌表達載體(pDGF-來源于NEB載體pMALc-2，pDGF包括pMALc-2的所有特征，除了編碼麥芽糖結(jié)合蛋白的序列外，其已被切除)中。將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌抹TOP10中。通過在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的TOP10細胞并于28X:用1mMIPTG誘導(dǎo)20小時來獲得白樹毒蛋白的表達。在收獲大腸桿菌細胞后，使用弗氏細胞壓碎器(ConstantSystems;在20，000psi下破裂)在lxPBS/30mM咪唑中破裂細胞。將可溶性提取物施加于GraviTrap柱(GEHealthcare)上，并在用15mllxPBS/30mM咪喳洗滌后，在lxPBS/500mM咪唑中洗脫白樹毒蛋白。作為第二個純化步驟，洗脫物經(jīng)脫鹽而進入20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)中，并施加于ResourceS陽離子交換柱上，進行0-lM鹽梯度洗脫。為確定重組白樹毒蛋白是否具有活性(有功能的)，將純化的白樹毒蛋白在蛋白質(zhì)翻譯抑制測定法(TNTT7快速的偶聯(lián)式轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)，Promega)中進行測試，其中使用T7螢光素酶DNA作為底物。作為陽性對照，使用環(huán)己酰亞胺。這證實，純化的重組白樹毒蛋白抑制了T7螢光素酶DNA的翻譯。5.2.重組VIP2A的產(chǎn)生編碼具有464個氨基酸的VIP2A蛋白(參見US5，849，870)的基因連同C-末端六組氨酸標(biāo)簽一起對于大腸桿菌表達進行密碼子優(yōu)化，并克隆到pET24a表達栽體(Novagen)中。將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21(DE3)中。通過在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細胞并于用1mMIPTG誘導(dǎo)20小時來獲得VIP2A的表達。在收獲后，如上文實施例5.1中所述使用弗氏細胞壓碎器來破裂細胞。將可溶性提取物施加于HisTrapHP柱(GEHealthcare)上，并在用5柱體積的PBS/20mM咪唑洗滌后，用高達50QmM咪唑的梯度來洗脫VIP2A蛋白?？扇苄蕴崛∥锖蛠碜约兓^程的樣品的SDS-PAGE分析揭示出條帶，該條帶在對于重組生產(chǎn)的具有組氨酸標(biāo)簽的VIP2A的預(yù)期大小處。5.3.用于產(chǎn)生重組粒酶B的表達構(gòu)建體人工合成編碼具有228個氨基酸的、成熟的、來自大鼠的粒酶B的基因(關(guān)于序列信息參見Genbank登錄號M34097)(DNA片段050031)，并克隆到pCR-Script中從而得到質(zhì)粒p050031。采取巢式PCR方法將粒酶B編碼序列導(dǎo)入表達載體pET32a(+)(Novagen)中。使用引物RoPro070petEK/rGrzBFl(SEQIDNO:51)和RoPro067rGrzBR(SEQIDNO:52)從p050031中PCR擴增出成熟的粒酶B編碼序列，以導(dǎo)入與在pET32a(+)中的融合標(biāo)簽之中存在的腸激酶位點同源的5'尾部。所得到的PCR產(chǎn)物用作巢式PCR的第二部分的模板，所述巢式PCR的第二部分使用引物RoPro076petEK/rGrzBF2(SEQIDNO:53)和RoPro067rGrzBR(SEQIDNO:52)來進4亍以導(dǎo)入5'位點。最終的PCR產(chǎn)物用Kpnl/Notl進行消化，并連接到經(jīng)類似消化的pET32a(+)中，從而得到表達載體pET32a(+)::rGrzB。這導(dǎo)致來自宿主載體的N-末端表達標(biāo)簽和重組粒酶B編碼序列之間的整齊融合，從而允許在表達后通過用腸激酶進行處理來激活重組粒酶B。最終的表達載體pET32a(+)::rGrzB可以轉(zhuǎn)化到任何合適的大腸桿菌表達宿主(例如RosettaGami(DE3))中。在構(gòu)建pET32a(+)::rGrzB中使用的引物序列如下(所有引物序列以5'到給出)RoPro070petEK/rGrzBFl(SEQIDNO:51)GGTACCGACGACGACGACAAGATCATCGGTGGTCACGAAGCTAAGCCAC;RoPro067rGrzBR(SEQIDNO:52)AGCTGGCGGCCGCCTAGGAC;RoPro076petEK/rGrzBF2(SEQIDNO:53)AGATCTGGGTACCGACGACGACGAC。實施例6:抗體組分與毒素的綴合6.1.商購可得的白樹毒蛋白與多克隆抗大鼠CNT2抗體的綴合被選擇用于執(zhí)行這個操作的策略為用交聯(lián)劑SPDP(N-琥珀酰亞氨基-3-[2-吡咬基二硫基]丙酸酯；PierceChemicalCo.)來激活抗體，所述交聯(lián)劑SPDP將與硫醇化的毒素形成二硫鍵。所使用的方法來自Hermanson1996"BioconjugateTechniques"(AcademicPress第509頁)，其說明，該綴合不會干擾毒素白樹毒蛋白的活性(30kDa)。使用5:1和10:1的白樹毒蛋白與抗-CNT2多克隆抗體的摩爾比以獲得最有效的反應(yīng)混合物。6.1.1.CNT2多克隆抗體的SPDP處理4吏用centricon旋轉(zhuǎn)濃縮器以10kDa的截止值來濃縮經(jīng)A蛋白純化的兔l多克隆IgG(參見實施例4.2.1，親和純化來自兔l的收獲放血獲得物，并隨后使用A蛋白柱進行純化)的lml等分試樣。將所得到的160ul制成在PBS10mMEDTApH8中的10mg/ml溶液。將6ulSPDP(在DMF中，3mg/ml)加入200ul抗體溶液中，并在室溫下孵育30分鐘。將反應(yīng)混合物施加至用PBS+10mMEDTApH8平衡的PD10脫鹽柱上。收集所有3.5ml樣品體積，并4吏用centricon濃縮器進行濃縮，從而獲得最終濃度為3.6mg/ml的經(jīng)SPDP處理的抗-CNT2抗體。6.1.2.白樹毒蛋白的石克醇化作為從多花白樹(Ce/o/7/"邁/Z7i7/"77or咖)的種子中純化出的5mg凍干蛋白質(zhì)樣品從AczonSpA獲得白樹毒蛋白。最初將樣品以5mg/ml的濃度溶解于PBS中。將300ul的這種溶液在centricon濃縮器中進行濃縮，并使體積減少至55ul。隨后將這在50mM三乙醇胺，10mMEDTApH8中進行稀釋以得到10mg/ml的白樹毒蛋白溶液。溶解2-Immunothiolane以得到在蒸餾水中的20mg/ml溶液。將10.5ul的2-Immunothiolane溶液加入150ul白樹毒蛋白溶液中，并將混合物在冰上孵育1小時。將活化的白樹毒蛋白施加于用PBS+10mMEDTApH8平衡的PD10脫鹽柱上。收集所有3.5ml樣品體積，并在centricon濃縮器中進行濃縮，從而獲得最終濃度為3mg/ml的硫醇化的白樹毒蛋白。6.1.3.抗-CNT2多克隆抗體與白樹毒蛋白的綴合為了獲得5:1的白樹毒蛋白與抗-CNT2抗體的摩爾比，需要0.5mg石充醇化的白樹毒蛋白與0.5mg抗-CNT2抗體反應(yīng)。因此，將138ul經(jīng)SPDP處理的抗-CNT2抗體加入167ul石克醇化白樹毒蛋白中。反應(yīng)還在白樹毒蛋白與抗-CNT2抗體的摩爾比為10:1的情況下進行(將在333ul中的1mg硫醇化白樹毒蛋白加入至在138ul中的0.5mg經(jīng)SPDP處理的抗-CNT2抗體中)。每個反應(yīng)體系在氮氣下密封，并于4"C賻育20小時。這個時間后，任何未反應(yīng)的巰基殘基通過加入碘乙酰胺至2mM的最終濃度來進行封閉。6.1.4.綴合物的分析每個反應(yīng)混合物通過MALDI-TOF質(zhì)鐠法、SDS-PAGE和ELISA來進行分析。從反應(yīng)混合物的SDS-PAGE分離和質(zhì)譜法獲得的數(shù)據(jù)(未顯示)揭示出每個綴合反應(yīng)都是成功的，并且鑒定出了1、2和3分子的白樹毒蛋白綴合至單個抗體分子的種類。盡管質(zhì)語法數(shù)據(jù)揭示了某些未綴合抗體的存在，其量不足以在經(jīng)考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠上被觀察到。看起來，在2種反應(yīng)比例之間在綴合效率方面沒有差異。如先前所述對每個反應(yīng)混合物進行ELISA測定法，以便評估抗體的結(jié)合活性是否受到綴合反應(yīng)的影響。獲得的數(shù)據(jù)概括于下表12中。表12.關(guān)于白樹毒蛋白與抗-CNT2多克隆抗體的綴合的ELISA數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>可以看出，結(jié)合受到添加SPDP多聚連接體(polylinker)和綴合至白樹毒蛋白這兩者的影響。然而，綴合的抗體反應(yīng)混合物仍顯示出顯著的結(jié)合。這可以歸因于在反應(yīng)混合物中的綴合和未綴合的抗體。因為未綴合抗體的量很低，所以假定，所觀察到的結(jié)合的良好比例可能歸因于綴合的抗體。6.2.重組白樹毒蛋白與多克隆抗大鼠CNT2抗體的綴合采用與上文實施例6.1中所概述的相同的策略以便將如上文實施例5中所述而生產(chǎn)的重組白樹毒蛋白綴合至多克隆抗大鼠CNT2抗體。使用5:1的白樹毒蛋白與抗-CNT2多克隆抗體的摩爾比以獲得最有效的反應(yīng)混合物。6.2.1.抗-CNT2多克隆抗體的SPDP處理作為在PBS/10mMEDTApH8中的10mg/ml溶液將3.75mg經(jīng)A蛋白純化的兔1多克隆抗體與11.25ulSPDP(在DMF中，3mg/ml)混合，并在室溫下孵育30分鐘。反應(yīng)混合物經(jīng)過用PBS/10mMEDTApH8預(yù)平衡的Zeba(PierceChemicalCo.)脫鹽柱。6.2.2.重組白樹毒蛋白的^t醇化將3.75mg重組白樹毒蛋白在50mM三乙醇胺，10mMEDTApH8中制成10mg/ml。將2-Iminothiolane(Traut's試劑；Sigma-Aldrich)在除氣并氮起泡的去離子H20中溶解至20mg/ml，將26.25ul的這種溶液加入白樹毒蛋白溶液中，并在氮氣氛中在冰上孵育1小時。硫醇化的白樹毒蛋白經(jīng)過用PBS/10mMEDTApH8預(yù)平衡的Zeba(PierceChemicalCo.)脫鹽柱。6.2.3.抗-CNT2多克隆抗體與重組白樹毒蛋白的綴合將SPDP-反應(yīng)的抗體溶液與硫醇化的重組白樹毒蛋白溶液相混合，產(chǎn)生等量的每種蛋白質(zhì)組成成分，提供了5:1的重組白樹毒蛋白與抗體的摩爾比。反應(yīng)體系在氮氣下密封，并于4X:孵育20小時。這個時間后，通過加入硪乙酰胺至2mM的最終濃度來封閉任何未反應(yīng)的巰基，隨后為在室溫下最少孵育1小時。6.2.4.綴合物與未綴合的重組白樹毒蛋白的分離將使用PBS的凝膠過濾用于分離未綴合的白樹毒蛋白分子與綴合物。使用AktaFPLC設(shè)備(Amersham-Pharmacia)，將10/300Superdex200柱(Amersham-Pharmacia)在PBS中平衡，進行3個柱體積(CVs)。通過在PC上運行的Unicorn軟件(Amersham-Pha簡cia)來控制色鐠法，所述軟件注入樣品并隨后維持O.5ml/分鐘的流速，在洗脫O.1CVs后將0.5ml級分收集到96孔區(qū)塊中。讓洗脫進行1.4CVs。如制造商所述在非還原性SDS-PAGE凝膠(在MOPS緩沖液中的4-12%雙-三NuPage;Invitrogen)上分析所選擇的級分。如制造商所述，使用SimplyBlue考馬斯染料(Invitrogen)來染色凝膠。合并被確定包含綴合物的級分，并用于下一個純化步驟。合的抗-CNT2抗體的分離在重組白樹毒蛋白分子上存在六組氨酸C-末端尾部允許應(yīng)用固定的金屬螯合親和色譜法(IMAC)作為在綴合物純化中的第二個色譜步驟。在未綴合的抗體上缺乏六組氨酸基序(凝膠過濾后仍存在于綴合物級分中)允許從包含六組氨酸的綴合物中去除游離抗體。因此，將在上文6.2.4中獲得的合并的級分經(jīng)過HisTrapHPlml鎳-親和柱(通過5CVsPBS/15mM咪峻預(yù)平衡；AmershamBiosciences)，所述柱連接至受在PC上運行的Unicorn軟件(AmershamBiosciences)控制的AktaFPLC裝置。使用PBS/15mM咪唑作為加載/洗滌緩沖液，經(jīng)過5CVs來進行柱的加栽和洗滌。包含六組氨酸的蛋白質(zhì)的洗脫通過應(yīng)用15mM-500mM咪唑(在PBS中)的梯度經(jīng)過20CVs來完成。級分以O(shè).5ml體積收集在96孔區(qū)塊中。如制造商所述在非還原性SDS-PAGE凝膠(在MOPS緩沖液中的4-12%雙-三NuPage;Invitrogen)上分析所選擇的級分。如制造商所述，使用SimplyBlueTM考馬斯染料(Invitrogen)來染色凝膠。凝膠揭示出，通過IMAC步驟基本上將綴合物純化為不含游離抗體。合并包含綴合物的級分，并使用具有10kD分子量截止值的VivaSpin20ml旋轉(zhuǎn)濃縮器進4亍脫鹽而進入PBS中。6.2.6.綴合物的分析MALDI-T0F質(zhì)譜法用于分析相對于未綴合的抗-CNT2抗體來說合并的綴合物樣品的組成。獲得的質(zhì)語(未顯示)表明了在合并的綴合物級分(庫B)中存在1:1、1:2和1:3比率的抗體白樹毒蛋白綴合物種類。沒有觀察到帶單電荷的未綴合的抗體種類，然而鑒定出在光i瞽上的峰，其與帶雙電荷的未綴合的抗體種類有關(guān)。因此，盡管大多數(shù)未綴合的抗體被從綴合的抗體中純化出去(如IMAC純化過程的SDS-PAGE分析所表明的)，但可以推斷在合并的純化樣品中殘留非常少量的未綴合的抗體。通過ELISA(以確定綴合物對抗體結(jié)合的影響)和通過體外翻譯抑制測定法(以確定白樹毒蛋白的功能活性是否已受到綴合的影響)來評估在經(jīng)IMAC純化的合并樣品中綴合物的功能活性。ELISA(數(shù)據(jù)未顯示)揭示出與關(guān)于綴合至商業(yè)供應(yīng)的白樹毒蛋白(上文實施例6.1.4)時所觀察到的那些類似的結(jié)果抗體結(jié)合受到添加SPDP多聚連接體和綴合至重組白樹毒蛋白這兩者的影響，但綴合的抗體反應(yīng)混合物仍顯示出顯著的與大鼠CNT2RSPE的結(jié)合。盡管質(zhì)i普分析表明，即使在IMAC純化后仍存在某些未綴合的抗體殘留，但由于IMAC純化，在經(jīng)IMAC純化的樣品中未綴合抗體的量將少于在天然白樹毒蛋白/抗-CNT2抗體的綴合反應(yīng)混合物中的量。因此，觀察到的抗體結(jié)合可以歸因為主要是由于抗CNT2抗體-重組白樹毒蛋白綴合物。如制造商所述，使用TNT快速的偶聯(lián)式轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)(Promega)來測定在來自IMAC純化的合并的包含綴合物的樣品中綴合至抗-CNT2抗體的重組白樹毒蛋白的核糖體抑制能力的保留。圖2顯示了結(jié)果。通過在經(jīng)IMAC純化的合并樣品(庫B)中的綴合物所顯示的翻譯抑制等同于最初的重組白樹毒蛋白(rGelonin)。因此，在綴合后保留了核糖體抑制能力。6.3.商購可得的P-噪呤硫素與多克隆抗大鼠CNT2抗體的綴合選擇用于這種綴合的策略采用具有大的間隔臂的TFCS交聯(lián)劑(Pierce)，以便使得盡可能多地暴露于相對較小的(5kDa)P-嘌呤硫素分子。TFCS在一個末端上具有NHS酯基團，其結(jié)合抗體上的胺基團，并且在另一個末端上具有受保護的胺基團，通過將pH升高至8可將其暴露以用于與經(jīng)適當(dāng)處理的P-嘌呤硫素反應(yīng)。p-嘌呤硫素上的羧基與EDC反應(yīng)以形成不穩(wěn)定的胺反應(yīng)中間物，其隨后與sulfo-NHS反應(yīng)以提供更穩(wěn)定的鍵合。隨后將經(jīng)EDC/sulfo-NHS處理的p-嘌呤硫素結(jié)合至TFCS連接體的胺末端。6.3.1.CNT2多克隆抗體的TFCS處理使用centricon旋轉(zhuǎn)濃縮器以10kDa的截止值來濃縮經(jīng)A蛋白純化的兔1多克隆IgG(參見實施例4.2.1，親和純化來自兔1的收獲放血獲得物，并隨后使用A蛋白柱進行純化)的lml等分試樣。所得到的樣品容量為在O.1M磷酸鈉緩沖液，0.15MNaClpH7.2中高達5mg/ml。每500ji1抗體加入15ulTFCS(在DMF中，3mg/ml)，并在室溫下孵育l小時。將反應(yīng)混合物施加至用0.1M磷酸鹽緩沖液pH8平衡的PD10脫鹽柱上。收集所有3.5ml樣品體積，并使用centricon濃縮器進行濃縮，從而獲得最終濃度為10mg/ml的經(jīng)TFCS處理的抗-CNT2抗體。6.3.2.P-嘌呤硫素的EDC和sulfo-NHS處理將來自小麥胚乳的凍干P-嘌呤硫素(Takara)溶解在0.1M磷酸鈉緩沖液，0.15MNaClpH7.2中至10mg/ml的最終濃度。加入EDC以得到2mM的最終濃度，同時sulfo-NHS至5mM的最終濃度，并且使混合物在室溫下反應(yīng)15分鐘。通過加入2-巰基乙醇至20mM的最終濃度來中止反應(yīng)。將活化的嘌呤硫素施加至用O.IM磷酸鈉緩沖液，0.15MNaClpH7.2平衡的聚丙烯酰胺脫鹽柱(大小排阻極限為1,800Da;Pierce)上。收集級分并在0D280nm處檢測毒素的存在。6.3.3.抗-CNT2多克隆抗體與活化的P-噪呤硫素的綴合混合經(jīng)TFCS處理的抗體和經(jīng)EDC/sulfo-冊S處理的p-嘌呤石充素以得到30:1的p-噤呤硫素抗-CNT2抗體的摩爾比，并讓其于4X3反應(yīng)過夜。隨后通過加入羥胺至10mM的最終濃度來中止反應(yīng)。然后將反應(yīng)混合物施加至大小排阻色鐠法柱上，以分離游離的P-嘌呤硫素與抗體-p-嘌呤硫素綴合物。合并包含綴合物的級分。6.3.4.綴合物的分析MALDI-TOF質(zhì)譜法用于分析相對于未綴合的抗-CNT2抗體來說合并的綴合物樣品的組成。獲得的質(zhì)鐠(未顯示)表明在合并的綴合物級分中存在1:1、1:2和1:3比率的抗體P-嘌呤硫素綴合物種類。還觀察到一些帶單電荷的未綴合的抗體種類。如先前所述，通過ELISA評估在合并的樣品中綴合物的功能活性。關(guān)于綴合物的50%結(jié)合滴度經(jīng)計算為0.067jig/ml，而關(guān)于未綴合的抗-CNT2抗體為0.041jag/ml。表13.使用抗-CNT2::P-嘌呤硫素綴合物的大鼠胃腸組織免疫組織化學(xué)分析稀釋存在染色時的大鼠十^"指大鼠空腸大鼠回大鼠結(jié)腸用封閉肽度范綴合物的稀釋腸腸進行阻斷圍度1:251:25和1:50粘膜肌層染未測試未測試粘膜肌層染未測試—色以及械毛色以及絨毛1:50和隱窩上皮和隱窩上皮細胞染色細胞染色抗-CNT2::0-嘌呤硫素綴合物的樣品用于進行嚙齒類動物胃腸組織的免疫組織化學(xué)分析(關(guān)于方法參見實施例4.2)。結(jié)果概括于上表13中。實施例7:融合蛋白表達栽體的構(gòu)建在識別細胞表面抗原的scFv和3種不同的蛋白質(zhì)毒素即白樹毒蛋白、粒酶B和cyt2A之間構(gòu)建融合蛋白表達載體。在這個例示中所使用的scFvs是上文實施例2.5中所述的SV63scFvs。自始至終遵循用于質(zhì)粒制備、限制性內(nèi)切酶消化、連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化等的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)。7.1.白樹毒蛋白-scFv融合構(gòu)建體人工合成編碼具有251個氨基酸的白樹毒蛋白的基因(參見Nolan等人，同上)，5'序列設(shè)計為允許按閱讀框融合至來自SV63抗體的VH(產(chǎn)生人工基因054014)或VL(產(chǎn)生人工基因054013)編碼序列，并亞克隆到pCR-Script中以得到2個構(gòu)建體，p054013和p054014。質(zhì)粒p054013用S/7el和消化，純化產(chǎn)生的編碼白樹毒蛋白的片段并連接到經(jīng)類似消化的pDGF-SV63-VHVL中，從而得到載體pDGF-SV63-VHVLrGel。這形成了在SV63scFv的N-末端與重組白樹毒蛋白之間的經(jīng)由單個Gly4Ser連接體的框內(nèi)融合。因此，在pDGF-SV63-VHVLrGel中的表達盒在5'到3'方向上包括下列組分"c啟動子、；e^前導(dǎo)序列、SV63VH編碼序列、[Gly4Ser]3連接體、SV63、編碼序列、Gly4Ser連接體、重組白樹毒蛋白編碼序列。SV63VH編碼序列、[Gly4Ser]3連接體、SV63VL編碼序列、Gly4Ser連接體和重組白樹毒蛋白編碼序列可以容易地切割出為/fcoRI片段，并在需要時連接到備選的表達/克隆載體例如pIMS147或pET32a中。質(zhì)粒p054014用BseRI和Notl消化，純化產(chǎn)生的編碼白樹毒蛋白的片段并連接到經(jīng)類似消化的pDGF-SV63-VLVH中，以得到載體pDGF-SV63-VHVLrGel。這形成了在scFv的N-末端與重組白樹毒蛋白之間的經(jīng)由單個Gly4Ser連接體的框內(nèi)融合。因此，在pDGF-SV63-VHVLrGel中的表達盒在5'到3'方向上包括下列組分啟動子、/7eM前導(dǎo)序列、SV63Vt編碼序列、[Gly4Ser]3連接體、SV63VH編碼序列、Gly4Ser連接體、重組白樹毒蛋白編碼序列。SV63VL編碼序列、[Gl^Ser]3連接體、SV63VH編碼序列、Gly4Ser連接體和重組白樹毒蛋白編碼序列可以容易地切割出為iVcol/A"RI片段，并在需要時連接到備選的表達/克隆栽體例如pIMS147或pET32a中。7.2.粒酶B-scFv融合構(gòu)建體制備兩種構(gòu)建體，各攜帶N-末端融合至SV63scFv的粒酶B:pET32a::rGrzB::SV63VHVL和pET32a::rGrzB::SV63VLVH。使用pET32a(+)::rGrzB(上文實施例5.3)作為模板并結(jié)合引物重疊延伸法來構(gòu)建質(zhì)粒pET32a::rGrzB::SV63VHVL，以經(jīng)由單個Gly4Ser連接體在VJl方向上(N到C-末端)將成熟的粒酶B編碼序列融合至SV63scFv。(i)通過使用pET32a(+)::rGrzB作為PCR模板，并使用pETF(SEQIDNO:54)和RoPro071G4S/rGrzBRl(SEQIDNO:55)引物，而向成熟的粒酶B編碼序列添加編碼單個Gly4Ser連接體的3'末端序列。(ii)通過使用pDGF-SV63-VHVL作為PCR模板，并使用RoPro074rGrzB/G4S/VHVLF(SEQIDNO:56)和RoPro075pET/VHVLR(SEQIDNO:57)引物，而向SV63VHVL編碼序列添加編碼單個Gly^Ser連接體和部分粒酶B編碼序列的5'末端序列。純化來自上文(i)和(ii)的產(chǎn)物并以等摩爾量混合，然后進行無引物延伸，并隨后使用pETF(SEQIDN0:54)和RoPro075pET/VHVLR(SEQIDNO:57)進行PCR以擴增出全長融合產(chǎn)物，其通過使用獨特Sful和Notl位點而克隆到pET32a(+)中。還使用pET32a(+)::rGrzB(上文實施例5.3)作為模板并結(jié)合引物重疊延伸法來構(gòu)建質(zhì)粒pET32a::rGrzB::SV63VLVH，以經(jīng)由單個Gly4Ser連接體在VJh方向上(N到C-末端)將成熟的粒酶B編碼序列融合至SV63scFv。(i)如上文(i)中所描述的，向粒酶B編碼序列添加編碼單個Glyjer連接體的3'末端序列。(ii)通過使用pDGF-SV63-VLVH作為PCR模板，并使用RoPro072rGrzB/G4S/VLVHF(SEQIDNO:58)和RoPro073VLVH/pETR(SEQIDNO:59)引物，而向SV63VLVH編碼序列添加編碼單個Gly4Ser連接體和部分粒酶B編碼序列的5'末端序列。純化來自上文(i)和(ii)的產(chǎn)物并以等摩爾量混合，然后進行無引物延伸，并隨后使用pETF(SEQIDN0:54)和RoPro073VLVH/pETR(SEQIDNO:59)進行PCR以擴增出全長融合產(chǎn)物，其隨后通過使用獨特和7VWI位點而克隆到pET32a(+)中。在粒酶B-scFv融合構(gòu)建體的構(gòu)建中所使用的引物序列如上文實施例5.3中和如下所述(所有引物以5'至3'給出)pETF(SEQIDNO:54)TCGGTGATGTCGGCGATATAG;RoPro071G4S/rGrzBRl(SEQIDNO:55)ACTACCTCCGCCACCGGACTTCTTCATAGTTTTCTTGATCCAGG;RoPro074rGrzB/G4S/VHVLF(SEQIDNO:56)GAAGAAGTCCGGTGGCGGAGGTAGTGAGGTCCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCTGG;RoPro075pET/VHVLR(SEQIDNO:57)TGCTCGAGTGCGGCCGCTTATTACTTGATCTCCAGTTTGGTGCCTCCACCGAACG;RoPro072rGrzB/G4S/VLVHF(SEQIDNO:58)GAAGAAGTCCGGTGGCGGAGGTAGTGATATCGTTCTCACTCAATCTCCAGCAATC;RoPro073VLVH/pETR(SEQIDNO:59)TGCTCGAGTGCGGCCGCTTATTATGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCCTTGGCC。7.3.Cyt2A-scFv融合構(gòu)建體為了形成SV63scFv和Cyt2A序列的框內(nèi)融合，遵循Gurkan和Ellar(2003ProteinExpr.Purif.29(1):103-16)的實例。人工合成編碼Cyt2Aal(EMBL:BTCYTBG)的前237個氨基酸的基因以包含3'序列，所述3'序列被設(shè)計為形成14個氨基酸的Xpress表位(Invitrogen)的框內(nèi)C-末端添加。這種人工合成的Cyt2A-Xpress表位序列稱為051072，并亞克隆到pCRScript中從而得到p051072。在2個步驟中改變質(zhì)粒pDGF-SV63-VHVL(參見實施例2.5)。首先，設(shè)計并產(chǎn)生人工合成的序列(稱為p054247)，其將會通過包含SV63VL序列的3'末端序列的一部分、(Gly,Ser)3連接體和成熟Cyt2Aal蛋白的5'末端序列的一部分而形成連接片段(如Gurkan和Ellar所述，同上)。使用S/;el(5')和fcoRI(3')從p054247中切割出這個片段，并連接到經(jīng)類似制備的pDGF-SV63-VHVL(參見實施例2.5)中。然后，所得到的質(zhì)粒通過用S/"I和化/bHI切割并導(dǎo)入來自p051072的大約520bp^Y/I/^/dHI片段(代表成熟的Cyt2Aal序列的3'末端加上Xpress表位)來進一步修飾。所得到的質(zhì)粒(pDGF-SV63-VHVL::Cyt2A)包括SV63VHVLscFv經(jīng)由柔性連接體與活性(成熟)形式的Cyt2Aal(氨基酸37-237)以及隨后的Xpress表位的完全框內(nèi)融合。類似地，質(zhì)粒pDGF-SV63-VLVH在2步過程中進行修飾以導(dǎo)入Cyt2Aal序列。首先，設(shè)計并產(chǎn)生人工合成的序列(稱為p054248)，其將會通過包含SV63VH序列的3'末端序列的一部分、(Gly4Ser)3連接體和成熟Cyt2Aal蛋白的5'末端序列的一部分而形成連接片段(如Gurkan和Ellar所述，同上)。將該人工序列亞克隆到pCRScript中從而得到質(zhì)粒p05428。然后，使用^eRI(5')和化oRI(3')從p054248中切割出這個片段，并連接到經(jīng)類似制備的pDGF-SV63-VLVH中。然后，所得到的質(zhì)粒通過用5TwI和A/z/HI切割并導(dǎo)入來自p051072的大約520bp^wI/A/bHI片段(代表成熟的Cyt2Aal序列的3'末端加上Xpress表位)來進一步修飾。所得到的質(zhì)粒(pDGF-SV63-VLVH::Cyt2A)包括SV63VLVHscFv經(jīng)由柔性連接體與活性(成熟)形式的Cyt2Aal(氨基酸37-237)以及隨后的Xpress表位的完全框內(nèi)融合。實施例8:融合蛋白的表達將攜帶SV63scFv-白樹毒蛋白融合基因的載體(參見上文實施例7.1)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌T0P1Q細胞中。如下來進行中試表達研究在2xYT/2%葡萄糖培養(yǎng)基中生長經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞，然后在補充有1mMIPTG的2xYT培養(yǎng)基中在20"C或15"C下誘導(dǎo)16小時。收獲少量樣品(10ml)并離心，并且將每個細胞沉淀重懸浮于1ml裂解緩沖液(PBS)中。樣品進行超聲處理，在13，OOOrpm和室溫下再離心5分鐘，并傾去上清液(可溶性級分)。將沉淀(不溶性級分)重懸浮于lml裂解緩沖液中。通過使用針對六組氨酸標(biāo)簽的抗體的蛋白質(zhì)印跡法來分析可溶性和不溶性級分。分析揭示出，由所述兩種表達載體均產(chǎn)生了scFv-白樹毒蛋白融合蛋白(即其中scFv在VhVl方向，和其中scFv在VlVh方向)。然而，scFv的V^h方向得到較高產(chǎn)量的可溶性蛋白質(zhì)。進行更大規(guī)模的培養(yǎng)和誘導(dǎo)，并通過在Gravitrap柱上進行純化而從可溶性級分中進一步純化出scFv-白樹毒蛋白融合蛋白。實施例9:蛋白質(zhì)綴合物和融合蛋白的體外測試本發(fā)明的蛋白質(zhì)綴合物和融合蛋白導(dǎo)致上胃腸道損傷的能力通過測量粘膜對非可吸收性標(biāo)記甘露醇的滲透性來評估，其中使用分離的大鼠十二指腸區(qū)段。使用先前公開的方法(Heylings，1991，Toxicol.Appl.Pharmacol.107:482-493)的修飾，<吏體外分離的組織暴露于這些嚙齒類動物防治劑。簡言之，在人道終止生命后立即從成年雄性AlderleyPark品系大鼠(Ap:AkfSD)中取出10cm胃腸道區(qū)段(胃的緊遠端)。將組織置于含氧的TC199培養(yǎng)基中，并使用TC199培養(yǎng)基從遠離胃的最遠端小心地清洗出腸中的任何食物殘渣。制備2個十二指腸區(qū)段，每個長度為2.5cm，近側(cè)區(qū)段(緊在胃之后)和遠側(cè)區(qū)段(緊在膽管入口之后)。通過結(jié)扎拉緊而將所述區(qū)段小心附著至連接到貯液器的2個玻璃管的開放末端。這允許用分開的溶液來浸浴所分離的粘膜的腔(粘膜)側(cè)和血液側(cè)(漿膜)表面。每個粘膜室中玻璃棒末端之間的間隙為12mm。設(shè)備的圖解表示類似于在來自Heylings1991(同上)的圖1的上面部分中顯示的那種。將附著有粘膜的室用含氧的T199培養(yǎng)基漂洗幾次以去除在組織的腔側(cè)上的過量粘液。腔(粘膜)側(cè)裝滿包含20mg甘露醇/ml的4mlTC199培養(yǎng)基(TC199-M),并檢查粘膜是否滲漏。將粘膜室浸入裝滿40mlTC199培養(yǎng)基(漿膜側(cè)溶液)的外部杯狀玻璃容器中，所述玻璃容器充入95%02:5%C02氣體。安放好所述室以避免所述兩種浸浴溶液之間的流體靜力壓梯度。所述兩種溶液通過連接至外部泵的水套而維持在37±o.ix:。IO分鐘的預(yù)孵育期后，取出粘膜室并用T199培養(yǎng)基沖洗以去除任何粘液累積物，最后將腔側(cè)裝滿包含濃度為5x105dpm/ml的"C-甘露醇(胃腸道吸收很差的非電解質(zhì))的4mlTC199-M，并放回玻璃室。為了測量所分離的十二指腸粘膜對甘露醇的滲透性，在將其加入粘膜側(cè)后，在10、20、30、60、120、180和240分鐘時獲取一式兩份的150]Lil漿膜側(cè)溶液等分試樣。吸收的甘露醇的量通過液體閃爍計數(shù)來測定。作為陽性對照，將已知為胃腸道的局部刺激劑的百草枯(40mg百草枯離子/ml)在孵育開始后30分鐘加入粘膜室中，以便證實該模型能夠檢測粘膜損傷。在孵育開始后30分鐘時通過向粘膜室直接加入少量嚙齒類動物防治劑(融合蛋白或蛋白質(zhì)綴合物，參見例如上文實施例6-8)來加入其，并監(jiān)控甘露醇吸收的時間過程特性。將這與平行進行的大鼠十二指腸近側(cè)和遠側(cè)區(qū)段的同期陰性對照進行比較。上文描述的方法使用十二指腸組織，然而，胃腸道的其他區(qū)域可以代替并使用如上所述的相同程序進行測試。實施例10:蛋白質(zhì)綴合物和融合蛋白的體內(nèi)測試10.1.通過在小鼠中的口部管飼法來測試功效小鼠(總共18只，每組9只)通過管飼法用i)蛋白質(zhì)綴合物或融合蛋白(特別參見上文實施例6-8;組1的小鼠)或ii)惰性媒介物(例如聚乙二醇；組2的小鼠)經(jīng)口服給藥。動物在給藥后24、48和72小時被終止生命，在研究中自始至終定期進行臨床觀察。終止生命后，將十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸組織在福爾馬林緩沖鹽水中固定，進行加工，并包埋到蠟中和使用H&E進行染色以用于病理學(xué)評估。融合蛋白/蛋白質(zhì)綴合物以下列測試濃度進行使用(以mg化合物/kg體重給出):8mg/kg、5mg/kg和3mg/kg。權(quán)利要求1.嚙齒類動物防治劑，其包含結(jié)合在嚙齒類動物中表達的蛋白質(zhì)的細胞外表位的抗體組分。2.根據(jù)權(quán)利要求1的嚙齒類動物防治劑，其中所述嚙齒類動物防治劑殺死嚙齒類動物或阻止嚙齒類動物生育。3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的嚙齒類動物防治劑，其中所述抗體組分連接至毒性組分或避孕組分。4.根據(jù)權(quán)利要求3的嚙齒類動物防治劑，其包含融合蛋白，所述融合蛋白包含第一種蛋白質(zhì)組分和第二種蛋白質(zhì)組分，所述第一種蛋白質(zhì)組分是抗體組分，和所述第二種蛋白質(zhì)組分選自毒素、免疫原和激素。5.根據(jù)權(quán)利要求4的嚙齒類動物防治劑，其中所述第一種和第二種蛋白質(zhì)組分經(jīng)由肽連接體互相連接。6.根據(jù)權(quán)利要求5的嚙齒類動物防治劑，其中所述肽連接體包含甘氨酸和絲氨酸殘基。7.根據(jù)權(quán)利要求6的嚙齒類動物防治劑，其中所述肽連接體包含至少3個(GIy4Ser)基序。8.根據(jù)權(quán)利要求3的嚙齒類動物防治劑，其包含蛋白質(zhì)綴合物，所述蛋白質(zhì)綴合物包含化學(xué)綴合至毒性組分或避孕組分的根據(jù)權(quán)利要求1的抗體組分。9.根據(jù)權(quán)利要求3-8中任一項的嚙齒類動物防治劑，其中所述毒性組分是蛋白質(zhì)毒素。10.根據(jù)權(quán)利要求9的嚙齒類動物防治劑，其中所述毒素是a)選自組1中所列出的蛋白質(zhì)的全長蛋白質(zhì)，其中組1由破裂膜的蛋白質(zhì)、核糖基轉(zhuǎn)移酶、絲氨酸蛋白酶、鳥苷酸環(huán)化酶激活物、參與ATP酶介導(dǎo)的離子轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)、鈣調(diào)蛋白依賴性腺苷酸環(huán)化酶和核糖核酸酶組成，或是b)選自組1的蛋白質(zhì)的毒性結(jié)構(gòu)域。11.根據(jù)權(quán)利要求9的嚙齒類動物防治劑，其中所述毒素是a)全長RNA糖苷酶，或是b)RNA糖苷酶的毒性結(jié)構(gòu)域。12.根據(jù)權(quán)利要求10的嚙齒類動物防治劑，其中所述毒素是a)全長P-嘌呤硫素或選自組2中所列出的蛋白質(zhì)的全長蛋白質(zhì)，其中組2由產(chǎn)氣莢膜梭菌細胞溶素0、ot-溶血素、鞘磷脂酶、5-溶血素、粒酶B、oc毒素、Cyt毒素、白喉毒素、粒溶素、蜂毒肽、穿孔素、霍亂腸毒素、熱穩(wěn)定腸毒素、海葵毒素、李斯特菌溶胞素、VIP2、附屬腸毒素、氣單胞菌溶素、BinA、BinB、大腸桿菌素El、溶血素A、CTXIV、蓖麻毒素、變形蟲通道蛋白、ElTor溶血素、美人魚弧菌溶血素、肺炎球菌溶血素、鏈球菌溶血素0、神奈川毒素、鉤端螺旋體溶血素、Cry毒素、炭疽毒素、假單胞菌外毒素A、芽孢桿菌RNA酶和VIP3,或是b)b-噤呤硫素的毒性結(jié)構(gòu)域或選自組2的蛋白質(zhì)的毒性結(jié)構(gòu)域。13.根據(jù)權(quán)利要求11的嚙齒類動物防治劑，其中所述毒素是白樹毒蛋白。14，根據(jù)權(quán)利要求3-8中任一項的嚙齒類動物防治劑，其中所述避孕組分是能夠引發(fā)針對卵子或精子特異性抗原的應(yīng)答的免疫原。15.根據(jù)權(quán)利要求3-8中任一項的嚙齒類動物防治劑，其中所述避孕組分是生殖激素。16.根據(jù)權(quán)利要求15的嚙齒類動物防治劑，其中所述生殖激素是促性腺激素釋放激素。17.根據(jù)權(quán)利要求8的嚙齒類動物防治劑，其中所述毒性組分是選自下列的毒性化合物秋水仙素；多柔比星；加利車霉素；非類固醇抗炎藥(NSAID)化合物；松胞菌素；抗凝劑；麥角鈣化固醇；溴鼠胺；氟鼠啶；磷化鋅；紅海蔥糖苷；(單)氟乙酸鈉；氟乙酰胺；ot氯醛糖；硫酸鉈。18.根據(jù)權(quán)利要求17的嚙齒類動物防治劑，其中所述抗凝劑選自溴鼠靈、鼠得克、溴敵隆、氟鼠靈、噻鼠靈、羥基香豆素類和茚滿二酮類。19.根據(jù)權(quán)利要求8的嚙齒類動物防治劑，其中所述避孕組分是激素或激素樣化合物。20.根據(jù)權(quán)利要求19的嚙齒類動物防治劑，其中所述激素樣化合物是diazacon。21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的嚙齒類動物防治劑，其中所述抗體組分所結(jié)合的蛋白質(zhì)是在嚙齒類動物胃腸上皮中表達的蛋白質(zhì)。22.根據(jù)權(quán)利要求21的嚙齒類動物防治劑，其中所述蛋白質(zhì)選自大鼠PEPTl、大鼠CD155、大鼠GTR2、大鼠CFTR、大鼠CNT2、大鼠CATB(0+)、大鼠MDR1、小鼠MDR1、大鼠蔗糖酶-異麥芽糖酶、小鼠GLUT7、大鼠GTR5、大鼠Npt2A、大鼠0AT-B、大鼠ASBT、大鼠CAT1、大鼠0ATP3、大鼠ABCG8、大鼠GTR8、大鼠MRP1、大鼠CNT1、大鼠UT-B、大鼠DRA1、小鼠ENT1和大鼠ENT1。23.根據(jù)權(quán)利要求21的嚙齒類動物防治劑，其中所述蛋白質(zhì)選自大鼠CATB(0+)、大鼠GCC、大鼠PLB、大鼠LPH、小鼠LPH、大鼠AMPN、大鼠MCDL、大鼠SCAB、大鼠KCV2。24.根據(jù)權(quán)利要求22的嚙齒類動物防治劑，其中所述細胞外表位由選自SEQIDNO:1-26的氨基酸序列提供。25.根據(jù)權(quán)利要求24的嚙齒類動物防治劑，其中所述細胞外表位由選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5的氨基酸序列提供。26.根據(jù)權(quán)利要求23的嚙齒類動物防治劑，其中所述細胞外表位由選自SEQIDNO:27-36的氨基酸序列提供。27.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的嚙齒類動物防治劑，其中所述抗體組分是抗體或其抗原結(jié)合片段。28.根據(jù)權(quán)利要求27的嚙齒類動物防治劑，其中所述抗體是多克隆的。29.根據(jù)權(quán)利要求27的嚙齒類動物防治劑，其中所述抗體是單克隆的。30.根據(jù)權(quán)利要求27-29中任一項的嚙齒類動物防治劑，其中所述抗體是a)包括輕鏈和重鏈的免疫球蛋白，或b)單鏈抗體。31.根據(jù)權(quán)利要求30的嚙齒類動物防治劑，其中所述單鏈抗體是scF"v。32.根據(jù)權(quán)利要求30的嚙齒類動物防治劑，其中所述單鏈抗體缺乏輕鏈。33.根據(jù)權(quán)利要求32的嚙齒類動物防治劑，其中所述單鏈抗體來源于駱駝科或軟骨魚綱。34.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的嚙齒類動物防治劑，其中所述抗體組分選自免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白重鏈、Vh結(jié)枸域、Vl結(jié)枸域、Fv、Fab、di-Fab、Fab'、F(ab02、VHH結(jié)構(gòu)域、IgNARV結(jié)構(gòu)域和CDR。35.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的嚙齒類動物防治劑，其中所述抗體組分是經(jīng)二硫鍵穩(wěn)定的。36.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的嚙齒類動物防治劑，其中所述抗體組分與嚙齒類動物蛋白質(zhì)結(jié)合的親和力大于與來自至少一種非靶標(biāo)動物的同源蛋白質(zhì)結(jié)合的親和力。37.根據(jù)權(quán)利要求36的嚙齒類動物防治劑，其中所述非靶標(biāo)動物選自人、鳥、伴侶動物、家畜和不是有害動物的野生動物。38.根據(jù)權(quán)利要求37的嚙齒類動物防治劑，其中所述非靶標(biāo)動物是人。39.根據(jù)權(quán)利要求36-38中任一項的嚙齒類動物防治劑，其中所述抗體組分顯示出與嚙齒類動物蛋白質(zhì)的細胞外表位的可替換的結(jié)合，但不顯示出與下列物質(zhì)的可替換的結(jié)合i)來自非靶標(biāo)動物的同源蛋白質(zhì)，或；ii)來自非靶標(biāo)動物的同源蛋白質(zhì)的相應(yīng)表位。40.根據(jù)權(quán)利要求39的嚙齒類動物防治劑，其中所述嚙齒類動物蛋白質(zhì)的細胞外表位由在權(quán)利要求48中所定義的嚙齒類動物特異性肽表位所代表。41.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的嚙齒類動物防治劑，其中所述在嚙齒類動物中表達的蛋白質(zhì)是必需蛋白質(zhì)。42.根據(jù)權(quán)利要求41的嚙齒類動物防治劑，其中所述必需蛋白質(zhì)在嚙齒類動物的胃腸上皮中表達。43.嚙齒類動物防治劑，其包含連接至蛋白質(zhì)毒素的抗體組分，其中所述抗體組分結(jié)合在嚙齒類動物中表達的蛋白質(zhì)的細胞外表位，和其中所述抗體組分與所述嚙齒類動物蛋白質(zhì)的細胞外表位的結(jié)合親和力大于所述抗體組分與來自非靶標(biāo)動物的同源蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力。44.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的嚙齒類動物防治劑，其以進一步包括至少一種添加劑的組合物形式。45.根據(jù)權(quán)利要求44的嚙齒類動物防治劑，其中至少一種添加劑是選自下列的嚙齒類動物防治劑根據(jù)權(quán)利要求1-44中任一項的嚙齒類動物防治劑、第一代抗凝劑和第二代抗凝劑。46.根據(jù)權(quán)利要求44或45的嚙齒類動物防治劑，其中至少一種添加劑具有使得所述組合物對于嚙齒類動物來說可口的功能。47，殺死嚙齒類動物的方法，其包括將根據(jù)權(quán)利要求l-3中任一項的嚙齒類動物防治劑置于嚙齒類動物經(jīng)常出現(xiàn)的區(qū)域，從而使得在所述嚙齒類動物防治劑被所述嚙齒類動物攝食后，所述嚙齒類動物被殺死。48.阻止嚙齒類動物生育的方法，其包括將根據(jù)權(quán)利要求l-3中任一項的嚙齒類動物防治劑置于嚙齒類動物經(jīng)常出現(xiàn)的區(qū)域，從而使得在所述嚙齒類動物防治劑被所述嚙齒類動物攝食后，所述嚙齒類動物的生殖能力被抑制。49.嚙齒類動物特異性肽表位(RSPE),其由在嚙齒類動物中表達的蛋白質(zhì)的寡肽片段組成，其中所述寡肽片段序列代表細胞外連續(xù)肽表位，所述細胞外連續(xù)肽表位與來自非靶標(biāo)動物的同源蛋白質(zhì)的相應(yīng)線性肽序列具有60%或更低的同一性百分比。50.抗體或其抗原結(jié)合片段，其結(jié)合權(quán)利要求48的RSPE。51.根據(jù)權(quán)利要求50的抗體或其抗原結(jié)合片段在制備根據(jù)權(quán)利要求1-46中任一項的嚙齒類動物防治劑中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及新型嚙齒類動物防治劑，其包含結(jié)合在嚙齒類動物中表達的蛋白質(zhì)的抗體或其抗原結(jié)合片段，特別是結(jié)合在嚙齒類動物胃腸(GI)道中表達的蛋白質(zhì)的抗體或抗原結(jié)合片段，以及涉及制備此類新型嚙齒類動物防治劑的方法。本發(fā)明進一步擴展至在嚙齒類動物防治中使用的新型抗體和抗原結(jié)合片段，以及涉及通過使用此類抗體、抗原結(jié)合片段和新型嚙齒類動物防治劑來防治嚙齒類動物的方法。文檔編號C07K16/46GK101163720SQ200680013523公開日2008年4月16日申請日期2006年2月17日優(yōu)先權(quán)日2005年3月11日發(fā)明者A·J·丁斯莫爾,C·J·A·薩德勒,F·G·P·厄爾利,J·L·文森特,P·J·凱利申請人:辛根塔有限公司