專利名稱：：降解除草劑的酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
："本發(fā)明涉及新型酶，其能降解含胺除草劑如草甘膦和草胺膦，以及編碼這些酶的多核苷酸。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生這些酶的轉(zhuǎn)基因植物，其對(duì)于含胺除草劑活性具有抗性。另外，本發(fā)明提供了依賴于這種新型酶的活性的生物修復(fù)方法(bioremediation)。
背景技術(shù)：
：有機(jī)膦酸鹽類化合物(Organophosphonates)特征在于賦予對(duì)于化學(xué)、熱和酶降解具有相對(duì)抗性的穩(wěn)定的碳-磷(C-P)鍵。天然的有機(jī)膦酸鹽類化合物在磷的生物地球化學(xué)循環(huán)中起重要作用，合成的有機(jī)膦酸鹽類化合物在化學(xué)工業(yè)中具有各種各樣的用途，最主要是作為除草劑如草甘膦(7V-膦酰甲基甘氨酸)和草胺膦(BastaTM)。草甘膦(N-膦酰甲基甘氨酸)是膦酸酯除草劑，其抑制5-烯醇式丙酮-3-莽草酸(磷酸莽草酸)合酶(EPSPS)，該酶是莽草酸途徑的一個(gè)成分。植物利用莽草酸途徑產(chǎn)生必需的芳族氨基酸和維生素，且草甘膦通過(guò)EPSPS特異性破壞磷酸烯醇丙酮酸和3-莽草酸向5-烯醇式丙酮-3-莽草酸的轉(zhuǎn)變。一旦膦酸酯進(jìn)入土壤，則主要是微生物活性導(dǎo)致其去除，微生物活性分成兩個(gè)主要途徑由調(diào)節(jié)子調(diào)節(jié)的磷酸饑餓依賴性機(jī)制，由此微生物利用膦酸酯作為唯一的磷源(Wanner,1994)，磷酸鹽非依賴性機(jī)制，由此細(xì)菌利用膦酸酯作為唯一的碳、氮和磷源(Temanetal.,1998a;Ternanetal.,1998b;McGrathetal.,1998)。也己經(jīng)描述了能利用膦酸酯(包括草甘膦)作為磷酸鹽唯一來(lái)源的真菌分離株，推測(cè)可能涉及幾種不同途徑(可能與在細(xì)菌中的情況相似)(Kryskol-Lupickaetal.，1997)。檢測(cè)的真菌分離株均產(chǎn)生作為草甘膦降解的主要產(chǎn)物的AMPA，提示與細(xì)菌GOX(WO92/00377)相似的真菌酶的參與作用。對(duì)草甘膦除草劑的酶降解或修飾已經(jīng)產(chǎn)生興趣，這是由于關(guān)于分子在環(huán)境中命運(yùn)的考慮以及作為對(duì)用于工程化除草劑耐受植物的系統(tǒng)的額外補(bǔ)充，可通過(guò)增加植物中的EPSPS水平或者用賦予對(duì)草甘膦的耐受性的修飾的EPSPS置換天然EPSPS而進(jìn)行。已發(fā)現(xiàn)土壤中的草甘膦降解是迅速而廣泛的，氨基甲基膦酸酯(AMPA)被鑒別為最常見(jiàn)產(chǎn)物(Wackett等1987)，并且能降解草甘膦的幾種單細(xì)菌培養(yǎng)物已被描述(綜述見(jiàn)Maliketal.，1989)。因此鑒定了在純細(xì)菌培養(yǎng)物中草甘膦代謝的兩種途徑(圖1)。已經(jīng)針對(duì)黃桿菌(BalthazorandHallas,1986)、假單胞菌(Jacob等，1988)和JW/zraZ^cferWracjw2ew(PipkeandAmrhein,1988)描述了代謝為AMPA的途徑，而草甘膦通過(guò)p/zo調(diào)節(jié)的C-P裂合酶系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)榧“彼岷蜔o(wú)機(jī)磷酸鹽(Pi)的途徑已經(jīng)針對(duì)假單胞菌(ShinabargerandBraymer，1986;KishoreandJacob,1987)、產(chǎn)堿菌菌株GL,鏈霉菌(Objoskaetal.，1999)和節(jié)桿菌(節(jié)桿菌)(Pipkeetal.,1988)描述，且針對(duì)嗜鹽菌VHl(Hayesetal.，2000)和苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)1021(Liuetal.,1991)進(jìn)行了推測(cè)。Yakoleva等(1998)首先從大腸桿菌中分離并表達(dá)了p/w操縱子，其編碼參與磷酸鹽依賴性C-P裂合酶活性的所有基因。White和Metcalf(2004)隨后描述了來(lái)自施氏假單胞菌(尸"Wcw20^wWMtem;j的兩種不同的操縱子-其一是大腸桿菌/^w操縱子的同系物，另一是編碼參與亞磷酸鹽代謝的次磷酸鹽-2-酮戊二酸加雙氧酶的/z/x操縱子。然而，這些C-P裂合酶系統(tǒng)均不能裂解草甘膦(WhiteandMetcalf,2004)，與McGrath等(1995)所述的底物特異性膦酰乙酸(phosphonoacetate)水解酶相似。草甘膦耐受性也可以通過(guò)使用草甘膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(GAT)對(duì)草甘膦進(jìn)行N-乙酰化而賦予，如Castle及其同事(Castleetal.，2004)所揭示，他們也利用三種不同的基因的DNA改組技術(shù)，使GAT的酶效率改良了四個(gè)數(shù)量級(jí)(Castleetal.,2004;Siehletal.，2005)。利用這種微生物除草劑-代謝或修飾酶的野草控制時(shí)機(jī)已經(jīng)在Padgette等(1996)和Vasil(1996)中詳細(xì)描述。目前可用于降解草甘膦、特別是當(dāng)其在植物中表達(dá)時(shí)的酶不具有特別高的活性。因此，需要鑒別可用于降解除草劑如草甘膦的進(jìn)一步的酶。發(fā)明概述本發(fā)明利用先前未知的草甘膦代謝機(jī)制鑒別細(xì)菌、另外，本發(fā)明人己經(jīng)分離且鑒定了這種細(xì)菌的新型草甘膦-降解基因-酶系統(tǒng)。一方面，本發(fā)明提供了基本上純化的多肽，其降解草甘膦產(chǎn)生甘氨酸。9另一方面，本發(fā)明提供了基本上純化的多肽，其裂解草甘膦的膦酰甲基C-3碳-氮鍵。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽包含單氨基酸鏈。因此，所述多肽不是多酶復(fù)合物的一部分，當(dāng)使用草甘膦作為底物時(shí)需要多個(gè)反應(yīng)以產(chǎn)生甘氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽裂解草甘膦產(chǎn)生甘氨酸和氧代膦酸(oxophosphonicacid)(或其離子形式)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽是可溶的。因此，所述多肽不是膜結(jié)合的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，草甘膦的裂解基本上不產(chǎn)生乙醛酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，草甘膦的裂解基本上不產(chǎn)生肌氨酸。再一方面，本發(fā)明提供了基本上純化的多肽，其具有比GOX(SEQIDNO:3)高的裂解草甘膦的效率。再一方面，本發(fā)明提供了基本上純化的多肽，其具有大于550pmol/min/mg的裂解草甘膦的比活性。優(yōu)選地，所述比活性大于600|imol/min/mg、更優(yōu)選大于700)amol/min/mg，特另U優(yōu)選高于5,000)umol/min/mg。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽的比活性如實(shí)施例3所述確定。再一方面，本發(fā)明提供了基本上純化的多肽，其包含具有選自下組的氨基酸序列i)SEQIDNO:l，及ii)與i)至少25%相同的氨基酸序列，其中所述多肽裂解含胺除草劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含SEQIDNO:8或SEQIDNO:9所示序列。含胺除草劑的例子包括但非限于草甘膦、草胺膦、雙丙氨酰膦(bilanafos)和草甘二膦(glyphosine)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述含胺除草劑是草甘膦或草胺膦。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可以自節(jié)桿菌菌種中純化。優(yōu)選地，所述節(jié)桿菌菌種是節(jié)桿菌TBD。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽與至少一種其它多肽融合。所述至少一種其它多肽可例如是增強(qiáng)本發(fā)明的多肽的穩(wěn)定性的多肽，或者有助于融合蛋白純化的多肽。再一方面，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含具有選自下組的序列的核苷酸i)SEQIDNO:2，ii)編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列，iii)與i)至少25。/。相同的核苷酸序列，iv)在低嚴(yán)格條件下與i)雜交的核苷酸序列，v)與i)-iv)互補(bǔ)的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述多核苷酸編碼裂解含胺除草劑的多肽。更優(yōu)選地，所述含胺除草劑是草甘膦或草胺膦。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸編碼包含SEQIDN0:8或SEQIDN0:9所示序列的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含在中等嚴(yán)格條件下與i)雜交的序列。更優(yōu)選地，所述多核苷酸包含在嚴(yán)格雜交條件下與i)雜交的序列。另一方面，本發(fā)明提供了包含在植物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子的重組多核苷酸，所述的啟動(dòng)子與編碼本發(fā)明多肽的結(jié)構(gòu)DNA序列可操縱地連接，與在所述細(xì)胞中起作用的3'聚腺苷酸化序列可操縱地連接，其中所述啟動(dòng)子與所述結(jié)構(gòu)DNA序列異源，且能表達(dá)所述結(jié)構(gòu)DNA序列以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)于含胺除草劑的抗性。再一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明多核苷酸的載體。優(yōu)選地，所述多核苷酸與啟動(dòng)子可操縱地連接。另一方面，本發(fā)明提供了包含至少一種本發(fā)明多核苷酸和/或至少一種本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是任何類型細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明提供了裂解草甘膦并產(chǎn)生甘氨酸的重組細(xì)胞。優(yōu)選地，所述細(xì)胞包含本發(fā)明的多核苷酸，其中所述細(xì)胞非天然包含所述多核苷酸。ii另一方面，本發(fā)明提供了包含導(dǎo)入的多肽的重組細(xì)胞，所述多肽裂解草甘膦產(chǎn)生甘氨酸。再一方面，本發(fā)明提供了包含導(dǎo)入的多肽的重組細(xì)胞，所述多肽裂解草甘膦的膦酰甲基C-3碳-氮鍵。優(yōu)選地所述多肽是由所述細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸而產(chǎn)生的。另一方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的多肽的方法，所述方法包括在使得編碼多肽的多核苷酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)編碼所述多肽的本發(fā)明的宿主細(xì)胞或者編碼所述多肽的本發(fā)明的載體，以及回收表達(dá)的多肽。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的多肽。再一方面，本發(fā)明提供了分離的抗體，其特異性結(jié)合本發(fā)朋的多肽。再一方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含至少一種本發(fā)明的多肽、至少一種本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的重組細(xì)胞和/或本發(fā)明的抗體，及一或多種可接受的載體。再一方面，本發(fā)明提供了裂解含胺除草劑的組合物，所述組合物包含至少一種本發(fā)明的多肽及一或多種可接受的載體。優(yōu)選地，所述組合物進(jìn)一步包含金屬離子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述金屬離子是二價(jià)金屬離子。更優(yōu)選地，所述金屬離子選自Mg^、Co2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+，及其組合。還更優(yōu)選地，所述金屬離子選自Mg2+、Zn2+、Co2+，及其組合。本發(fā)明的多肽可用作選擇標(biāo)記以檢測(cè)重組細(xì)胞。因此，本發(fā)明還提供了本發(fā)明多肽、或者編碼所述多肽的多核苷酸作為選擇標(biāo)記在檢測(cè)和/或選擇重組細(xì)胞中的應(yīng)用。再一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)重組細(xì)胞的方法，所述方法包括i)將細(xì)胞或細(xì)胞群與編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸在使得所述細(xì)胞攝取所述多核苷酸的條件下接觸，及ii)通過(guò)將得自步驟i)的細(xì)胞或其后代暴露于含胺除草劑而選擇重組細(xì)胞。優(yōu)選地，所述多核苷酸包含編碼本發(fā)明多肽的第一個(gè)開(kāi)放讀框及不編碼本發(fā)明多肽的第二個(gè)開(kāi)放讀框。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二個(gè)開(kāi)放讀框編碼多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二個(gè)開(kāi)放讀框編碼不翻譯的多核苷酸。在這兩種情況中，優(yōu)選所述第二個(gè)開(kāi)放讀框與合適的啟動(dòng)子可操縱地連接。優(yōu)選地，不翻譯的多核苷酸編碼催化性核酸、dsRNA分子或反義分子。合適的細(xì)胞的例子包括但非限于植物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。優(yōu)選地，所述含胺除草劑是草甘膦或草胺膦。再一方面，本發(fā)明提供了裂解含胺除草劑的方法，所述方法包括將含胺除草劑與本發(fā)明的多肽接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是由本發(fā)明的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的。優(yōu)選地，所述含胺除草劑是草甘膦或草胺膦。本發(fā)明提供的多肽可以在植物中產(chǎn)生，以在宿主植物暴露于含胺除草劑如草甘膦時(shí)增強(qiáng)其生長(zhǎng)能力。因此，本發(fā)明另一方面提供了包含外源多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物，所述多核苷酸編碼至少一種本發(fā)明的多肽。優(yōu)選地，所述含胺除草劑是草甘膦或草胺膦。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽至少在轉(zhuǎn)基因植物的氣生部分中產(chǎn)生。優(yōu)選地，所述多核苷酸被穩(wěn)定摻入植物的基因組中。本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生對(duì)于含胺除草劑的抗性增強(qiáng)的植物的方法，所述方法包括如下步驟a)向植物細(xì)胞的基因組中插入多核苷酸，所述多核苷酸包含與其可操縱地連接的在植物細(xì)胞中起作用導(dǎo)致RNA序列產(chǎn)生的啟動(dòng)子、與其可操縱地連接的導(dǎo)致編碼本發(fā)明多肽的RNA序列產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)DNA序列、在植物細(xì)胞中起作用導(dǎo)致在RNA序列的3'末端添加聚腺苷酸核苷酸的3'非翻譯區(qū)；其中所述啟動(dòng)子與所述結(jié)構(gòu)DNA是異源的且適于導(dǎo)致所述多肽足夠的表達(dá)，以增強(qiáng)用所述DNA分子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的含胺除草劑抗性；b)獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；及c)從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的對(duì)含胺除草劑抗性增強(qiáng)的植物。再一方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。另一方面，本發(fā)明提供了裂解樣品中含胺除草劑的方法，所述方法包括將樣品暴露于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選地，所述樣品是土壤。這種土壤可以在田野中。另一方面，本發(fā)明提供了包含外源多核苷酸的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，所述多核苷酸編碼至少一種本發(fā)明的多肽。再一方面，本發(fā)明提供了分離的菌株節(jié)桿菌，其于2006年4月11日保藏于澳大利亞全國(guó)測(cè)量學(xué)院(NationalMeasurementInstitute),保藏號(hào)為V06/010960。再一方面，本發(fā)明提供了裂解含胺除草劑的組合物，該組合物包含本發(fā)明的菌株及一或多種可接受的載體。再一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明多肽的本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的重組細(xì)胞、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物、本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或者本發(fā)明的菌株的提取物。再一方面，本發(fā)明提供了裂解含胺除草劑的組合物，所述組合物包含本發(fā)明的提取物及一或多種可接受的載體。再一方面，本發(fā)明提供了裂解含胺除草劑的方法，所述方法包括將含胺除草劑暴露于本發(fā)明的菌株和/或本發(fā)明的提取物。本發(fā)明還提供了分離的細(xì)菌，其產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。優(yōu)選地，所述細(xì)菌是v4w/zra6ac^"s/。再一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生本發(fā)明多肽的分離的天然存在的細(xì)菌在裂解含胺除草劑中的應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明提供了裂解含胺除草劑的聚合的海綿或泡沫，所述泡沫或海綿包含固定于聚合的多孔支持物上的本發(fā)明的多肽。再一方面，本發(fā)明提供了裂解含胺除草劑的方法，所述方法包括將含胺除草劑暴露于本發(fā)明的海綿或泡沫。另一方面，本發(fā)明提供了從本發(fā)明植物中產(chǎn)生的產(chǎn)物。產(chǎn)物的例子包括但非限于淀粉、油、植物纖維如棉花、麥芽和面粉。再一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明植物的部分。例子包括但非限于種子、果實(shí)和堅(jiān)果。本發(fā)明的多肽可以被突變，根據(jù)改變的活性如增強(qiáng)的酶活性篩選所得突變體。這種突變可以使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)進(jìn)行，包括但非限于體外誘變和DNA改組。因此，本發(fā)明另一方面提供了產(chǎn)生裂解含胺除草劑的能力增強(qiáng)的多肽的方法，所述方法包括(i)改變本發(fā)明的第一多肽的一或多個(gè)氨基酸，(ii)確定得自步驟(i)的改變的多肽的裂解含胺除草劑的能力，及(iii)選擇當(dāng)與第一多肽對(duì)比時(shí)裂解含胺除草劑的能力增強(qiáng)的改變的多肽。本發(fā)明還提供了通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的多肽。再一方面，本發(fā)明提供了篩選能裂解含胺除草劑的微生物的方法，所述方法包括i)在存在含胺除草劑作為唯一氮源的條件下培養(yǎng)候選微生物，及ii)確定所述微生物是否能生長(zhǎng)和/或分裂。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物是細(xì)菌、真菌或原生動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微生物是重組微生物。另外，優(yōu)選篩選重組微生物，其中所述重組微生物包含多個(gè)不同的外源DNA分子。這種外源DNA分子的例子包括質(zhì)?；蛘沉；蚪MDNA文庫(kù)。優(yōu)選地，所述含胺除草劑是草甘膦。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明方法分離的微生物。再一方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含至少一種本發(fā)明多肽、至少一種本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的重組細(xì)胞本發(fā)明的抗體、本發(fā)明的組合物、至少一種本發(fā)明的菌株、至少一種本發(fā)明的提取物、至少一種本發(fā)明的細(xì)菌、至少一種本發(fā)明的聚合的海綿或泡沫、至少一種本發(fā)明的產(chǎn)物，和/或至少一種本發(fā)明植物的部分。顯然，本發(fā)明一方面優(yōu)選的特征和特性可適用于本發(fā)明的許多其它方面。在本說(shuō)明書(shū)中，"包含"或"包括"應(yīng)理解為包含指定的要素、整數(shù)和步驟或者成組的要素、整數(shù)和步驟，但是不排除任何其它要素、整數(shù)和步驟或者成組的要素、整數(shù)和步驟。本發(fā)明在下文通過(guò)非限制性實(shí)施例及參考附圖加以描述。附圖簡(jiǎn)述圖l.草甘膦代謝途徑。1.多酶膜結(jié)合的C-P裂合酶系統(tǒng)對(duì)C-P鍵的裂解。II.C2-N鍵的裂解產(chǎn)生氨甲基膦酸(AMPA)和乙醛酸。III.GloxA裂解C3-N鍵產(chǎn)生甘氨酸和氧膦酸的推定機(jī)制。15圖2.草甘膦作為底物由GloxA和GOX催化的推定反應(yīng)的比較(A)，以及得自這些酶反應(yīng)的HPLC反應(yīng)模式圖(B)。圖3.與編碼GOX或GloxA的質(zhì)粒DNA的DNA:DNA雜交。將消化的質(zhì)粒和粘粒DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)移至HybondN+膜，然后用gox基因的32p-放射標(biāo)記的PCR產(chǎn)物探査。圖4.部分純化的GloxA和GOX對(duì)于草甘膦和亞氨基二乙酸的活性對(duì)比。圖5.GloxA的原位(/"p/""to)表達(dá)賦予是正常劑量五倍的草甘膦耐受性。為了獲得耐受值(ToleranceScore),在應(yīng)用除草劑后第8天目測(cè)評(píng)定植物的葉健康狀況、植物半徑(plantradius)和開(kāi)花情況。在相同系統(tǒng)下未處理的對(duì)照理想的健康分值為7-8。序列表說(shuō)明SEQIDNO:l-GloxA的氨基酸序列。SEQIDNO:2-編碼GloxA的核苷酸序列。SEQIDNO:3-GOX的氨基酸序列。SEQIDNO:4和5-寡核苷酸引物。SEQIDNO:6-為在植物中表達(dá)而優(yōu)化的GloxA編碼序列，包括在5'和3'末端添加的克隆位點(diǎn)以及緊鄰起始密碼子的AACA。SEQIDNO:7-為在大腸桿菌中表達(dá)而優(yōu)化的GloxA編碼序列。SEQIDNO:8—來(lái)自擴(kuò)展短桿菌(Brevibacteriumlinens)BL2的BOBL。SEQIDNO:9—來(lái)自金黃節(jié)桿菌(^W/zo6a"eraw^cera」TC1的GloxD。發(fā)明詳述通用技術(shù)除非特別指出，本文所用所有技術(shù)和學(xué)術(shù)術(shù)語(yǔ)均具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)的含義(例如細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域)。除非特別指出，本發(fā)明中利用的重組蛋白質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫學(xué)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)程序。這些技術(shù)在例如如下所述的文獻(xiàn)中描述禾口闡述J.Perbal,APracticalGuidetoMolecularCloning,JohnWileyandSons(1984)、J.Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourLaboratoryPress(1989)、T.A.Brown(editor),EssentialMolecularBiology:APracticalApproach,Volumes1and2,IRLPress(1991)、D.M.GloverandB.D.Hames(editors),DNACloning:APracticalApproach,Volumes1-4,IRLPress(1995and1996)、F.M.Ausubel等(editors)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePub.AssociatesandWiley-Ijiterscience(1988，includingallupdatesuntilpresent)、EdHarlowandDavidLane(editors)Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourLaboratory,(1988)、J.E.Coligan等(editors)CurrentProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons(包括到目前為止的所有更新)，所述文獻(xiàn)在此并入本文作參考。含胺除草劑含胺除草劑包括當(dāng)外部應(yīng)用于植物時(shí)對(duì)所述植物具有有害作用的具有氨基的任何分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述含胺除草劑是有機(jī)膦酸酯(organophosphonate)。含胺除草劑的例子包括但非限于草甘膦、草胺膦、雙丙氨膦(bilanafos)和草甘二膦(glyphosine)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"草甘膦"通常是指親代除草劑N-膦酰甲基甘氨酸(也稱作草甘膦酸(glyphosateacid))、其離子形式、其鹽或酯形式，或者在植物組織中轉(zhuǎn)變?yōu)镹-膦酰甲基甘氨酸的化合物，或者另外提供離子形式N-膦酰甲基甘氨酸的化合物(也稱作草甘膦離子(glyphosateion))。草甘膦鹽包括但非限于堿金屬鹽，例如鈉鹽和鉀鹽；銨鹽；Cl16烷基銨，例如二甲基銨和異丙基銨鹽；Cw6烷醇銨，例如甲醇銨鹽；Cw6烷基锍，例如三甲基锍鹽；上述鹽的混合物等。所述草甘膦酸分子具有pKa值不同的三個(gè)酸位點(diǎn)；因此可以使用一、二和三堿基鹽，或者其任何混合物，或者任何以中間水平中和的鹽。草甘膦是Roundup(MonsantoCo.)的活性成分。商業(yè)草甘膦配方的例子包括但非限于由Monsanto公司以ROUNDUPTM、ROUNDUPULTRA、ROUNDUPULTRAMAX、ROUNDUPWEATHERMAX、ROUNDUPCT、ROUNDUPEXTRA、ROUNDUPSBIACTIVE、ROUNDUPBIOFORCE、RODEO、POLARIS、SPARK和ACCORD銷售的那些除草劑，所有這些均含有作為其異丙基銨鹽的草甘膦；由Monsanto公司以ROUNDUPDRY和RIVAL銷售的那些除草劑，其含有作為其銨鹽的草甘膦；由Monsanto公司以ROUNDUPGEOFORCE銷售的除草劑，其含有作為其鈉鹽的草甘膦；及由SyngentaCropProtection以TOUCHDOWN銷售的除草劑，其含有作為其三甲基锍鹽的草甘膦。草甘膦由于對(duì)于莽草酸途徑的抑制作用而是植物性毒素，所述途徑提供了合成芳族氨基酸的前體。草甘膦抑制在植物中發(fā)現(xiàn)的5-烯醇式丙酮-3-膦酸莽草酸合酶(EPSPS)。如本文所用，"草胺膦"是指2-氨基4-(羥甲基氧膦基)丁酸及其離子形式、酯和鹽，特別是銨鹽。草胺膦是非選擇性系統(tǒng)除草劑，是BASTATM、RELYTM、FINALE、CHALLENGE和LIBERTY的活性成分。草胺膦干擾谷氨酰胺的生物合成途徑及氨解毒作用。如本文所用，"雙丙氨膦"是指4-羥基(甲基)膦?；?L-高丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酸(alanin)及其離子形式、酯和鹽。如本文所用，"草甘二膦"是指N,N-二(膦酰甲基)甘氨酸及其離子形式、酯和鹽。多肽"基本上純化的多肽"或者"純化的多肽"是指從在天然狀態(tài)與其相關(guān)聯(lián)的一或多種脂質(zhì)、核酸、其它多肽或其它污染分子中分離的多肽。優(yōu)選基本上純化的多肽至少60%、更優(yōu)選至少75%、及更優(yōu)選至少90%無(wú)與其天然相關(guān)的其它成分。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到所述純化的多肽可以是重組產(chǎn)生的多肽。術(shù)語(yǔ)"多肽"和"蛋白質(zhì)"通常可互換應(yīng)用，是指可以通過(guò)添加非氨基酸基團(tuán)修飾或者不可修飾的單多肽鏈。應(yīng)理解這種多肽鏈可以與其它多肽或蛋白質(zhì)或其它分子如輔因子締合。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"和"多肽"也包括本發(fā)明多肽的變體、突變體、修飾物、類似物和/或衍生物。本文的"可溶的多肽"不與脂質(zhì)雙層如細(xì)胞膜結(jié)合。多肽的相同性百分比％是通過(guò)GAP(NeedlemanandWunsch，1970)分析(GCG程序)確定，缺口產(chǎn)生罰分(gapcreationpenalty)=5，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)=0.3。查詢長(zhǎng)度為至少25個(gè)氨基酸，GAP分析排列對(duì)比至少25個(gè)氨基酸區(qū)域的兩個(gè)序列。更優(yōu)選地，査詢序列長(zhǎng)度為至少50個(gè)氨基酸，GAP分析排列對(duì)比至少50個(gè)氨基酸區(qū)域的兩個(gè)序列。更優(yōu)選地，查詢序列長(zhǎng)度為至少100個(gè)氨基酸，GAP分析排列對(duì)比至少I(mǎi)OO個(gè)氨基酸區(qū)域的兩個(gè)序列。甚至更優(yōu)選地，查詢序列長(zhǎng)度為至少250個(gè)氨基酸，GAP分析排列對(duì)比至少250個(gè)氨基酸區(qū)域的兩個(gè)序列。特別優(yōu)選地，GAP分析排列對(duì)比全長(zhǎng)的兩個(gè)序列。如本文所用，"生物活性"片段是本發(fā)明多肽的一部分，其保持全長(zhǎng)多肽的指定活性，即能裂解含胺除草劑、特別是草甘膦。生物活性片段可以是任何大小，只要保持指定活性即可。優(yōu)選地，生物活性片段的長(zhǎng)度為至少I(mǎi)OO、更優(yōu)選至少200、甚至更優(yōu)選至少350個(gè)氨基酸。關(guān)于指定的多肽，優(yōu)選的實(shí)施方案包含相同性百分比％高于上述的那些多肽。因此，根據(jù)最小相同性百分比％，優(yōu)選所述多肽包含與相關(guān)命名的SEQIDNO.至少40。/。，、更優(yōu)選至少45。/。、更優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少55%、更優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少91%、更優(yōu)選至少92%、更優(yōu)選至少93%、更優(yōu)選至少94%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97%、更優(yōu)選至少98°/。、更優(yōu)選至少99%、更優(yōu)選至少99.1%、更優(yōu)選至少99.2%、更優(yōu)選至少99.3%、更優(yōu)選至少99.4%、更優(yōu)選至少99.5%、更優(yōu)選至少99.6%、更優(yōu)選至少99.7%、更優(yōu)選至少99.8%，及還更優(yōu)選至少99.9%相同的氨基酸序列。本發(fā)明多肽的氨基酸序列突變體可以通過(guò)在本發(fā)明的核酸中導(dǎo)入合適的核苷酸或者通過(guò)體外合成希望的多肽而制備。這種突變體包括例如氨基酸序列內(nèi)的殘基缺失、插入或取代?？梢赃M(jìn)行缺失、插入和取代組合突變，以使得最終的構(gòu)建體多肽產(chǎn)物具有希望的特性。突變體(改變的)多肽可以使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)制備。例如，可以對(duì)本發(fā)明的多核苷酸進(jìn)行體外誘變。這種體外誘變技術(shù)包括將多核苷酸亞克隆進(jìn)合適的載體中，將該載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入"突變體"菌株如大腸桿菌五.XL-lred(Stratagene)中，使該轉(zhuǎn)化的細(xì)菌繁殖適當(dāng)數(shù)目的世代。在另一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)本發(fā)明的多肽進(jìn)行如Harayama(1998)所述的DNA改組技術(shù)。這些DNA改組技術(shù)可包括與本發(fā)明相關(guān)的基因，如細(xì)菌的其它氧化還原酶(例如編碼SEQIDN0:8的多核苷酸)。衍生自突變的/改變的DNA的產(chǎn)物可易于使用本文所述技術(shù)篩選，以確定它們是否能裂解含胺除草劑如草甘膦。19突變體中，突變位點(diǎn)的位置和突變性質(zhì)根據(jù)修飾的特性而決定。突變位點(diǎn)可以單獨(dú)或系列修飾，例如通過(guò)(l)用選擇的保守氨基酸取代，然后根據(jù)獲得的結(jié)果更徹底地選擇，(2)缺失靶殘基，或者(3)在指定位點(diǎn)鄰近處插入其它殘基。氨基酸序列缺失通常為大約l-15個(gè)殘基，更優(yōu)選大約l-10個(gè)殘基，通常為大約l-5個(gè)連續(xù)的殘基。取代突變體是在多肽分子中除去至少一個(gè)氨基酸并在這個(gè)位置插入不同的殘基。最感興趣的取代突變的位點(diǎn)包括被認(rèn)為對(duì)于其功能重要的位點(diǎn)。其它感興趣的位點(diǎn)是其中得自不同菌株或物種的特定殘基是相同的那些位點(diǎn)。這些位置可以是生物學(xué)活性重要的。這些位點(diǎn)、特別是至少三個(gè)其它相同保守的位點(diǎn)序列中的那些位點(diǎn)，優(yōu)選以相對(duì)保守的方式取代。這種保守取代示于表l，標(biāo)題為"舉例的取代"。表l:舉例的取代原始?xì)埢e例的取代Ala(A)val;leu;ile;glyArg(R)lysAsn(N)gin;hisAsp(D)gluCys(C)scrGin(Q)asn;hisGlu(E)aspGly(G)pro,alaHis(H)asn;ginHe(I)leu;val;alaLeu(L)ile;val;met;ala;pheLys(K)argMet(M)leu;phePhe(F)leu;val;alaPro(P)gly20<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>另外，如果需要，可以將非天然的氨基酸或氨基酸的化學(xué)類似物作為取代或添加導(dǎo)入本發(fā)明多肽中。這種氨基酸包括但非限于一般氨基酸的D-異構(gòu)體、2,4-二氨基丁酸、oc-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥(niǎo)氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱氨酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、p-丙氨酸、氟-氨基酸，設(shè)計(jì)的氨基酸如P-甲基氨基酸、Coc-甲基氨基酸、Noc-甲基氨基酸，及一般的氨基酸類似物。本發(fā)明范圍內(nèi)還包括在合成期間或之后不同修飾的本發(fā)明多肽，例如通過(guò)生物素?；⑵S基化、糖基化、乙?；?、磷酸化、酰胺化、通過(guò)已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)衍生化、蛋白酶解、與抗體分子或其它細(xì)胞配體連接等。這些修飾可用以增加本發(fā)明多肽的穩(wěn)定性和/或生物活性。本發(fā)明多肽可以多種方式產(chǎn)生，包括天然多肽的產(chǎn)生與回收、重組多肽的產(chǎn)生與回收，及化學(xué)合成的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明分離的多肽是通過(guò)在有效產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)能表達(dá)多肽的細(xì)胞并回收所述多肽而產(chǎn)生的。優(yōu)選的培養(yǎng)細(xì)胞是本發(fā)明的重組細(xì)胞。有效的培養(yǎng)條件包括但非限于允許多肽產(chǎn)生的有效培養(yǎng)基、生物反應(yīng)器、溫度、pH和氧條件。有效培養(yǎng)基是指在其中可以培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生本發(fā)明多肽的任何培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基通常包括具有可吸收的碳、氮和磷酸鹽來(lái)源及合適的鹽、礦物質(zhì)、金屬及其它營(yíng)養(yǎng)素如維生素的液態(tài)培養(yǎng)基。本發(fā)明的細(xì)胞可以在常規(guī)發(fā)酵生物反應(yīng)器、搖瓶、實(shí)驗(yàn)試管、微滴定器皿和培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)可以在適于重組細(xì)胞的溫度、pH和氧含量條件下進(jìn)行。這種培養(yǎng)條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。多核苷酸與寡核苷酸21包括DNA、RNA、或其組合、單鏈或雙鏈、有義或反義方向或者這兩種情況的組合、dsRNA或其它情況是指從在天然狀態(tài)中與其締合或連接的多核苷酸序列中至少部分分離的多核苷酸。優(yōu)選地，所述分離的多核苷酸至少60%、優(yōu)選至少75%、最優(yōu)選至少90%無(wú)與其天然締合的其它成分。技術(shù)人員意識(shí)到，分離的多核苷酸可以是存在于例如轉(zhuǎn)基因生物體中的外源多核苷酸，所述轉(zhuǎn)基因生物體非天然包含該多核苷酸。另外，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"與"核酸"可互換使用。多核苷酸的相同性百分比通過(guò)GAP(NeedlemanandWunsch,1970)分析(GCG程序)確定，缺口產(chǎn)生罰分=5，缺口延伸罰分=0.3。除非特別指出，則查詢序列長(zhǎng)度為至少45個(gè)核苷酸，GAP分析排列對(duì)比了至少45個(gè)核苷酸區(qū)域的兩個(gè)序列。優(yōu)選地，查詢序列長(zhǎng)度為至少150個(gè)核苷酸，GAP分析排列對(duì)比了至少150個(gè)核苷酸區(qū)域的兩個(gè)序列。更優(yōu)選地，査詢序列長(zhǎng)度為至少300個(gè)核苷酸，GAP分析排列對(duì)比了至少300個(gè)核苷酸區(qū)域的兩個(gè)序列。甚至優(yōu)選地，GAP分析排列對(duì)比了全長(zhǎng)的兩個(gè)序列。關(guān)于指定的多核苷酸，應(yīng)理解本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案涵蓋了相同性百分比高于上述的那些多核苷酸。因此，在可應(yīng)用時(shí)，根據(jù)最小相同性百分比，優(yōu)選本發(fā)明的多核苷酸包含與相關(guān)命名的SEQIDNO.具有40。/。、更優(yōu)選至少45%、更優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少55%、更優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少91%、更優(yōu)選至少92%、更優(yōu)選至少93%、更優(yōu)選至少94%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97%、更優(yōu)選至少98%、更優(yōu)選至少99%、更優(yōu)選至少99.1%、更優(yōu)選至少99.2%、更優(yōu)選至少99.3%、更優(yōu)選至少99.4%、更優(yōu)選至少99.5%、更優(yōu)選至少99.6%、更優(yōu)選至少99.7%、更優(yōu)選至少99.8%，甚至更優(yōu)選至少99.9%相同性的序列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"基因"具有其最廣泛的含義，包括脫氧核糖核苷酸，其包含結(jié)構(gòu)基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)，及包括位于5'和3'末端編碼區(qū)相鄰至少大約2kb的序列。位于編碼區(qū)的5'末端且存在于mRNA上的序列稱作5'非翻譯序列。位于編碼區(qū)3'末端或下游且存在于mRNA上的序列稱作3'非翻譯序列。術(shù)語(yǔ)"基因"涵蓋了cDNA及基因的基因組形式。術(shù)語(yǔ)"基因"包括編碼所有或部分本發(fā)明蛋白質(zhì)的合成或融合的分子及上述任一序列的互補(bǔ)核苷酸序列。如本文所用，短語(yǔ)"嚴(yán)格條件"是指在此條件下多核苷酸、探針、引物和/或寡核苷酸將與其靶序列雜交而不與其它序列雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，且在不同情況中是不同的。較長(zhǎng)的序列與較短的序列相比在較高溫度特異性雜交。通常地，嚴(yán)格條件是在指定離子濃度和pH下選擇比特異序列低大約5'C的熱解鏈點(diǎn)(Tm)。Tm是在此溫度下50%的與靶序列互補(bǔ)的探針平衡雜交靶序列的溫度。由于靶序列通常過(guò)量存在，因此在Tm，平衡狀態(tài)下50%的探針發(fā)生結(jié)合。通常地，嚴(yán)格條件是鹽濃度低于大約1.0M鈉離子，通常為大約0.01-1.0M鈉離子(或者其它鹽)，pH7.0-8.3，溫度為至少大約30。C(對(duì)于短探針、引物或寡核苷酸，例如10nt-50nt)及至少大約60。C(對(duì)于長(zhǎng)探針、引物和寡核苷酸)。嚴(yán)格條件也可以通過(guò)加入去穩(wěn)定劑如甲酰胺而實(shí)現(xiàn)。嚴(yán)格條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，可見(jiàn)于Ausubel等Ow;ra)，CurrentProtocolsInMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6以及本發(fā)明實(shí)施例所述。優(yōu)選地，所述條件是彼此至少大約65%、70%、75%、85%、90%、95%、98%或99%同源的序列保持彼此雜交。嚴(yán)格雜交條件的非限制性例子是在包含6XSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.02%BSA和500mg/ml變性的鮭精DNA的高鹽緩沖液中在65。C雜交，隨后在50。C在0.2XSSC、0.01%BSA中洗滌一或多次。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在中等嚴(yán)格條件下可以與包含SEQIDNO:2、6和/或7所示核苷酸序列的核酸分子雜交的核酸序列。中等嚴(yán)格雜交條件的非限制性例子是在55°C在6XSSC、5xDenhardt's溶液、0.5%SDS和100mg/ml變性鮭精DNA中雜交，隨后在37°C在1XSSC、0.1%SDS中洗滌一或多次?？梢允褂玫钠渌械葒?yán)格條件為本領(lǐng)域所熟知，見(jiàn)例如Ausubel等(w;ra)禾卩Kriegler,1990;GeneTransferAndExpression,ALaboratoryManual,StocktonPress,NY所述。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在低嚴(yán)格條件下可以與包含SEQIDNO:l、6和/或7所示核苷酸序列的核酸分子雜交的核酸序列。低嚴(yán)格雜交條件的非限制性例子是在40°C在35%甲酰胺、5XSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mMEDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.2%BSA、100mg/ml變性鮭精DNA、10%(wt/vol)硫酸葡聚糖中雜交，隨后在50。C在2XSSC、25mMTris-HCl(pH7.4)、5mMEDTA和0.1%SDS中洗滌一或多次?？梢允褂玫钠渌蛧?yán)格條件為本領(lǐng)域所熟知，見(jiàn)例如Ausubel等(sw/ra)禾口Kriegler,1990,GeneTransferAndExpression,ALaboratoryManual,StocktonPress,NY以及本發(fā)明實(shí)施例所述。當(dāng)與天然存在的分子對(duì)比時(shí)，本發(fā)明的多核苷酸可具有一或多個(gè)突變，所述突變是核苷酸殘基的缺失、插入或取代。突變體可以是天然存在的(即分離自天然來(lái)源)或者合成的(例如通過(guò)對(duì)核酸進(jìn)行定向誘變而合成)。本發(fā)明的寡核苷酸可以是RNA、DNA或其衍生物。盡管術(shù)語(yǔ)多核苷酸與寡核苷酸具有重疊的含義，但是寡核苷酸是通常相對(duì)短的單鏈分子。這種寡核苷酸的最小大小是在寡核苷酸與靶核酸分子上互補(bǔ)序列之間形成穩(wěn)定雜交體所需的大小。優(yōu)選地，所述寡核苷酸的長(zhǎng)度為至少15個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少18個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少19個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少20個(gè)核苷酸，還更優(yōu)選至少25個(gè)核苷酸。通常地，多核苷酸或寡核苷酸的單體通過(guò)磷酸二酯鍵或其類似物連接形成大小范圍在相對(duì)較短的單體單位例如12-18個(gè)核苷酸至幾百個(gè)單體單位之間的寡核苷酸。磷二酯鍵的類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酉旨、石西代磷酸酉旨(phosphoroselenoate)、二硒4戈磷酸酉旨(phosphorodiselenoate)、硫代磷酰苯胺(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酰酯(phosphoranilidate)、氨基磷酸酉旨(phosphoroamidate)。本發(fā)明包括可用作例如探針以鑒別核酸分子，或者用作引物以產(chǎn)生核酸分子。用作探針的本發(fā)明的寡核苷酸通常與可檢測(cè)的標(biāo)記如放射性同位素、酶、生物素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光分子綴合。探針和/或引物可用于從其它物種克隆本發(fā)明多核苷酸的同系物。另外，也可以使用本領(lǐng)域已知的雜交技術(shù)篩選這種同源物的基因組或cDNA文庫(kù)。重組載體本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括重組載體，其包含本發(fā)明的至少一個(gè)分離的多核苷酸分子，插入在能將該多核苷酸分子輸送至宿主細(xì)胞中的任何載體中。這種載體含有異源多核苷酸序列，即非天然發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明的多核苷酸分子相鄰的多核苷酸序列，及優(yōu)選衍生自所述多核苷酸分子衍生自其中的物種之外的物種。所述載體可以是RNA或DNA，可以是原核或真核生物，通常是轉(zhuǎn)座子(如US5,792,294所述)、病毒或質(zhì)粒。一種類型的重組載體包含與表達(dá)載體可操縱地連接的本發(fā)明的多核苷酸分子。短語(yǔ)"可操縱地連接"是指多核苷酸分子插入表達(dá)載體中，由此當(dāng)轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞中所述分子能被表達(dá)。如本文所用，表達(dá)載體是能轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞及能使得指定的多核苷酸分子表達(dá)的DNA或RNA載體。優(yōu)選地，所述表達(dá)載體也能在宿主細(xì)胞中復(fù)制。表達(dá)載體可以是原核或真核表達(dá)載體，通常是病毒或質(zhì)粒。本發(fā)明的表達(dá)載體包括在本發(fā)明的重組細(xì)胞中起作用(即指導(dǎo)基因表達(dá))的任何載體，包括在細(xì)菌、真菌、體內(nèi)寄生蟲(chóng)、節(jié)肢動(dòng)物、動(dòng)物和植物細(xì)胞中。本發(fā)明的載體也可以用于在無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生所述多肽，這種系統(tǒng)為本領(lǐng)域所熟知。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"可操縱地連接"是指兩或多個(gè)核酸節(jié)段(例如DNA)之間的功能關(guān)系。通常地，該術(shù)語(yǔ)是指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件與轉(zhuǎn)錄序列之間的功能關(guān)系。例如，如果啟動(dòng)子刺激或調(diào)節(jié)編碼序列在合適的宿主細(xì)胞和/或無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子與編碼序列如本文所述多核苷酸是可操縱地連接。通常地，與轉(zhuǎn)錄序列可操縱地連接的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件與所述轉(zhuǎn)錄序列是物理性連接的，即它們是順式作用型的(c^acting)。然而，一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件如增強(qiáng)子不需要與其轉(zhuǎn)錄被增強(qiáng)子增強(qiáng)的編碼序列物理性連接或緊鄰。特別地，本發(fā)明的表達(dá)載體含有調(diào)節(jié)序列如轉(zhuǎn)錄控制序列、翻譯控制序列、復(fù)制起源，及與重組細(xì)胞相容及控制本發(fā)明的多核苷酸分子表達(dá)的其它調(diào)節(jié)序列。特別地，本發(fā)明的重組分子包括轉(zhuǎn)錄控制序列。轉(zhuǎn)錄控制序列是控制轉(zhuǎn)錄的起始、延長(zhǎng)和終止的序列。特別重要的轉(zhuǎn)錄控制序列是控制轉(zhuǎn)錄起始的那些序列，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操縱子和阻抑物序列。合適的轉(zhuǎn)錄控制序列包括可以在本發(fā)明的至少一種重組細(xì)胞中起作用的任何轉(zhuǎn)錄控制序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多這種轉(zhuǎn)錄控制序列。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄控制序列包括在細(xì)菌、酵母、節(jié)肢動(dòng)物、線蟲(chóng)、植物或哺乳動(dòng)物中起作用的那些序列，例如但非限于tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、入噬菌體、T7噬菌體、T71ac、T3噬菌體、SP6噬菌體、SP01噬菌體、金屬硫蛋白、a-交配因子、畢赤酵母醇氧化酶、a病毒亞基因組啟動(dòng)子(如新培斯病毒亞基因組啟動(dòng)子)、抗生素抗性基因、桿狀病毒、玉米夜蛾(Hdiothis25zea)昆蟲(chóng)病毒、痘苗病毒、皰疹病毒、浣熊痘病毒、其它痘病毒、腺病毒、巨細(xì)胞病毒(如立即早期啟動(dòng)子)、猿病毒40、逆轉(zhuǎn)錄病毒、肌動(dòng)蛋白、逆轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)末端重復(fù)、勞斯(Rous)肉瘤病毒、熱休克蛋白、磷酸鹽和硝酸鹽轉(zhuǎn)錄控制序列，以及能控制原核或真核細(xì)胞中基因表達(dá)的其它序列。本發(fā)明多肽的編碼序列可以通過(guò)使用已知技術(shù)優(yōu)化為在特定宿主細(xì)胞中最大程度表達(dá)。例如，SEQIDNO:6提供了構(gòu)建用于在植物細(xì)胞中增強(qiáng)表達(dá)的編碼SEQIDNO:l的開(kāi)放讀框，而SEQIDNO:7提供了構(gòu)建用于在大腸桿菌中增強(qiáng)表達(dá)的編碼SEQIDNO:l的開(kāi)放讀框。宿主細(xì)胞本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括重組細(xì)胞，其包含用本發(fā)明的一或多個(gè)重組分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或其后代。多核苷酸分子轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)胞中可以通過(guò)可以將多核苷酸分子插入細(xì)胞中的任何方法實(shí)現(xiàn)。轉(zhuǎn)化技術(shù)包括但非限于轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、吸附和原生質(zhì)體融合。重組細(xì)胞可以保持單細(xì)胞狀態(tài)，或者可以生長(zhǎng)為組織、器官或多細(xì)胞生物體。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的多核苷酸分子可以保持在染色體之外，或者可以整合進(jìn)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(即重組細(xì)胞)的染色體中的一或多個(gè)位點(diǎn)，由此保留其被表達(dá)的能力。進(jìn)行轉(zhuǎn)化的合適宿主細(xì)胞包括可以用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的任何細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是能產(chǎn)生本發(fā)明多肽的內(nèi)源(即天然)細(xì)胞，或者可以是在用本發(fā)明的至少一種多核苷酸分子轉(zhuǎn)化后能產(chǎn)生這種多肽的細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是能產(chǎn)生至少一種本發(fā)明的蛋白質(zhì)的任何細(xì)胞，包括細(xì)菌、真菌(包括酵母)、寄生蟲(chóng)、線蟲(chóng)、節(jié)肢動(dòng)物、動(dòng)物和植物細(xì)胞。宿主細(xì)胞的例子包括沙門(mén)氏菌(5"a/mo"e〃a)、埃希氏菌(Esc/zen'c/^)、芽孢桿菌(5ac/〃w)、李斯特氏菌(丄WeWa)、糖酵母(5Wcc/zarawycas)、Spc^o;/era、分枝桿菌(Myco&cfeWa)、7Wc/zop/MW'a、BHK(幼倉(cāng)鼠腎)細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、CRFK細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、COS(例如COS-7)細(xì)胞和Vero細(xì)胞。宿主細(xì)胞的其它例子是大腸桿菌，包括大腸桿菌K-12衍生物；鼠沙|、，氏菌(6"a/mowe〃a(yp/z/);鼠j矢寒少l、"]氏菌(5""/mo"e〃a/^//z/mi/n'Mm)，包括減毒菌株；草地貪夜蛾oS^c^c^era戶wgi^ert^);粉紋夜蛾(TWc/zop/ww'a"";及非致瘤性小鼠成肌細(xì)胞G8細(xì)胞(例如ATCCCRL1246)。特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。26重組DNA技術(shù)可用于改良轉(zhuǎn)化的多核苷酸分子的表達(dá)，通過(guò)操縱例如宿主細(xì)胞內(nèi)所述多核苷酸分子的拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的效率、翻譯所得轉(zhuǎn)錄體的效率，及翻譯后修飾的效率?？捎糜谠黾颖景l(fā)明的多核苷酸分子表達(dá)的重組技術(shù)包括但非限于將多核苷酸分子與高拷貝數(shù)的質(zhì)?？刹倏v地連接、將所述多核苷酸分子整合進(jìn)一或多個(gè)宿主細(xì)胞染色體中、將載體穩(wěn)定性序列加入質(zhì)粒中、取代或修飾轉(zhuǎn)錄控制信號(hào)(例如啟動(dòng)子、操縱子、增強(qiáng)子)、取代或修飾翻譯控制信號(hào)(例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、Shine-Dalgamo序列)、修飾本發(fā)明的多核苷酸分子使其符合宿主細(xì)胞的密碼子用途，并缺失使轉(zhuǎn)錄體不穩(wěn)定的序列。轉(zhuǎn)基因植物如本文所用，術(shù)語(yǔ)"植物"作為名詞是指完整的植物，但是用作形容詞是指存在于、得自、衍生自植物或者與植物相關(guān)的任何物質(zhì)，例如植物器官(例如葉、莖、根、花)、單細(xì)胞(例如花粉)、種子、植物細(xì)胞等。用于實(shí)踐本發(fā)明的植物包括單子葉植物和雙子葉植物。耙植物包括但非限于如下植物谷類(小麥、大麥、黑麥、燕麥、水稻、高粱、及相關(guān)作物)；甜菜(糖用甜菜和飼用甜菜)；梨果、堅(jiān)果和軟果(蘋(píng)果、梨、李、桃、杏、櫻桃、草莓、樹(shù)莓和黑莓)；豆科植物(菜豆、扁豆、豌豆、大豆)；油脂植物(oilplant)(油菜、芥菜、罌粟、橄欖、向日葵、椰子、蓖麻、可可豆、落花生)；瓜類植物(cucumberplant)(魚(yú)翅瓜(marrows)、黃瓜、甜瓜)；纖維植物(棉花、亞麻、大麻、黃麻)；柑橘類果實(shí)(橙、擰檬、柚子、桔子)；蔬菜(菠菜、萵苣、蘆筍、甘藍(lán)、胡蘿卜、洋蔥、番茄、馬鈴薯、辣椒)；樟科植物(鱷梨、肉桂、樟腦)；或者植物如玉米、煙草、堅(jiān)果、咖啡、甘蔗、茶葉、葡萄、啤酒花、草皮、香蕉及天然橡膠植物，以及觀賞植物(花、灌木、闊葉樹(shù)和常綠植物如松樹(shù))。優(yōu)選地，所述植物是被子植物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物包括已經(jīng)使用重組技術(shù)進(jìn)行遺傳修飾使得至少一種本發(fā)明的多肽在希望的植物或植物器官中產(chǎn)生的植物及其后代。轉(zhuǎn)基因植物可以通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生，如在A.Slateretal.，PlantBiotechnology-TheGeneticManipulationofPlants,OxfordUniversityPress(2003)禾口P.ChristouandH.Klee,HandbookofPlantBiotechnology,JohnWileyandSons(2004)中描述的那些技術(shù)。"轉(zhuǎn)基因植物"是指含有在相同物種的野生型植物、品種或栽培種中未發(fā)現(xiàn)的基因構(gòu)建體(轉(zhuǎn)基因)的植物。如本文所用，"轉(zhuǎn)基因"具有生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的標(biāo)準(zhǔn)含義，包括通過(guò)重組DNA或RNA技術(shù)產(chǎn)生或改變的且己經(jīng)導(dǎo)入植物細(xì)胞中的遺傳序列。轉(zhuǎn)基因可包括衍生自植物細(xì)胞的遺傳序列。通常地，通過(guò)人工操縱例如通過(guò)轉(zhuǎn)化將轉(zhuǎn)基因?qū)胫参镏?，但是可以使用本領(lǐng)域公認(rèn)的任何方法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于已經(jīng)導(dǎo)入的每一個(gè)基因(轉(zhuǎn)基因)均是純合的，由此其后代對(duì)于希望的表型不分離。所述轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因也可以是雜合的，例如在從雜交種子中生長(zhǎng)的F1后代中。這種植物可提供本領(lǐng)域熟知的優(yōu)勢(shì)如雜種優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的多核苷酸可以在轉(zhuǎn)基因植物中在發(fā)育的所有階段組成型表達(dá)。根據(jù)使用的植物或植物器官，所述多肽可以以階段特異性方式表達(dá)。此外，所述多核苷酸可以是組織特異性表達(dá)的。已知或發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致編碼感興趣的多肽的基因在植物中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列可以用于本發(fā)明中。調(diào)節(jié)序列的選擇依賴于感興趣的靶植物和/或靶器官。這種調(diào)節(jié)序列可以得自植物或植物病毒，或者可以化學(xué)合成。這種調(diào)節(jié)序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了許多適于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞或建立轉(zhuǎn)基因植物的載體，例如Pouwelsetal.，CloningVectors:ALaboratoryManual,1985，supp.1987;WeissbachandWeissbach，MethodsforPlantMolecularBiology,AcademicPress,1989;andGelvinetal.,PlantMolecularBiologyManual,KluwerAcademicPublishers,1990所述。通常地，植物表達(dá)載體包括例如在5'和3'調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)錄控制下的一或多個(gè)克隆的植物基因及顯性選擇標(biāo)記。這種植物表達(dá)載體也可以含有啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)(例如調(diào)節(jié)區(qū)控制的可誘導(dǎo)或組成型表達(dá)、環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)的表達(dá)，或者細(xì)胞或組織特異性表達(dá)),、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA加工信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)，和/或聚腺苷酸化信號(hào)。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了許多在植物細(xì)胞中具有活性的許多組成型啟動(dòng)子。對(duì)于在植物中組成型表達(dá)合適的啟動(dòng)子包括但非限于花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子、Figwort花葉病毒(FMV)35S啟動(dòng)子、甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子、鴨跖草黃化斑駁病毒(commelinayellowmottlevirus)啟動(dòng)子、來(lái)自核酮糖-l，5-二磷酸羧化酶的小亞基的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、來(lái)自水稻胞質(zhì)磷酸丙糖異構(gòu)酶啟動(dòng)子、^""6Wo^^的腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子、水稻肌動(dòng)蛋白1基因啟動(dòng)子、甘露堿合酶和章魚(yú)堿合酶啟動(dòng)子、Adh啟動(dòng)子、蔗糖合酶啟動(dòng)子、R基因復(fù)合物啟動(dòng)子，及葉綠素a/p結(jié)合蛋白基因啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子用于產(chǎn)生在植物中表達(dá)的DNA載體，見(jiàn)例如PCT出版物WO8402913所述。所有這些啟動(dòng)子均已經(jīng)用于產(chǎn)生各種類型的植物可表達(dá)的重組DNA載體。為了在植物的源組織如葉、種子、根或莖中表達(dá)，優(yōu)選本發(fā)明中應(yīng)用的啟動(dòng)子在這些特異組織中具有較高的表達(dá)水平。為此，針對(duì)組織或細(xì)胞特異性或者增強(qiáng)的表達(dá)的基因而可以選擇許多啟動(dòng)子。文獻(xiàn)中報(bào)道的這種啟動(dòng)子的例子包括豌豆葉綠體谷氨酰胺合成酶GS2啟動(dòng)子、小麥葉綠體果糖-l,6-二磷酸酶啟動(dòng)子、馬鈴薯核光合作用ST-LS1啟動(dòng)子、擬南芥//w/^m)的絲氨酸/蘇氨酸激酶啟動(dòng)子和葡糖淀粉酶(CHS)啟動(dòng)子。還報(bào)道了在美洲落葉松(丄aWx/^^/"o)光合作用組織中具有活性的核糖體-l，5-二磷酸羧化酶啟動(dòng)子、松樹(shù)Cab基因Cab6的啟動(dòng)子、小麥Cab-l基因的啟動(dòng)子、菠菜Cab-l基因的啟動(dòng)子、水稻CablR基因的啟動(dòng)子、玉蜀黍(Z^ma^)的丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)啟動(dòng)子、煙草Lhcbl*2基因的啟動(dòng)子、擬南芥Suc2蔗糖-H"共運(yùn)輸啟動(dòng)子，及菠菜類囊體膜蛋白基因的啟動(dòng)子(PsaD、PsaF、PsaE、PC、FNR、AtpC、AtpD、Cab、RbcS)。本發(fā)明中也可以應(yīng)用葉綠素oc/p-結(jié)合蛋白的其它啟動(dòng)子，如白芥(&'"aj^a/kO的LhcB和PsbP基因的啟動(dòng)子。經(jīng)調(diào)節(jié)以應(yīng)答環(huán)境、激素、化學(xué)制品和/或發(fā)育信號(hào)的許多植物基因啟動(dòng)子也可用于在植物細(xì)胞中表達(dá)RNA結(jié)合蛋白基因，包括通過(guò)如下方式調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子(l)熱；(2)光(例如豌豆RbcS-3A啟動(dòng)子、玉米R(shí)bcS啟動(dòng)子)；(3)激素如脫落酸；(4)創(chuàng)傷(例如WunI);或者(5)化學(xué)制品如茉莉酮酸甲酯(methyljasminate)、水楊酸、類固醇激素、乙醇、Safeners(WO9706269)，或者也可以有利地應(yīng)用(6)器官特異性啟動(dòng)子。為了在植物匯組織如馬鈴薯植物的塊莖、番茄果實(shí)或者大豆、油菜、棉花、玉蜀黍、小麥、水稻和大麥的種子中表達(dá)，優(yōu)選本發(fā)明應(yīng)用的啟動(dòng)子在這些特異組織中具有較高的表達(dá)水平。本領(lǐng)域已知許多塊莖特異性或者增強(qiáng)表達(dá)的基因啟動(dòng)子，包括I型patatin啟動(dòng)子、馬鈴薯塊莖ADPGPP基因啟動(dòng)子(大和小亞單位)、蔗糖合酶啟動(dòng)子、主要塊莖蛋白包括22kD蛋白質(zhì)復(fù)合物和蛋白酶抑制劑的啟動(dòng)子、顆粒結(jié)合型淀粉合酶(GBSS)的啟動(dòng)子，及其它I和II型patatin啟動(dòng)子。其它啟動(dòng)子也可用于在特定組織如在種子和果實(shí)中表達(dá)蛋白質(zhì)。可以使用(3-大豆伴球蛋白(conglycinin)啟動(dòng)子或其它種子特異性啟動(dòng)子如napin和豆球蛋白啟動(dòng)子。對(duì)于玉蜀黍胚乳表達(dá)特別優(yōu)選的啟動(dòng)子是水稻谷蛋白基因啟動(dòng)子，更優(yōu)選Osgt-l啟動(dòng)子。適于在小麥中表達(dá)的啟動(dòng)子的例子包括ADP葡萄糖熱合酶(ADPGPP)亞單位、顆粒結(jié)合型及其它淀粉合酶、分支酶和去分支酶、胚發(fā)生富集蛋白(embryogenesis-abundantprotein)、麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的啟動(dòng)子。水稻中這種啟動(dòng)子例子包括ADPGPP亞單位、顆粒結(jié)合型及其它淀粉合酶、分支酶、去分支酶、蔗糖合酶及谷蛋白的啟動(dòng)子。特別優(yōu)選的啟動(dòng)子是水稻谷蛋白、Osgt-l基因的啟動(dòng)子。大麥的這種啟動(dòng)子例如包括ADPGPP亞單位、顆粒結(jié)合型及其它淀粉合酶、分支酶、去分支酶、蔗糖合酶、大麥醇溶蛋白、胚球蛋白及糊粉特異性蛋白的啟動(dòng)子。也可以應(yīng)用根特異性啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子的例子是酸性幾丁質(zhì)酶基因的啟動(dòng)子。在根組織中的表達(dá)也可以通過(guò)利用己經(jīng)鑒別的CaMV35S啟動(dòng)子的根特異性亞結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)。5'非翻譯前導(dǎo)序列可以衍生自選擇用于表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的異源基因的啟動(dòng)子，且如果需要可以特異性修飾以增加mRNA的翻譯。關(guān)于優(yōu)化轉(zhuǎn)基因表達(dá)的綜述見(jiàn)Kozid等(1996)所述。這種優(yōu)化的前導(dǎo)序列的例子包括在SEQIDNO:6中。5'非翻譯區(qū)也可以得自植物病毒RNA(煙草花葉病毒、煙草蝕紋病毒、玉米矮小花葉病毒、紫花苜?；ㄈ~病毒等)，得自合適的真核基因、植物基因(小麥和玉米葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因前導(dǎo)序列)，或者得自合成的基因序列。本發(fā)明非限于其中非翻譯區(qū)衍生自伴隨啟動(dòng)子序列的5'非翻譯序列的構(gòu)建體。前導(dǎo)序列也可以衍生自不相關(guān)的啟動(dòng)子或編碼序列。本發(fā)明中應(yīng)用的前導(dǎo)序列包含玉米Hsp70前導(dǎo)序列(U.S.5,362,865和U.S.5，859,347)及TMVomega元件。轉(zhuǎn)錄的終止通過(guò)3'非翻譯DNA序列在嵌合載體中與感興趣的多核苷酸可操縱地連接而實(shí)現(xiàn)。重組DNA分子的3'非翻譯區(qū)含有在植物中起作用的聚腺苷酸化信號(hào)，導(dǎo)致在RNA的3'末端添加腺苷酸化核苷酸。3'非翻譯區(qū)可以得自在植物細(xì)胞中表達(dá)的不同基因。通常使用胭脂堿合成酶3'非翻譯區(qū)、來(lái)自豌豆小亞單位Rubisco基因的3，非翻譯區(qū)、來(lái)自大豆7S種子貯存蛋白基因的3'非翻譯區(qū)。含有農(nóng)桿菌腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；虻木巯佘账峄盘?hào)的3'轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)也是合適的。本領(lǐng)域己經(jīng)描述了將基因直接輸送至細(xì)胞中的四種方法(l)化學(xué)方法(Grahametal.，1973);(2)物理方法如微粒轟擊(Capecchi,1980)、電穿孔(見(jiàn)例如WO87/06614、US5,472,869、5,384,253、WO92/09696和WO93/21335)，及基因槍(見(jiàn)例如US4,945,050和US5,141,131);(3)病毒載體(Clapp,1993;Luetal.,1993;Eglitisetal.,1988);及(4)受體介導(dǎo)的機(jī)制(Curieletal.，1992;Wagneretal.,1992)。可以使用加速方法，包括例如微粒轟擊等方法。將轉(zhuǎn)化的核酸分子輸送至植物細(xì)胞的方法的一個(gè)例子是微粒轟擊。這種方法已經(jīng)由Yangetal.,ParticleBombardmentTechnologyforGeneTransfer,OxfordPress,Oxford,England(1994)加以綜述。非生物粒子(微粒)可以用核酸包被并通過(guò)推進(jìn)力輸送至細(xì)胞。粒子例如包括鎢、金、鉑金等粒子。微粒轟擊除了是可再生轉(zhuǎn)化單子葉植物的有效方式之外，其特別的優(yōu)勢(shì)之處在于既不需要分離原生質(zhì)體，也不需要對(duì)農(nóng)桿菌感染的易感性。通過(guò)加速方法將DNA輸送至玉蜀黍細(xì)胞中的方法的一個(gè)實(shí)施方案是基因槍oc-粒子輸送系統(tǒng)，其可用于通過(guò)篩(screen)如不銹鋼或Nytex篩推動(dòng)DNA包被的粒子至懸浮培養(yǎng)的玉米細(xì)胞包被的濾膜表面上。適于本發(fā)明使用的粒子輸送系統(tǒng)是可得自Bio-RadLaboratories的氦加速PDS-1000/He基因槍。對(duì)于轟擊而言，可以將懸浮的細(xì)胞在濾膜上濃縮。將被轟擊的含有細(xì)胞的濾膜以合適距離放置于微粒轟擊停止板的下面。如果需要，在基因槍與被轟擊的細(xì)胞之間還可以放置一或多個(gè)篩?；蛘?，可以將不成熟的胚或其它靶細(xì)胞排列在固體培養(yǎng)基上。被轟擊的細(xì)胞以合適距離放置在微粒轟擊停止板的下面。如果需要，在加速裝置與被轟擊的細(xì)胞之間還可以放置一或多個(gè)篩。通過(guò)使用本文所述技術(shù)，可以獲得接近1000或更多個(gè)瞬時(shí)表達(dá)標(biāo)記基因的細(xì)胞灶。在轟擊后48小時(shí)表達(dá)外源基因產(chǎn)物的灶中細(xì)胞的數(shù)目通常為1至10個(gè)，平均為1-3個(gè)。在轟擊轉(zhuǎn)化方法中，可以優(yōu)化轟擊前的培養(yǎng)條件及轟擊參數(shù)，以產(chǎn)生最大數(shù)目的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。物理和生物參數(shù)對(duì)于這種技術(shù)均是重要的。物理因素包括DNA/微粒轟擊沉淀或者影響巨粒(macro-projectiles)或微粒轟擊的31射擊和速度的那些因素。生物因素包括在轟擊之前和立即之后參與細(xì)胞處理的所有步驟，靶細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)幫助減輕與轟擊相關(guān)的創(chuàng)傷，轉(zhuǎn)化DNA的性質(zhì)如線性DNA或完整超螺旋的質(zhì)粒。確信轟擊前的處理對(duì)于成功轉(zhuǎn)化不成熟的胚非常重要。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)化質(zhì)體。關(guān)于在高等植物中轉(zhuǎn)化質(zhì)體的方法包括用基因槍輸送含有選擇標(biāo)記的DNA并通過(guò)同源重組將該DNA耙向于質(zhì)體基因組(U.S.5，451,513、U.S.5,545,818、U.S.5,877,402、U.S.5,932479和WO99/05265)。因此，預(yù)期可以在小規(guī)模研究中調(diào)節(jié)轟擊參數(shù)的各個(gè)方面，以充分優(yōu)化條件。特別希望調(diào)節(jié)物理參數(shù)如間隙距離、飛行(flight)距離、組織距離和氦壓。也可以通過(guò)修改影響受體細(xì)胞的生理狀態(tài)及因此影響轉(zhuǎn)化和整合效率的條件使創(chuàng)傷減少因素最小化。例如，可以調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的滲透狀態(tài)、組織水合作用和傳代培養(yǎng)狀態(tài)或細(xì)胞周期以優(yōu)化轉(zhuǎn)化。根據(jù)本發(fā)明的揭示，技術(shù)人員將獲知其它常規(guī)調(diào)節(jié)方法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移是可廣泛應(yīng)用的系統(tǒng)以將基因?qū)胫参锛?xì)胞中，因?yàn)镈NA可以導(dǎo)入完整的植物組織中，從而回避了需要從原生質(zhì)體中再生完整的植物的過(guò)程。使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物整合載體將DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞中的方法為本領(lǐng)域所熟知(見(jiàn)例如US5，177，010、US5，104，310、US5,004,863、US5,159,135)。另外，T-DNA的整合是相對(duì)精確的過(guò)程，導(dǎo)致很少的重排。轉(zhuǎn)移的DNA區(qū)域通過(guò)邊界序列限定，及插入的DNA通常插入植物基因組中。現(xiàn)代農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體能在大腸桿菌以及農(nóng)桿菌中復(fù)制，使得可以便于處理(Kleeetal"In:PlantDNAInfectiousAgents,HohnandSchell,eds.，Springer-Verlag,NewYork,pp.179-203(1985》。另夕卜，關(guān)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的載體方面的技術(shù)進(jìn)展改良了載體中基因和限制位點(diǎn)的排列，便于構(gòu)建能表達(dá)不同多肽編碼基因的載體。所述載體具有常規(guī)的多接頭區(qū)域，兩側(cè)是啟動(dòng)子和聚腺苷酸化位點(diǎn)，以指導(dǎo)插入的多肽編碼基因的表達(dá)且適于本發(fā)明的目的。另外，含有有臂和無(wú)臂Ti基因的農(nóng)桿菌可用于轉(zhuǎn)化。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是有效的那些植物品種中，由于基因轉(zhuǎn)移的易于做到和性質(zhì)確定而選擇這種方法。使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法形成的轉(zhuǎn)基因植物在一個(gè)染色體上通常含有一個(gè)基因座。這種轉(zhuǎn)基因植物可以稱作與加入的基因是半純合的。更優(yōu)選的是對(duì)于加入的結(jié)構(gòu)基因純合的轉(zhuǎn)基因植物，即含有兩個(gè)加入的基因的轉(zhuǎn)基因植物，一個(gè)基因在染色體對(duì)的每個(gè)染色體上相同的基因座。純合的轉(zhuǎn)基因植物可以通過(guò)如下方式獲得有性交配(自交)含有一個(gè)加入的基因的獨(dú)立分離的轉(zhuǎn)基因植物、使產(chǎn)生的一些種子發(fā)芽并分析所得植物的感興趣的基因。也應(yīng)理解也可以將兩種不同的轉(zhuǎn)基因植物交配產(chǎn)生含有兩個(gè)獨(dú)立分離的外源基因的子代。使合適的后代自交可以產(chǎn)生對(duì)于這兩個(gè)外源基因均純合的植物。也包括與親本植物回交及與非轉(zhuǎn)基因植物遠(yuǎn)交，以及無(wú)性繁殖。關(guān)于通用于不同性狀和作物的其它育種方法的描述可見(jiàn)于Fehr,In:BreedingMethodsforCultivarDevelopment,WilcoxJ.ed.,AmericanSocietyofAgronomy,MadisonWis.(1987)。植物原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化可以通過(guò)使用基于磷酸鈣沉淀、聚乙二醇處理、電穿孔等方法及組合這些方法而實(shí)現(xiàn)。這些系統(tǒng)應(yīng)用于不同的植物品種依賴于特定植株從原生質(zhì)體中再生的能力。例如描述了從原生質(zhì)體中再生谷類植物的方法(Fujimuraetal.,1985;Toriyamaetal.，1986;Abdullahetal.,1986)。也可以使用其它細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法，包括但非限于通過(guò)直接DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)花粉中而將DNA導(dǎo)入植物中、通過(guò)將DNA直接注入植物的生殖器官中，或者通過(guò)將DNA直接注入不成熟胚的細(xì)胞中及隨后再水合脫水的胚。本領(lǐng)域熟知從單植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體或者從各種轉(zhuǎn)化的外植體中再生、發(fā)育和培養(yǎng)植物的方法(Weissbachetal.,In:MethodsforPlantMolecularBiology,AcademicPress,SanDiego，Calif.,(1988)。這種再生和生長(zhǎng)過(guò)程通常包括如下步驟選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、培養(yǎng)這些毒力的細(xì)胞使其通過(guò)胚發(fā)育至生根幼苗的常規(guī)階段。轉(zhuǎn)基因胚和種子類似地再生。之后將所得轉(zhuǎn)基因的生根的嫩芽植于合適的植物生長(zhǎng)培養(yǎng)基如土壤中。本領(lǐng)域熟知含有外來(lái)、外源基因的植物的發(fā)育或再生方法。優(yōu)選地，將再生的植物自花授粉以提供純合的轉(zhuǎn)基因植物?；蛘?，將得自再生植物的花粉與農(nóng)業(yè)重要的品系的產(chǎn)種植物(seed-grownplant)雜交。相反，將這些33重要品系植物的花粉對(duì)再生的植物授粉。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法培養(yǎng)含有希望的外源核酸的本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物。主要通過(guò)使用根癌農(nóng)桿菌"gra6a"en'wm^me/adera)轉(zhuǎn)化雙子葉植物及獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法已經(jīng)針對(duì)棉花(U.S.5,004,863、U.S.5,159,135、U.S.5,518,908)、大豆(U.S.5,569,834，U.S.5,416,011)、蕓苔(U.S.5,463,174)、花生(Chengetal.,1996)和豌豆(Grantetal.,1995)公開(kāi)。本領(lǐng)域熟知通過(guò)導(dǎo)入外源核酸及從原生質(zhì)體或不成熟的植物胚中再生植物而轉(zhuǎn)化谷類植物如小麥和大麥以在植物中導(dǎo)入遺傳變異的方法，見(jiàn)例如加拿大專利申請(qǐng)No.2,092,588、澳大利亞專利申請(qǐng)No61781/94、澳大利亞專利No667939、美國(guó)專利No.6,100,447、國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US97/10621、美國(guó)專利No.5,589，617、美國(guó)專利No.6,541,257及專利說(shuō)明書(shū)W099/14314所述。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因小麥或大麥通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生。具有希望的核酸構(gòu)建體的載體可以導(dǎo)入組織培養(yǎng)的植物或外植體的再生的小麥細(xì)胞中，或者合適的植物系統(tǒng)如原生質(zhì)體中。可再生的小麥細(xì)胞優(yōu)選得自不成熟胚的盾片、成熟胚、衍生自這些組織的愈傷組織，或者分生組織?？梢允褂萌鏤S20050022261所述方法產(chǎn)生表達(dá)本發(fā)明多肽的植物，其中本發(fā)明的多核苷酸取代編碼GOX或EPSPS蛋白的核酸?？梢允褂肬S20040133940所述方法產(chǎn)生草甘膦抗性小麥，其中EPSPS編碼DNA用編碼本發(fā)明多肽的核酸分子置換?；蛘?，可以使用US20030154517所述方法產(chǎn)生草甘膦，以將編碼本發(fā)明多肽的基因構(gòu)建體導(dǎo)入小麥細(xì)胞中。為了證實(shí)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和植物中轉(zhuǎn)基因的存在，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增或Southern印跡分析。根據(jù)產(chǎn)物的性質(zhì)，可以通過(guò)多種方式檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)產(chǎn)物，包括Western印跡和酶測(cè)定法。在不同植物組織中量化蛋白質(zhì)表達(dá)及檢測(cè)復(fù)制的一個(gè)特別有益的方式是使用報(bào)道基因如GUS。一旦獲得轉(zhuǎn)基因植物，則可以使其生長(zhǎng)產(chǎn)生具有希望的表型的轉(zhuǎn)基因植物組織或其部分?？梢允斋@所述植物組織或植物的部分，和/或收集種子。種子可以作為生長(zhǎng)為具有希望特性的植物組織或植物部分的另外的植物的來(lái)源。34可以對(duì)使用本文所述方法產(chǎn)生的植物檢測(cè)其對(duì)于除草劑如草甘膦的抗性，使用US20050022261或US20060059581所述方法進(jìn)行。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可包含除了本發(fā)明那些之外的其它轉(zhuǎn)基因，其增強(qiáng)植物對(duì)于含胺除草劑的耐受性/抗性。例如包括對(duì)于草甘膦具有較低親和性并因此在存在的草甘膦情況中保持其催化活性的細(xì)菌EPSPS變體和植物EPSPS變體的表達(dá)(美國(guó)專利No.5,633,435、5,094,945、4,535,060和6,040,497)，以及也降解草甘膦的GOX的表達(dá)(US5,776,760)。轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物"轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物"是指除了人之外的動(dòng)物，其含有在相同物種或品種的野生型動(dòng)物中未發(fā)現(xiàn)的基因構(gòu)建體(轉(zhuǎn)基因)。"轉(zhuǎn)基因"在本文具有生物
技術(shù)領(lǐng)域：
通識(shí)的含義，包括通過(guò)重組DNA或RNA技術(shù)產(chǎn)生或改變的且已經(jīng)導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞中的遺傳序列。所述轉(zhuǎn)基因可包括衍生自動(dòng)物細(xì)胞的遺傳序列。通常地，所述轉(zhuǎn)基因己經(jīng)通過(guò)人工操縱例如通過(guò)轉(zhuǎn)化而導(dǎo)入動(dòng)物中，但也可以應(yīng)用本領(lǐng)域公認(rèn)的任何方法。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知。關(guān)于這方面的一本有用的教禾斗書(shū)是Houdebine,Transgenicanimals-GenerationandUse(HarwoodAcademic,1997)。可以將異源DNA導(dǎo)入例如哺乳動(dòng)物的受精卵中。例如，全能或多能干細(xì)胞可以通過(guò)顯微注射、磷酸鈣介導(dǎo)的沉淀、脂質(zhì)體融合、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染或者其它方式轉(zhuǎn)化，然后將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞導(dǎo)入胚胎中，使該胚胎發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在特別優(yōu)選的方法中，用含有希望的DNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染發(fā)育中的胚胎，并從此感染的胚胎中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。然而，在最優(yōu)選的方法中，將合適的DNA共注射(coinjected)進(jìn)胚胎的前核或細(xì)胞質(zhì)中，優(yōu)選在單細(xì)胞階段注射，使該胚胎發(fā)育成產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。另一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法將核酸顯微注射進(jìn)原核期卵中。然后培養(yǎng)注射的卵，之后移至假孕受體的輸卵管中。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也可以通過(guò)核轉(zhuǎn)移技術(shù)產(chǎn)生。使用這種方法，將得自供體動(dòng)物的成纖維細(xì)胞用包含在調(diào)節(jié)序列控制下感興趣的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或結(jié)合配體的編碼序列的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。然后將穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體與去核的卵母細(xì)胞融合、培養(yǎng)并移至雌性受體中。組合物本發(fā)明的組合物可包括"可接受的載體"。這種可接受的載體的例子包括水、鹽水、Ringer's溶液、葡萄糖溶液、Hank's溶液，及其它生理學(xué)平衡的鹽水溶液。非水溶液載體如不揮發(fā)油、芝麻油、油酸乙酯或者甘油三酯也可以使用。"可接受的載體"的需求性質(zhì)根據(jù)使用的組合物而定。鑒于本文所述的應(yīng)用及組合物中本發(fā)明的成分的性質(zhì)，技術(shù)人員易于確定特定用途的合適的"可接受的載體"。多肽和/或編碼其的表達(dá)構(gòu)建體可用于治療患者如暴露于含胺除草劑的人和魚(yú)類。因此，本發(fā)明的組合物可包括"藥物可接受的載體"以產(chǎn)生"藥物組合物"。藥物可接受的載體為本領(lǐng)域所熟知(見(jiàn)例如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,AlfonsoR.Gennaro,MackPublishingCompany,Easton，Pa"19thEdition(1995))。本發(fā)明的多肽可以于組合物中提供，其增強(qiáng)含胺除草劑的降解速度和/或程度，或者增加多肽的穩(wěn)定性。例如，所述多肽可以固定于聚氨酯基質(zhì)(Gordonetal.，1999)上，或者在合適的脂質(zhì)體中制成膠囊(Petrikovics等2000aandb)。所述多肽也可以摻入包含泡沫的組合物中，如在消防中常用的泡沫(LeJeuneetal.,1998)。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到，本發(fā)明的多肽可易于用于海綿或泡沫中，如WO00/64539所揭示，所述文獻(xiàn)在此以其全部?jī)?nèi)容并入作參考。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是控制釋放的配制品，其能將本發(fā)明的多肽緩慢釋放至動(dòng)物、植物、動(dòng)物或植物材料、或者外界環(huán)境(包括土壤和水樣)中。如本文所用，控制釋放的配制品包含于控制釋放的運(yùn)載體中的本發(fā)明的組合物。合適的控制釋放的運(yùn)載體包括但非限于生物相容的聚合物、其它聚合基質(zhì)、膠囊、微膠囊、微粒、推注制品、滲透泵、擴(kuò)散裝置、脂質(zhì)體、脂質(zhì)微氣泡(lipospheres)和經(jīng)皮輸送系統(tǒng)。優(yōu)選的控制釋放的配制品是生物可降解的(即生物易蝕的(bioerodible))。本發(fā)明優(yōu)選的控制釋放配制品能將本發(fā)明的組合物釋放進(jìn)用含胺除草劑特別是草甘膦噴霧的土壤或水中。該配制品優(yōu)選在大約l-12個(gè)月的時(shí)間范圍內(nèi)釋放。優(yōu)選的本發(fā)明控制釋放配制品能有效治療優(yōu)選至少大約1個(gè)月、更優(yōu)選至少大約3個(gè)月、甚至更優(yōu)選至少大約6個(gè)月、甚至更優(yōu)選至少大約9個(gè)月、甚至更優(yōu)選至少大約12個(gè)月。為產(chǎn)生有效降解含胺除草劑的組合物所需的本發(fā)明的多肽、載體或宿主細(xì)胞等的濃度依賴于準(zhǔn)備凈化的樣品的性質(zhì)、樣品中含胺除草劑的濃度、及組合物的配方。所述組合物中所述多肽、載體或宿主細(xì)胞的有效濃度可易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員利用實(shí)驗(yàn)而確定?？贵w本發(fā)明還提供了本發(fā)明多肽的單克隆抗體或多克隆抗體或其片段。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了產(chǎn)生本發(fā)明多肽的單克隆抗體或多克隆抗體的方法。術(shù)語(yǔ)"特異性結(jié)合"是指抗體與本發(fā)明的至少一種多肽結(jié)合、而與其它已知蛋白質(zhì)不結(jié)合的能力。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"表位"是指抗體結(jié)合的本發(fā)明多肽的區(qū)域。表位可以被給予動(dòng)物以產(chǎn)生該表位的抗體。然而，本發(fā)明的抗體優(yōu)選特異性結(jié)合完整多肽的表位區(qū)。如果多克隆抗體是希望的，則用本發(fā)明的免疫原性多肽對(duì)選擇的動(dòng)物(例如小鼠、兔、山羊、馬等)進(jìn)行免疫接種。收集經(jīng)免疫接種的動(dòng)物的血清，根據(jù)已知程序進(jìn)行處理。如果含有多克隆抗體的血清含有其它抗原的抗體，則通過(guò)免疫親和層析法純化所述多克隆抗體。產(chǎn)生和處理多克隆抗血清的技術(shù)為本領(lǐng)域所已知。為了可以產(chǎn)生這種抗體，本發(fā)明還提供了半抗原化至另一多肽的本發(fā)明多肽或其片段，以在動(dòng)物中用作免疫原。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的單克隆抗體。本領(lǐng)域熟知通過(guò)雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體的一般方法。永生化的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系可以通過(guò)細(xì)胞融合法產(chǎn)生，也可以通過(guò)其它技術(shù)如用致瘤DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞、或者用Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生?？梢葬槍?duì)多種性質(zhì)篩選產(chǎn)生的單克隆抗體，即針對(duì)同種型和表位親和性篩選。另一種技術(shù)包括篩選噬菌體展示文庫(kù)，其中例如噬菌體表達(dá)其用大量不同的互補(bǔ)決定簇(CDR)包被的表面上的scFv片段。這種技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知。37對(duì)于本發(fā)明，除非特別指出，則術(shù)語(yǔ)"抗體"包括完整抗體的保留與靶抗原結(jié)合活性的片段。這種片段包括Fv、F(ab')和F(ab')2片段，以及單鏈抗體(scFv)。此外，所述抗體及其片段可以是人源化抗體，例如EP-A-239400所述。本發(fā)明的抗體可以與固體支持物結(jié)合和/或于合適容器中與合適的試劑、對(duì)照物、說(shuō)明書(shū)等一起包裝于試劑盒中。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是可檢測(cè)標(biāo)記的。使得可以直接測(cè)量抗體結(jié)合的可檢測(cè)的標(biāo)記包括放射性標(biāo)記、熒光團(tuán)、染料、磁珠、化學(xué)發(fā)光物、膠粒等。使得可以間接測(cè)量抗體結(jié)合的標(biāo)記的例子包括底物可以提供有色或熒光產(chǎn)物的酶?？蓹z測(cè)的標(biāo)記的其它例子包括在加入合適底物后能提供可檢測(cè)的產(chǎn)物信號(hào)的共價(jià)結(jié)合的酶。用于綴合的合適酶的例子包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、蘋(píng)果酸脫氫酶等。在不可商購(gòu)的情況中，這種抗體-酶綴合物易于通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的技術(shù)產(chǎn)生?？蓹z測(cè)的標(biāo)記的其它例子包括生物素，其與抗生物素蛋白或鏈霉親和素高親和性結(jié)合；熒光染料(例如藻膽蛋白、藻紅蛋白和別藻藍(lán)蛋白；熒光素和德克薩斯紅(Texasred))，其用與熒光激活的細(xì)胞淘選法一起使用；半抗原等。優(yōu)選地，所述可檢測(cè)的標(biāo)記使得可以在平板光度計(jì)中直接測(cè)量，例如生物素。這種標(biāo)記的抗體可用于本領(lǐng)域已知技術(shù)中以檢測(cè)本發(fā)明的多肽。微生物保藏詳述節(jié)桿菌.TBD于2006年4月11日保藏在澳大利亞國(guó)家測(cè)量機(jī)構(gòu)(NationalMeasurementInstitute),51-65ClarkeStreet,南墨爾本，Victoria3205，保藏號(hào)為V06/010960。該保藏物根據(jù)布達(dá)佩斯條約關(guān)于微生物的保藏的國(guó)際公約進(jìn)行保藏，用于專利程序中。這保證了培養(yǎng)物在保藏日起30年保持存活。所述微生物可根據(jù)布達(dá)佩斯條約通過(guò)國(guó)家測(cè)量機(jī)構(gòu)獲得，其保證公眾能在本專利公開(kāi)之后永久性并不受限制的獲得培養(yǎng)物的子代。本發(fā)明的受讓人同意，如果培養(yǎng)的保藏物在適當(dāng)條件下培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)死亡、丟失或損壞，將立即應(yīng)通知而用相同培養(yǎng)物的存活樣品進(jìn)行替換。保存的菌株的可得性不應(yīng)理解為允許侵犯任何政府根據(jù)其專利法授予的專利權(quán)而實(shí)施本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1-草甘膦降解細(xì)菌的分離材料和方法眾合激N-(膦酰甲基)甘氨酸(草甘膦)得自ICN或Sigma。所有其它分析試劑得自Sigma-Aldrich。薦養(yǎng)基除非另外指出，則無(wú)氮源的基本培養(yǎng)基包含M9鹽[6gNa2HP04、3gKH2P04、lgNaCl]、微量元素包括金屬離子和維生素、200nMMgCl2、200|iMCaCl2和1%葡萄糖作為碳源。享嫌A教鄉(xiāng)鄉(xiāng)分庸檢測(cè)多種土壤分離株和我們的實(shí)驗(yàn)菌株庫(kù)在液體培養(yǎng)中利用草甘膦作為中唯一氮源的能力。將分離株在合適的溫度下在富集營(yíng)養(yǎng)肉湯(Merck)或Luria肉湯(Sambrooketal.,1989)的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，然后在含有0.2%(11.8mM)草甘膦作為唯一氮源的基本培養(yǎng)基中稀釋至OD6QQnm為0.01。在具有SoftmaxPro讀板器(MolecularDevices)的彈性板(flexiplate)(BDBiosciences)中，通過(guò)測(cè)量200pL培養(yǎng)物的OD纖^評(píng)定生長(zhǎng)情況。節(jié)桿菌TBD的鑒別從節(jié)桿菌TBD中提取的基因組DNA和通用引物用于通過(guò)PCR擴(kuò)增16SrDNA，并對(duì)所得1.35kb產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。分析方法使用對(duì)如Tomita等(1991)(Column:C184.6uM，5人column.MobilePhase:0.2MK2HPO4、15%乙腈)所述方法加以修改的方法通過(guò)HPLC分析進(jìn)行草甘膦和AMP檢測(cè)。用對(duì)甲苯磺酰氯衍生化分析物，并在240nm波長(zhǎng)檢測(cè)。將lml反應(yīng)上清與0.5mL0.4MNaHPO4pH11.0混合，隨后加入200pL對(duì)甲苯磺酰氯溶液(于乙腈中的10mg/mLp-甲基苯磺酰氯[Sigma])。在5(TC保溫5分鐘后，將20pL過(guò)濾的反應(yīng)產(chǎn)物注射進(jìn)HPLC以進(jìn)行分析。結(jié)果從肥沃土壤及從我們的實(shí)驗(yàn)室殺蟲(chóng)劑降解微生物集合中鑒別了能利用草甘膦作為唯一氮源的一些細(xì)菌。發(fā)現(xiàn)包含于分離株節(jié)桿菌TBD中的降解細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中能使用草甘膦作為唯一氮源迅速生長(zhǎng)為匯合。全長(zhǎng)16SrDNA序列與核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)(RibosomalDataBank)(Coleetal.，2005)和BLAST(McGinnisandMadden，2004)的對(duì)比示出該細(xì)菌分離株與節(jié)桿菌菌株c138(Futamataetal.,2005)最相似，在測(cè)序的1.35kb16SrDNA基因上具有99.49%的核苷酸相同性。對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行的HPLC分析表明節(jié)桿菌TBD在72小時(shí)內(nèi)能除去培養(yǎng)基中70%(8.28mM)的草甘膦。實(shí)施例2-與節(jié)桿菌TBD的草甘膦降解活性相關(guān)的基因的分離材料和方法節(jié)桿菌TBD游基歷邀/)順文,游劍吝與饋透使用草甘膦作為唯一氮源培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞至飽和狀態(tài)，使用Ausubd等(wpra)所述方法從中提取基因組DNA。將基因組DNA用Sau3Al部分消化，并使用SamHI消化的pWEB::TNC(Epicentre)載體產(chǎn)生粘粒文庫(kù)。將該文庫(kù)轉(zhuǎn)化進(jìn)DH10B細(xì)胞中，篩選各個(gè)質(zhì)粒使用草甘膦作為唯一氮源在補(bǔ)加了溶液C的基本培養(yǎng)基中賦予生長(zhǎng)的能力。選擇陽(yáng)性克隆，然后在37"C振蕩生長(zhǎng)的lOmL培養(yǎng)物中證實(shí)使用草甘膦作為唯一氮源賦予生長(zhǎng)的能力。培養(yǎng)上清的成分通過(guò)HPLC分析以證實(shí)草甘膦從培養(yǎng)基中的除去。編碼G/oW游基茵游分庸將粘粒pWEB::A112用&oRl消化，并將產(chǎn)生的6個(gè)條帶亞克隆進(jìn)制備的載體pK18中。在載體制備期間，將pK18用五coRl(NEB)線性化，及根據(jù)廠商(Promega)指導(dǎo)用蝦堿性磷酸酶去磷酸化。如上述篩選來(lái)自粘粒的￡coRl片段的小文庫(kù)的活性，發(fā)現(xiàn)一個(gè)9kb的片段賦予大腸桿菌細(xì)胞以草甘膦降解活性。然后將這個(gè)構(gòu)建體的剪切片段的鳥(niǎo)槍(shotgun)文庫(kù)測(cè)序，至6倍覆蓋標(biāo)準(zhǔn)(AGRF，澳大利亞)。與核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的序列分析40和對(duì)比使用VectorNTIAdvance9.0(Informax,Invitrogen)和NCBIBLAST(Altschuletal.，1997,2004)進(jìn)行。關(guān)f游生激信I分析使用VectorNTIv.9(InformaxInc.USA;Invitrogen,Australia)和NCBIBlast(Altshuletal,1997)對(duì)序列數(shù)據(jù)和推定的氨基酸序列進(jìn)行分析、編譯、注釋及與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比。NCBIGenbank和保守的結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)CDD是用于對(duì)比的主要數(shù)據(jù)庫(kù)。結(jié)果編媽G/oW游基歷游分庸對(duì)來(lái)自節(jié)桿菌TBD的基因組DNA的粘粒文庫(kù)進(jìn)行篩選表明僅一個(gè)粘?？少x予利用草甘膦作為唯一氮源生長(zhǎng)的能力，將其稱作pWEB::A112。對(duì)來(lái)自這個(gè)構(gòu)建體的6個(gè)&oRl限制酶片段進(jìn)行篩選，草甘膦-降解活性位于構(gòu)建體pKWElC12中的9.5kb五coRl片段。這個(gè)9520bp區(qū)域的全部序列表明僅一個(gè)推定的蛋白質(zhì)具有裂解草甘膦的能力，是ORF9編碼的推定的氧化還原酶。將草甘膦降解蛋白稱作GloxA，將gfojG4亞克隆進(jìn)表達(dá)載體中并分析草甘膦降解活性，證實(shí)表達(dá)重組GloxA的細(xì)胞能降解草甘膦，靜息細(xì)胞生物催化測(cè)定表明300nmol/分鐘/mg/濕細(xì)胞重(wetcellmass)的草甘膦降解活性，粗制的酶提取物具有841)imol/分鐘/rng總蛋白的活性(表2)。重要的是在這個(gè)GloxA分析階段未檢測(cè)到作為產(chǎn)物的甘氨酸，推測(cè)其已經(jīng)由大腸桿菌靜息細(xì)胞中含有的其它酶及粗制酶提取物制品迅速代謝。表2:金屬離子和輔因子對(duì)于部分純化的重組GloxA酶活性的作用。粗比活性基于部分純化的提取物的整個(gè)蛋白質(zhì)濃度，且僅是一個(gè)大約值。催化活性((amol/分鐘/mg/濕菌體)草甘膦的去除甘氨酸的產(chǎn)生靜息細(xì)胞生物催化活性300-比活性(lamol/分鐘/mg蛋白質(zhì))草甘膦的去除甘氨酸的產(chǎn)生841-15905481450562838413GloxA是具有473個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQIDNO:l)，分子量為大約52.5kDa，推定的等電點(diǎn)為5.78，在pH7時(shí)電荷為大約11.61。其編碼序列以SEQIDNO:2示出。特別地，起始密碼子是GTG(編碼纈氨酸殘基)，其對(duì)于細(xì)菌基因較平常。起始Val由Met的取代不明顯改變?cè)撁傅牟莞熟⒔到饣钚?表3)。表3:來(lái)自由構(gòu)建體pKWElC12(GTG-Val起始密碼子)和pETGloxA2-4(ATG-Met起始密碼子)表達(dá)的重組蛋白的粗制酶活性對(duì)比<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>生認(rèn)息藩GloxA的推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:l)與天藍(lán)色鏈霉菌O^eptomycescoe//co/o^A3(登錄號(hào)CAA20218)的推定的氧化還原酶呈現(xiàn)56%的氨基酸序列相同性(72%相似性)。推測(cè)這個(gè)胺氧化酶黃素蛋白催化氨基酸以及伯胺和仲胺的氧化脫胺反應(yīng)，部分呈現(xiàn)單體肌氨酸氧化酶的底物特異性(M6rtleta1.,2004)。胺氧化酶無(wú)限定的代謝作用，但是示出對(duì)于具有低動(dòng)力學(xué)效率的小胺的廣泛底物特異性。實(shí)施例3-GloxA的酶活性材料和方法,定粗制酶提取物部分純化的酶提取物(PPE)PPE+FAD+Mg2+PPE-FAD+Mg2+PPE+FAD-Mg2+如下制備大腸桿菌細(xì)胞的粗制酶提取物。收獲細(xì)胞并將細(xì)胞團(tuán)再懸浮于lmL裂解緩沖液(25mMTris-ClpH7.5，具有l(wèi)mg/ml溶酶體)中，在冰上通過(guò)超聲裂解(Bransonsonifier，60%工作循環(huán)，開(kāi)30秒、關(guān)30秒，重復(fù)10次)。通過(guò)在5000g離心5分鐘收集可溶的成分，使用Biorad蛋白質(zhì)染料結(jié)合測(cè)定(BIORAD)測(cè)量蛋白質(zhì)含量。部分純化的提取物通過(guò)使用S-蛋白瓊脂糖(Novagen)TalonHIS-標(biāo)記純化系統(tǒng)(BDBiosciences),根據(jù)廠商指導(dǎo)從可溶的CFE中純化S-標(biāo)記的或HIS-標(biāo)記的GloxA蛋白而制備。使用在加樣緩沖液中的3MMgCl2或2.5mM咪唑從該柱中洗脫部分純的GloxA。制備酶反應(yīng)物，其含有在25mMTris-ClpH7.5、lmMFAD、0.1mMMgCl2中的500jiL粗制酶提取物或者250pL部分純化的酶提取物(l(Hig蛋白質(zhì)裂解物)。在37。C預(yù)保溫2分鐘后，向反應(yīng)物中加入lmM草甘膦，然后振蕩保溫10-60分鐘。在需要的反應(yīng)時(shí)間之后，如上述用對(duì)甲苯磺酰氯衍生化反應(yīng)物，并通過(guò)HPLC分析。所有酶測(cè)定均一式三份進(jìn)行并重復(fù)至少兩次以證實(shí)數(shù)據(jù)。為了確定明顯的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，在合適的范圍內(nèi)改變底物濃度，使用Kaleidagraph(SynergySoftware)或Hyper1.1(J.S.Easterby)使數(shù)據(jù)與指數(shù)等式總和一致。結(jié)果與大多數(shù)先前文獻(xiàn)中報(bào)道的結(jié)果相反，我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)GloxA從草甘膦中無(wú)AMPA產(chǎn)生。甘氨酸是從粗提物和部分純化的GloxA蛋白中檢測(cè)到的與草甘膦反應(yīng)的最豐富的產(chǎn)物。從這個(gè)結(jié)果及GloxA與其它氧化還原酶黃素蛋白的推定氨基酸序列的同源，我們推斷GloxA很可能使用氧化-還原機(jī)制裂解草甘膦的膦酰甲基C-3碳-氮鍵，產(chǎn)生甘氨酸和氧代膦酸。氧代膦酸在反應(yīng)上清中不可檢測(cè)到，而是預(yù)期其在水溶液條件下快速氧化。甘氨酸也是在假單胞菌菌株P(guān)G2982中發(fā)現(xiàn)的草甘膦裂解的終產(chǎn)物，這通過(guò)固態(tài)NMR分析細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)物(Kent-Mooreetal.，1983;Jacobetal.,1985;FitzgibbonandBraymer,1990)和假單胞菌菌株LBr(Jacobetal.，1988)而鑒別。也有報(bào)道節(jié)桿菌菌株GLP-10從草甘膦中產(chǎn)生甘氨酸，但是這通過(guò)C-P裂合酶多酶復(fù)合物裂解草甘膦中的C-P鍵而獲得，產(chǎn)生肌氨酸及隨后轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼?KishoreandJacob,1987)(見(jiàn)圖1)。C-P裂合酶反應(yīng)由復(fù)雜的膜結(jié)合的蛋白質(zhì)系統(tǒng)催化，該系統(tǒng)包含至少4個(gè)不同的蛋白質(zhì)(MetcalfandWanner,1993)，無(wú)一呈現(xiàn)與GloxA具有氨基酸相似性。因此，GloxA以無(wú)細(xì)胞方式將草甘膦裂解為甘氨酸的活性代表草甘膦裂解的一種新機(jī)制(圖2)。最大GloxA活性的精確反應(yīng)條件看起來(lái)包含金屬離子及可能應(yīng)用FAD作為輔因子，這基于當(dāng)不存在這兩種成分時(shí)的GloxA相對(duì)比活性而得出(表2)。部分純化的重組GloxA酶的底物范圍在表4中提供。顯然，GloxA也能裂解草胺膦，其是Basta，除草劑。_表4:部分純化的重組GloxA酶活性的底物范圍<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表5提供了與降解草甘膦和草胺膦的一些其它已知酶相比，GloxA對(duì)于這些化合物的酶活性的對(duì)比。在此條件下，當(dāng)與已知酶對(duì)比時(shí)，利用GloxA具有較好的草甘膦降解活性。表5:當(dāng)在植物中表達(dá)時(shí)，GloxA使用除草劑底物的表觀動(dòng)力學(xué)參數(shù)與已知賦予除草劑耐受性的其它酶的對(duì)比<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>Key:sevGAT/GOX-evolvedGAT(shuffling)/GOX(S固).-Blair-Kerth等(2001)2-Siehl等(2005)3-WO92/00377.上表2示出在測(cè)試的條件下，存在Mg^和FAD導(dǎo)致最高的活性。另外測(cè)試了二價(jià)金屬離子(表6)，在不存在金屬離子或FAD的條件下觀測(cè)到酶活性。當(dāng)與其它測(cè)試條件對(duì)比時(shí)，在反應(yīng)中加入0)2+導(dǎo)致最大活性。表6:金屬離子對(duì)于部分純化的酶活性的作用草甘膦的去除fimol/min/mgAStd(Mg2+)856B無(wú)FAD520C無(wú)金屬(+EDTA)432DZn2+624ECo2+1076實(shí)施例4-GloxA與GOX的對(duì)比材料和方法ZWAZWJ染文將基因組DNA、質(zhì)粒和粘粒構(gòu)建體用合適的限制酶完全消化，并使用如廠商所述堿性轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)移至HybondN+尼龍膜(Amersham,nowGEBiosciences)上o放射性標(biāo)記的探針通過(guò)不對(duì)稱PCR產(chǎn)生，使用30ng模板DNA(pLSGOX)，反應(yīng)物含有4pL5XExpandHiFidelityTM(Roche)緩沖液;12.5pmole反義引物(CG0X1B;ATGGCTGAGAACCACAAAAAAGTAG)(SEQIDNO:4);O.lpmole有義引物(CGOX2B;TTAACTTGCCGGACCCGTTTGCTTG)(SEQIDNO:5);200pM每禾中dTTP、dCTP、aGTP;5|uMdATP;0.33jaMa-32P-dATP(Amersham)禾口2UofExpandHiFidelityDNA聚合酶(Roche)。反應(yīng)在94。C進(jìn)行3分鐘，隨后進(jìn)行士n"FT，n、/A^》莊TX/n/ior^/i《壬/卜zoor/i《壬小"i。r1，n壬小、縣f^"7t，，。P叾7FJ由《>hi1乂v'1/曰,r、:7，i，Ji7、寸oi，j17、/厶iJV7i7乂，/ZL3^l干〕分鐘。所得放射性標(biāo)記的PCR產(chǎn)物使用QIAQuickDNA純化柱(Qiagen)純化，在30pL無(wú)菌水中洗脫。將膜在含有6xSSC、5xDenhardt，s溶液、0.1%焦磷酸鈉(NaPPi)、0.5%SDS的溶液中在65。C保溫(在Hybaid恒溫箱中)預(yù)雜交2小時(shí)，之后向雜交瓶中加入5pL(大約50^Ci)放射性標(biāo)記的探針。然后在65°C(嚴(yán)格條件)或42°C(低嚴(yán)格條件)使雜交繼續(xù)進(jìn)行過(guò)夜(18小時(shí))。如Ausubeletal(supra)所述進(jìn)行不同嚴(yán)格性的洗滌。為了在酶之間直接進(jìn)行對(duì)比，基于US5,776,760的SEQIDNO:17產(chǎn)生編碼GOX基因的合成的構(gòu)建體。將所述合成的構(gòu)建體從pLSGOX(Topgene,Canada)亞克隆進(jìn)表達(dá)載體pET29a(Novagen)的￡coRl位點(diǎn)，產(chǎn)生具有iV-末端S-標(biāo)記的酶。在不同溫度和IPTG條件下優(yōu)化GOX的可溶蛋白質(zhì)表達(dá)，GOX蛋白質(zhì)表達(dá)通過(guò)Coomasie-染色的SDS-PAGE分析檢測(cè)，GOX酶活性如上文針對(duì)GloxA所述測(cè)定，HPLC活性分析檢測(cè)草甘膦的去除和AMPA的產(chǎn)生情況。結(jié)果在獲得上述草甘膦降解構(gòu)建體的全部基因序列之前，分離的DNA與gox基因的同源性通過(guò)DNA:DNA雜交法檢測(cè)。所得southern印跡示出了在標(biāo)準(zhǔn)或非嚴(yán)格條件下所述DNA構(gòu)建體與gox基因之間無(wú)特異性可檢測(cè)的結(jié)合(圖3)。草甘膦氧化還原酶(GOX)是文獻(xiàn)報(bào)道的以一個(gè)酶步驟即可裂解草甘膦的唯一其它酶，據(jù)稱通過(guò)再氧化還原黃素以破壞草甘膦的C2-碳-氮鍵，產(chǎn)生AMPA和乙醛酸(WO92/00377;US5,776,760)，由此從草甘膦中產(chǎn)生AMPA。GOX變體v.247的比活性在US5,776,760中描述，其比15nmo1/46分鐘/mg的野生型GOX高3-4倍，表示大約60nmol/min/mg的活性。我們關(guān)于GloxA最初的粗制酶活性數(shù)據(jù)提示GloxA比GOX具有更高的比活性(表3，841jumol/分鐘/mg)。需要進(jìn)行直接對(duì)比以證實(shí)這個(gè)結(jié)果，因此以與GloxA變體相同的方式制備了合成的GOX構(gòu)建體的粗提物，并平行測(cè)定這兩種酶。在這些條件下，aw工扭樸眺rVilu、、壬臉lumvn^T7.古o乂立/網(wǎng)/i、/口旦trc八v^rf工；n;氨基二乙酸的活性相似(0.9倍，圖4)。WO92/00377與我們自己的數(shù)據(jù)之間的活性差異大概涉及幾個(gè)因素在我們的情況中所述酶僅部分純化，及使用的表達(dá)系統(tǒng)和條件不同。這兩種酶均呈現(xiàn)對(duì)于亞氨基二乙酸顯著較高的活性，且均產(chǎn)生甘氨酸和乙醛酸。這與GOX優(yōu)先裂解C2-碳-氮鍵及GloxA優(yōu)先裂解C3-碳-氮鍵的觀點(diǎn)一致，因?yàn)檫@兩個(gè)裂解反應(yīng)從亞氨基二乙酸中產(chǎn)生乙醛酸和甘氨酸(見(jiàn)圖2)。實(shí)施例5-GloxA與其它同源蛋白質(zhì)的對(duì)比材料和方法分別使用BLASTN和BLASTP(Altschuletal.,1997)，將GloxA核苷酸序列和氨基酸序列與非冗余核苷酸和蛋白質(zhì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比。然后表達(dá)選擇的推定的GloxA樣同源蛋白質(zhì)并測(cè)定草甘膦降解活性。選擇的推定的同系物的核苷酸編碼序列是商業(yè)合成的(Geneart,GmBH)、克隆及使用ChampionpET200D/TOPO.表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)根據(jù)廠商指導(dǎo)表達(dá)。重組蛋白質(zhì)表達(dá)通過(guò)考馬斯-染色的SDS-PAGE分析及使用Alphalmager2200觀測(cè)和記錄系統(tǒng)(AlphaInnotech)通過(guò)斑點(diǎn)密度測(cè)量法核實(shí)及量化。評(píng)定草甘膦降解的酶測(cè)定使用可溶的無(wú)細(xì)胞提取物(部分純化的蛋白質(zhì))于含有100嗎全部無(wú)細(xì)胞蛋白(lOpg酶提取物)、lmMMgCl2,在20mMTris-ClpH7.2中的lmM甘氨酸的lml體積中進(jìn)行。陰性對(duì)照物包括大腸桿菌BL21Star的無(wú)細(xì)胞提取物，不含有表達(dá)載體，而含有無(wú)插入體的pET200D/TOPO。結(jié)果47GloxA先前未被描述，但是與最近從金黃節(jié)桿菌TC1的完整基因組注釋中預(yù)測(cè)的推定的氧化還原酶蛋白最相似(86%氨基酸相同性；NCBI登記號(hào)no.CP000474.1)，且也共有胺氧化酶蛋白(CDDCOG0665)DadA家族的推定的保守蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。GloxA與非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的一些其它蛋白質(zhì)呈現(xiàn)蛋白質(zhì)序列相同性。同系物包括從份ev/6acten'ww//"eraBL2(NCBI登記號(hào)No.ZP—00381186)基因組注釋中預(yù)測(cè)的推定的甘氨酸氧化酶蛋白，已經(jīng)證實(shí)其也能裂解草甘膦產(chǎn)生甘氨酸(表7)。表7:GloxA與和GloxA具有顯著氨基酸相同性的蛋白質(zhì)的對(duì)比名稱來(lái)源NCBI登記號(hào)/參考與GloxA的氨基酸序列相同性百分比部分純化的活性草甘膦降解1(fimol/min/mg)GloxA節(jié)桿菌TBD本研究(SEQDNO:i;)100841GloxD金黃節(jié)桿菌TC1ABM06986(SEQIDNO:9)86ndGOBL擴(kuò)展短桿菌BL2ZP—00381186(SEQIDNO:8)60480IdaAEDTA-降解細(xì)菌BNC1Liueta1.，2001280實(shí)施例6-GloxA在J/Y^Vfop^中的表達(dá)編碼GloxA的DNA已經(jīng)針對(duì)植物表達(dá)而進(jìn)行優(yōu)化(SEQIDNO:6)。SEQIDNO:6提供的序列包括在5'和3'末端加入克隆位點(diǎn)以及在緊鄰起始密碼子之前加入AACA。所述編碼序列跨越SEQIDNO:6的16-1432位核苷酸。將編碼GloxA的DNA克隆進(jìn)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移載體p277(得自CSIROPlantIndustry,Canberra,Australia)。這個(gè)載體是通過(guò)將來(lái)自pART7的Notl片段插入pART27中而構(gòu)建(Gleave,1992)。所述p277載體含有針對(duì)植物表達(dá)的CaMV35S啟動(dòng)子和OCS終止子，針對(duì)抗生素選擇的標(biāo)記，及為植物轉(zhuǎn)化所需的序列。所述構(gòu)建體通過(guò)PCR合成，并將其直接克隆進(jìn)p277轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中。48使用三親交配法實(shí)現(xiàn)農(nóng)桿菌菌株GV3101的轉(zhuǎn)化。這種方法包括將根癌農(nóng)桿菌GV3101、攜帶輔助質(zhì)粒RK2013的大腸桿菌及攜帶希望的重組p277質(zhì)粒的大腸桿菌在非選擇性LB平板上共同劃線培養(yǎng)。在28。C保溫過(guò)夜后，獲得混合的培養(yǎng)物，收集該混合培養(yǎng)物并加以稀釋，于LB平板上劃線培養(yǎng)以選擇攜帶p277重組質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌GV3101。kra6Wo;^'s植物通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法在23。C每天18小時(shí)光照條件下培養(yǎng)。^ra6Wc^&植物的轉(zhuǎn)化通過(guò)浸花轉(zhuǎn)化法(floraldipping)進(jìn)行。將植物生長(zhǎng)至3-5周齡，此時(shí)植物具有代表不同發(fā)育節(jié)段的花的許多花莖。使轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌GV3101的過(guò)夜培養(yǎng)物成團(tuán)狀，再懸浮于含有增濕劑Silwet-77的5%蔗糖溶液中。將花浸入細(xì)菌懸浮液中，使用掃拂動(dòng)作將其徹底浸濕。將植物包裝在塑料膜中，在室溫于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上放置過(guò)夜，之后解除包裝并置于植物生長(zhǎng)箱中，維持在2rc。重復(fù)浸蘸l-2周，以增加轉(zhuǎn)化的種子的數(shù)目。在浸蘸3-4周后收集種子，對(duì)于每個(gè)生態(tài)型在種子包膜中干燥適當(dāng)時(shí)間，然后滅菌并于含有選擇性抗生素和抗真菌劑的Noble瓊脂平板上發(fā)芽。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體移植進(jìn)Arasystem罐(Betatech)中，在Aracon系統(tǒng)套筒(sleeves)內(nèi)生長(zhǎng)至成熟，小心收集種子。轉(zhuǎn)化的Jra6Wopw's植物(T1代)通過(guò)PCR和逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)篩選，以證實(shí)重組基因的存在與表達(dá)。從用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物的葉中提取物基因組DNA，使用Extract-N-AmpPlantPCR和Extract-N-AmpReagent試劑盒(Sigma)進(jìn)行。使用特異于GloxA編碼序列的引物對(duì)提取物進(jìn)行PCR。對(duì)于RT-PCR，隨機(jī)選擇大約8個(gè)用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物進(jìn)行分析。將這些植物的葉速凍并使用研缽和研杵于液氮中研磨。使用RNeasyPlant試劑盒(Qiagen)分離RNA。使用iScriptcDNA合成試劑盒(Bio-Rad)從所述RNA中制備cDNA。使用1picDNA、重組Taq聚合酶(Invitrogen)、54。C的退火溫度及GloxA特異性引物進(jìn)行PCR。將每種25|ilPCR反應(yīng)物的3pi反應(yīng)物在1.2%瓊脂糖凝膠上觀測(cè)。使用AppliedBiosystems7000實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行定量PCR，擬南芥管家基因araPTB(TAIR登記號(hào)AT3G01150)作為參考基因。選擇的卡那霉素抗性T2和T3植物表達(dá)GloxAmRNA，表達(dá)水平比參考基因高30-100倍(表8)。表8:擬南芥植物中GloxA表達(dá)的定量RT-PCR分析<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>L-er(野生型擬南芥)-5.03±0.144比PTB低32.7xGloxAT2#35.86±0.142比PTB高58.1xGloxAT2#45.50±0.175比PTB高45.3xGloxAT2#55.64±0.082比PTB高49.9xGloxAT2#66.29±0.145比PTB高78.2xGloxAT2#76.81±0.124比PTB高112.2xGloxAT2#85.94士0.184比PTB高61.4xGloxAT3#2e1.77±0.136比PTB高3.4x*Key:Ct-循環(huán)閾值；dCT-循環(huán)閾值差異(靶GloxA-參考araPTB).Tl秧苗可以移植及栽培，通過(guò)兩個(gè)世代獲得種子以最后分離純合T3種子。然后篩選T2和T3植物的草甘膦抗性的增加，基本上使用如Jander等(2003)所述方法進(jìn)行，但是使用擬南芥變種Landsberg而非Columbia,且處理劑量范圍是2.5-25kga丄ha"。在圖5中示出的分值是5倍預(yù)期I咖劑量(12.5kga丄ha-1)。也可以分析Tl-T3階段的轉(zhuǎn)基因植物的葉，通過(guò)提取總植物蛋白(例如使用PierceP-PER植物蛋白提取試劑盒)及使用Western印跡抗體檢測(cè)系統(tǒng)和酶提取測(cè)定評(píng)定植物細(xì)胞中GloxA蛋白表達(dá)。對(duì)于Western印跡分析，首先將植物提取物在20mMTris-ClpH7.2中稀釋10倍，然后通過(guò)BioradProteinDye(Biorad)量化。將等量的植物蛋白加樣于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠的每個(gè)孔中，通過(guò)電泳分離。然后使用Mini-Blot裝置(例如Biorad)根據(jù)廠商指導(dǎo)將蛋白質(zhì)印跡于硝化纖維膜上。根據(jù)WesternBreeze化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(Invitrogen)指導(dǎo)進(jìn)行免疫檢測(cè)，使用針對(duì)純化的重組GloxA蛋白制備的初級(jí)抗體進(jìn)行(例如純化的多克隆兔IgG，InstituteofVeterinaryandMedicalScience,Adelaide,Australia)。在表達(dá)GloxA的轉(zhuǎn)基因」ra6油戸、的葉細(xì)胞中檢測(cè)GloxA蛋白(圖5)，水平接近0.8ng/ug總蛋白質(zhì)。對(duì)轉(zhuǎn)基因植物蛋白質(zhì)提取物也針對(duì)GloxA活性進(jìn)行了測(cè)定，這通過(guò)組合100pg總蛋白(從Western印跡數(shù)據(jù)估計(jì)80ngGloxA)及25mMTris-ClpH7.2、0.1mMMgCl2進(jìn)行。在37。C預(yù)保溫2分鐘之后，向反應(yīng)中加入lmM草甘膦，然后進(jìn)一步振蕩保溫60-120分鐘。在需要的反應(yīng)時(shí)間之后，如上50述用對(duì)甲苯磺酰氯衍生化反應(yīng)，通過(guò)HPLC分析。所有酶測(cè)定均一式三份進(jìn)行并重復(fù)至少2次以證實(shí)數(shù)據(jù)。在表達(dá)GloxAmRNA(基于qPCR數(shù)據(jù))和蛋白質(zhì)(基于Western印跡數(shù)據(jù))的T2植物的葉中可以檢測(cè)到明顯的活性。表9:表達(dá)GloxA的擬南芥植物細(xì)胞中的GloxA活性樣品GloxA活性(fimol/min/mg)L-er(野生型擬南芥)0A^<3//a"aGloxAT2#3蛋白質(zhì)提取物77.8A^a//awaGloxAT2#4蛋白質(zhì)提取物79.1AGloxAT2#5蛋白質(zhì)提取物78.5用純化的GloxA-E2spikedL-er413.8純化的GloxA-E2(陽(yáng)性對(duì)照)497.5實(shí)施例7-表達(dá)GloxA的轉(zhuǎn)基因玉米的產(chǎn)生可以構(gòu)建嵌合基因，其包含相對(duì)玉米遍在蛋白啟動(dòng)子(EP342926)呈有義方向的編碼SEQIDNO:l的cDNA，位于cDNA片段的5'末端的所述啟動(dòng)子，及位于cDNA片段3'末端的10kD玉米蛋白。這個(gè)基因的cDNA片段可以通過(guò)使用合適的寡核苷酸引物對(duì)cDNA克隆進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)而產(chǎn)生?？寺∥稽c(diǎn)(分別為PdI和SmaI)可以摻入用于擴(kuò)增cDNA的寡核苷酸中，以當(dāng)插入消化的載體pML103(ATCC登錄號(hào)97366)中時(shí)提供DNA片段的正確方向。然后在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的DNA用合適的限制酶PciI和Smal消化，在瓊脂糖凝膠上分級(jí)分離。從凝膠中分離合適的條帶，與質(zhì)粒pML103組合。來(lái)自pML103的DNA節(jié)段含有使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用玉米遍在蛋白啟動(dòng)子置換的玉米27kD玉米蛋白基因的1.05kbSall-Ncol啟動(dòng)子片段，及載體pGem9Zf(+)(Promega)中玉米10kD玉米基因的3'末端的0.96kbSmal-Sall片段。載體和插入的DNA可以使用標(biāo)準(zhǔn)程序在15"C連接過(guò)夜。然后將連接的DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue(Stratagene)。細(xì)菌轉(zhuǎn)化體可以通過(guò)限制性消化質(zhì)粒DNA及使用二脫氧鏈終止方法分析限制的核苷酸序列而篩選。所得質(zhì)粒構(gòu)建體包含5'至3'方向的編碼玉米遍在蛋白玉米蛋白啟動(dòng)子的嵌合基因，編碼GloxA的cDNA及10kD玉米蛋白3，區(qū)域。然后通過(guò)如下程序?qū)⑸鲜銮逗匣驅(qū)胗衩准?xì)胞中。從玉米自交系H99與LH132的雜交獲得的發(fā)育中穎果中切割未成熟的玉米胚。在自花授粉后10-11天，當(dāng)其長(zhǎng)度達(dá)到1.0-1.5mm時(shí)，分離該胚。然后將該胚以莖軸(axis-side)向下放置，與瓊脂糖固化的N6培養(yǎng)基(Chuetal.，1975)接觸。將胚在黑暗中在27"C保持。易碎的胚發(fā)生愈傷組織由具有體細(xì)胞原胚未分化的細(xì)胞塊與從這些未成熟胚的盾片中增殖的胚柄結(jié)構(gòu)上的胚狀體組成。分離自原始外植體中的胚發(fā)生愈傷組織可以在N6培養(yǎng)基上培養(yǎng)，及在這個(gè)培養(yǎng)基上每2-3周傳代培養(yǎng)。粒子轟擊方法(Kleinetal.，1987)可用于將基因轉(zhuǎn)移至愈傷組織培養(yǎng)細(xì)胞。根據(jù)這種方法，使用如下技術(shù)將金粒(直徑liim)用DNA包被。將10嗎質(zhì)粒DNA加入50|aL金粒懸浮液(60mg/mL)中。向粒子中加入氯化鈣(50pL的2.5M溶液)和不含亞精胺的堿(20pL的1.0M溶液)。在加入這些溶液期間渦旋該懸浮液。10分鐘后，將該試管短暫離心(15,000rpm離心5秒鐘)，除去上清。將粒子再懸浮于200pL完全乙醇中，再次離心及除去上清。再次進(jìn)行乙醇漂洗，及將粒子再懸浮于終體積30pL乙醇中?？梢詫⒌确值?5HL)DNA-包被的金粒置于Kaptonflyingdisc(Bio-RadLabs)的中心。然后用BiolisticPDS-1000/He(Bio-RadInstruments,HerculesCalif.)將該粒子加速進(jìn)入玉米組織中，使用氦壓1000psi、間隔距離為0.5cm，飛行距離為1.0cm。對(duì)于轟擊而言，將胚發(fā)生組織置于瓊脂糖固化的N6培養(yǎng)基上的濾紙上。將該組織排列成薄層(thinlawn)，覆蓋直徑為大約5cm的圓形區(qū)域。將含有組織的培養(yǎng)皿置于PDS-1000/He室中，與停止篩(stoppingscreen)距離大約8cm。然后抽出室內(nèi)空氣至28英寸汞柱真空狀態(tài)。使用破裂膜利用氦沖擊波給大載體(macrocarrier)加速，所述破裂膜當(dāng)射擊管內(nèi)He壓力達(dá)到1000psi時(shí)破裂。在轟擊7天后，將組織移至含有草甘膦(2mg/L)的N6培養(yǎng)基中。2周之后，將組織移至含有草甘膦的新鮮N6培養(yǎng)基中。6周之后，在含有補(bǔ)加草甘膦的培養(yǎng)基的一些平板上可以鑒別出直徑為大約lcm的活躍生長(zhǎng)的愈傷組織。當(dāng)在選擇性培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)時(shí)，這些愈傷組織可以繼續(xù)生長(zhǎng)。通過(guò)首先將組織簇移至N6培養(yǎng)基，可以從轉(zhuǎn)基因的愈傷組織中再生植物。2周后，可以將組織移至再生培養(yǎng)基中(Frommetal.,1990)。實(shí)施例8-表達(dá)GloxA的轉(zhuǎn)基因大豆的產(chǎn)生一種表達(dá)盒可用于在轉(zhuǎn)化的大豆中快速酶的表達(dá)，所述表達(dá)盒由花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(Odelletal.,1985)和編碼腎豆(尸/^weo/wvw/gan'd的種子貯藏蛋白菜豆蛋白P亞基的基因的轉(zhuǎn)錄終止子組成?？梢允褂眠m當(dāng)?shù)墓押塑账嵋锿ㄟ^(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生編碼本發(fā)明酶的cDNA片段?？梢栽诠押塑账嶂袚饺肟寺∥稽c(diǎn)以當(dāng)插入表達(dá)載體中時(shí)提供DNA片段的正確方向。然后如上述進(jìn)行擴(kuò)增，分離的片段插入攜帶表達(dá)盒的pUC18載體中。然后將大豆胚用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。為了誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，可以將從無(wú)菌表面切下的3-5mm長(zhǎng)度的子葉、大豆栽培種A2872的不成熟的種子在26。C在合適的瓊脂培養(yǎng)基上在光亮或黑暗中培養(yǎng)6-10周。然后切離產(chǎn)生次生胚狀體的體細(xì)胞胚，置于合適的液體培養(yǎng)基中。在重復(fù)選擇繁殖為早期球狀胚階段的體細(xì)胞胚之后，如下所述保持懸浮。大豆胚發(fā)生懸浮液可以在于35mL液體培養(yǎng)基中在26'C在150rpm旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器上保持，用熒光燈以16:8小時(shí)白天/黑夜光照。每2周將培養(yǎng)物傳代培養(yǎng)一次，通過(guò)將大約35mg的組織接種于35mL液體培養(yǎng)基中而進(jìn)行。然后，可以通過(guò)基因槍轟擊方法(U.S.4,945,050)轉(zhuǎn)化大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物。DuPontBiolisticPDS1000/HE儀器(氦循環(huán)(heliumretrofit))可用于進(jìn)行這些轉(zhuǎn)化?？捎糜诖龠M(jìn)大豆轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記基因是嵌合基因，由花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子、質(zhì)粒pJR225(來(lái)自大腸桿菌)的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因及根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的T-DNA的胭脂堿合酶基因的3'區(qū)域組成。該表達(dá)盒可以作為限制片段分離。然后可以將這個(gè)片段插入攜帶標(biāo)記基因的載體的唯一限制位點(diǎn)中。向50|aL的60mg/mLlpm金粒懸浮液中按順序加入如下材料5DNA(l|ig/pL)、20^1亞精胺(0.1M)禾卩50iaLCaCl2(2.5M)。然后將該粒子制品攪拌3分鐘，在微型離心機(jī)上旋轉(zhuǎn)10秒鐘，除去上清。將DNA包被的粒子在400liL70。/。乙醇中洗滌一次，并再懸浮于40iaL無(wú)水乙醇中?？?3以對(duì)DNA/粒子懸浮液進(jìn)行超聲處理3次，每次1秒鐘。然后將5|aLDNA包被的金粒加樣于每個(gè)大載體盤(pán)(macrocarrierdisk)中。將大約300-400mg的2周齡的懸浮培養(yǎng)物置于空的60X15mm培養(yǎng)皿中，用移液管從組織中除去剩余的液體。對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，通常轟擊大約5-10個(gè)平板的組織。膜破裂壓設(shè)為1100psi，室內(nèi)保持28英寸(inches)汞柱真空狀態(tài)。將組織置于與保留篩大約3.5英寸的位置，轟擊三次。在轟擊之后，將組織分成兩半，如上述置于液體培養(yǎng)基中及培養(yǎng)。在轟擊后5-7天，用新鮮培養(yǎng)基更換所述液體培養(yǎng)基，在轟擊后11-12天，用含有50mg/mL潮霉素的新鮮培養(yǎng)基更換原有培養(yǎng)基。這種選擇性培養(yǎng)基可以每周更新一次。在轟擊后7-8周，可以觀測(cè)到從未轉(zhuǎn)化的壞死胚發(fā)生組織中生長(zhǎng)出幼年(green)轉(zhuǎn)化的組織。取出分離的幼年組織，接種于各個(gè)培養(yǎng)瓶中以產(chǎn)生新的無(wú)性繁殖的轉(zhuǎn)化的胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物。每個(gè)新的品系可以作為獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件進(jìn)行處理。然后可以將這些懸浮液傳代培養(yǎng)及作為不成熟胚保持，或者通過(guò)使各個(gè)體細(xì)胞胚成熟和發(fā)芽再生為完整植物。檢測(cè)植物暴露于草甘膦時(shí)的生長(zhǎng)能力。實(shí)施例9-表達(dá)GloxA的轉(zhuǎn)基因棉花的產(chǎn)生為了在棉花中產(chǎn)生GloxA，可以將本發(fā)明的編碼序列與地三葉草矮化病毒啟動(dòng)子(S7;WO96/06932)可操縱地連接。將嵌合基因與選擇標(biāo)記基因可操縱地連接并導(dǎo)入T-DNA載體中。使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化棉花植物。通過(guò)將候選的轉(zhuǎn)化體暴露于草甘膦而鑒別轉(zhuǎn)基因的棉花品系。實(shí)施例10-表達(dá)GloxA的轉(zhuǎn)基因小麥的產(chǎn)生為了在小麥中產(chǎn)生GloxA，將包含SEQIDNO:6所示核苷酸序列的多核苷酸亞克隆進(jìn)pPlex載體(Schunmannetal.,2003)中，由此地三葉草矮化病毒啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)小麥細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄。根據(jù)Pellegrineschi等(2002)所述方法對(duì)栽培種Bobwhite26的小麥胚進(jìn)行轉(zhuǎn)化。為了證實(shí)產(chǎn)生的植物含有所述構(gòu)建體，使用FastDNA⑧試劑盒(B10101Inc.,Vista,California,USA)根據(jù)廠商指導(dǎo)對(duì)從植物葉中提取的基因組54DNA進(jìn)行PCR分析。將DNA在100|al無(wú)菌去離子水中洗脫，并將1|al用于PCR中。檢測(cè)植物暴露于草甘膦時(shí)的生長(zhǎng)能力。實(shí)施例11-表達(dá)GloxA的轉(zhuǎn)基因油菜的產(chǎn)生在5cm栽培罐中建立歐洲油菜(5rasw'M"apz^)的秧苗。將其在24°C、16/8小時(shí)光照周期條件下于生長(zhǎng)室中生長(zhǎng)。2.5周后，將其移至15cm栽培罐中，在15A0。C白天/夜間溫度、16/小時(shí)光照周期條件下于生長(zhǎng)室中生長(zhǎng)。在即將抽苔之前或者在抽苔過(guò)程中但是在開(kāi)花之前，從植物中取4個(gè)末端節(jié)間段，將其在70Q/。v/v乙醇中表面滅菌l分鐘，在2。/。w/v次氯酸鈉中滅菌20分鐘，及用無(wú)菌去離子水漂洗3次。在滅菌之前，可以將附著葉的莖在潮濕的塑料袋中冷卻直至72小時(shí)。將6-7個(gè)莖段切成5mm圓片，保持底端方向。將表達(dá)SEQIDNO:6的農(nóng)桿菌在24'C于旋轉(zhuǎn)器上在含有50mg/1卡那霉素、24mg/1氯霉素和100mg/l壯觀霉素的2mlsLuria肉湯中生長(zhǎng)過(guò)夜。制備大約9xl()S個(gè)細(xì)胞/ml的1:10稀釋液。在660pm讀數(shù)光密度證實(shí)該結(jié)果。用l.Oml農(nóng)桿菌接種莖盤(pán)(外植體)，從該外植體中吸出過(guò)量液體。將外植體向下置于含有1/10x標(biāo)準(zhǔn)MS鹽、維生素B5、3%蔗糖、0.8%瓊脂、pH5.7、1.0mg/16-芐基腺嘌呤(BA)的培養(yǎng)平板的底部。在平板上鋪一層含有MS鹽、維生素B5、3%蔗糖、pH5.7、4.0mg/1p-氯苯氧基乙酸、0.005mg/i激動(dòng)素的1.5ml培養(yǎng)基，并用無(wú)菌濾紙覆蓋。在2-3天共培養(yǎng)之后，將外植體移至含有MS鹽、維生素B5、3%蔗糖、0.8%瓊脂、pH5.7、lmg/lBA、500mg/1羧節(jié)青霉素、50mg/1頭孢噻月虧、200mg/1卡那霉素或者175mg/l慶大霉素的深培養(yǎng)平板中進(jìn)行選擇。每個(gè)平板放置7個(gè)外植體。3周后，將其移至新鮮培養(yǎng)基中，每個(gè)平板5個(gè)外植體。將該外植體在生長(zhǎng)室中在25。C持續(xù)光照(Co01White)下培養(yǎng)。檢測(cè)植物暴露于草甘膦時(shí)的生長(zhǎng)能力。實(shí)施例12-表達(dá)GloxA的轉(zhuǎn)基因大麥的產(chǎn)生55為了在大麥中產(chǎn)生GloxA，將包含SEQIDNO:6所示核苷酸序列的多核苷酸亞克隆進(jìn)pPlex載體(Schunmannetal.，2003)中，由此地三葉草矮化病毒啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)大麥細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄。根據(jù)Pdlegrineschi等(2002)所述方法對(duì)大麥胚進(jìn)行轉(zhuǎn)化。為了證實(shí)產(chǎn)生的植物含有所述構(gòu)建體，使用FastDNA⑧試劑盒(B10101Inc.，Vista，California,USA)根據(jù)廠商指導(dǎo)對(duì)從植物葉中提取的基因組DNA進(jìn)行PCR分析。將DNA在100^U無(wú)菌去離子水中洗脫，并將lpl用于PCR中。檢測(cè)植物暴露于草甘膦時(shí)的生長(zhǎng)能力。本發(fā)明技術(shù)人員意識(shí)到在不偏離經(jīng)充分描述的本發(fā)明精神和范圍的前提下，可以對(duì)如特異實(shí)施方案所示的本發(fā)明進(jìn)行多種改動(dòng)和/或修改。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案只是舉例說(shuō)明了本發(fā)明而無(wú)限制之意。本文論述和引用所有出版物均以其全部?jī)?nèi)容并入本文作參考。本申請(qǐng)要求US60/747,151的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容并入本文作參考。本說(shuō)明書(shū)中包含的關(guān)于文獻(xiàn)、文章、材料、裝置、商品等的所有論述均只是針對(duì)本發(fā)明的目的而論。不應(yīng)因?yàn)槠湓诒景l(fā)明優(yōu)先權(quán)日之前存在而理解為任何或所有這些構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)的一部分或者是本領(lǐng)域中的常識(shí)。'箭-區(qū)乙￡.P舊'兩,d(9661).IBPiqzcra.89I乙I寸9in:乙9乙.瓜3iD'p舊.jf(厶861)qoo可pireaioqs!^'0M-9IC:外'I0，，.iddv(￡861)'IBl39扁w，x8S6Z-￡S6::17S.兩。j，，!八113.iddy(8861)7pqoo可'S06S-668S:01'm叫C)'io舊'f(S86I)，Pqoo可"I-UI:98I'兩.io!qoj，s兩d(000。，ps"bh'乙8-9A:911omp9io!gspuai丄'(8661)Biu"mBH'8"陽(yáng)K3:SI'細(xì)IP3兩w(S66I)'IBP,o6￡s_9￡s:k^o阿八("61)ppui，d'0厶，-S9l7:Wsuo卩。m3iuiibo^oio舊-ibc^ui9iq'(6661)'PPuopjo。H-O)n:0乙'兩'兩,d(乙661)織qo卞乙:乙sj9ipiwtniro9tiss!工iirewPmmqfry'II6卞06:IA10!qojonAI'ucu!au3'lddv(S00Z)'PP瑪Burein^j'￡88陽(yáng)￡￡8:8^o網(wǎng)。3丄/o!g(0661)，Pui謹(jǐn)j'88￡￡-斑￡:95，qcxi，篇!八u3.iddy(0661)環(huán)如gpireuoqq!gzi!j卞I9-809:9s3nb!uip9io舊(8861)Psp^SgKI-Z>I:￡'J叫工'u3。'uitiH(乙661)P19pn3'96乙Gt-t76乙a:Onssi9s叫bibq)hS9丑sp!oy3pionN(s00乙)？p9p3.891-"1:0乙.萍u兩.u!io(￡661)dcfei。,899-6S9:81加ppd.u!spsP'"9-B9:SI'd^jn90iUBi(i(9661)'PP3u叫3'88t7-6At7:乙ZIR)(0861)!1p39dB3'08￡-SA￡:6t7sp"叢(100。，Pip^^-j用gHl7-z￡l7:IS'lo!qo^!PVu0j!Au3.iddy(9861)sbiphp朋joz叫iiBg'乙0K-68EC:S乙-s^jsp卩v卩nN(厶661)，Pimpsiiv'厶80I:17^010uipsio舊(9861).Pp甲u(yù)npqv<formula>formulaseeoriginaldocumentpage58</formula>Vasil(1996)Phosphinothricin—resistantcrops./"Duke,S.O.,ed.，/ec/zm.ca/aspedCRCPressInc.,BocaRaton,Florida,USA.pp.85-93.Wackettetal,(1987)J.Bacteriol.169:710-717.Wanner(1994)PhosphateregulatedgenesfortheutilizationophosphonatesinthemembersofthefamilyEnterobacteriaciae.In:PhosphateinMicroorgansims.Eds.Torrigiani-Gorini,A.,Yagil,E.andSilver,S.pp.13-21.ASMpress.WashingtonD.C.Wagneretal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6099-6103.WhiteandMetcalf(2004)J.Bacteriol.186:4730-4739.Yakolevaetal.(1998)Appl.Microbiol.Biotechnol.49:573-578.59權(quán)利要求1.一種基本上純化的多肽，其裂解草甘膦產(chǎn)生甘氨酸。2.—種基本上純化的多肽，其裂解草甘膦的膦酰甲基C-3碳-氮鍵。3.權(quán)利要求1或2的多肽，其包含單氨基酸鏈。4.權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽是可溶的。5.權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)的多肽，其中草甘膦的裂解基本上不產(chǎn)生乙醛酸。6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的多肽，其中草甘膦的裂解基本上不產(chǎn)生肌氨酸。7.—種基本上純化的多肽，其具有比GOX(SEQIDNO:3)高的裂解草甘膦的效率。8.—種基本上純化的多肽，其具有大于550)nmol/min/mg的裂解草甘膦的比活性。9.一種基本上純化的多肽，其包含選自下組的序列i)SEQIDNO:1所示氨基酸序列，ii)與i)至少25。/。相同的氨基酸序列，其中所述多肽裂解含胺除草劑。10.權(quán)利要求9的多肽，其中所述含胺除草劑是草甘膦或草胺膦。11.權(quán)利要求9或10的多肽，其中所述多肽包含與SEQIDNO:l至少60%相同的氨基酸序列。12.權(quán)利要求9或10的多肽，其中所述多肽包含與SEQIDNO:l至少90%相同的氨基酸序列。13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽可以純化自節(jié)桿菌菌種。14.權(quán)利要求13的多肽，其中所述節(jié)桿菌菌種是節(jié)桿菌TBD(y4w/zn6ac^s/.TBD)。15.權(quán)利要求l-14任一項(xiàng)的多肽，其與至少一種其它多肽融合。16.—種分離的多核苷酸，其包含具有選自下組的序列的核苷酸i)SEQIDNO:2，ii)編碼權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列，iii)與i)至少25。/。相同的核苷酸序列，iv)在低嚴(yán)格條件下與i)雜交的核苷酸序列，V)與i)-iv)互補(bǔ)的核苷酸序列。17.權(quán)利要求16的多核苷酸，其編碼裂解含胺除草劑的多肽。18.權(quán)利要求17的多核苷酸，其中所述含胺除草劑是草甘膦或草胺膦。19.權(quán)利要求16-18任一項(xiàng)的多核苷酸，其包含在嚴(yán)格條件下與i)雜交的序列。20.—種重組多核苷酸，包含在植物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子與編碼權(quán)利要求1_15任一項(xiàng)的多肽的結(jié)構(gòu)DNA序列可操縱地連接，所述結(jié)構(gòu)DNA序列與在所述細(xì)胞中起作用的3'聚腺苷酸化序列可操縱地連接，其中所述啟動(dòng)子與所述結(jié)構(gòu)DNA序列是異源的且能表達(dá)所述結(jié)構(gòu)DNA序列，以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)于含胺除草劑的抗性。21.包含權(quán)利要求16-20任一項(xiàng)的多核苷酸的載體。22.權(quán)利要求21的載體，其中所述多核苷酸與啟動(dòng)子可操縱地連接。23.包含至少一種權(quán)利要求16-20任一項(xiàng)的多核苷酸和/或至少一種權(quán)利要求21或22的載體的宿主細(xì)胞。24.權(quán)利要求23的宿主細(xì)胞，其是植物細(xì)胞。25.—種重組細(xì)胞，其裂解草甘膦并產(chǎn)生甘氨酸。26.—種包含導(dǎo)入的多肽的重組細(xì)胞，所述多肽裂解草甘膦的膦酰甲基C-3碳-氮鍵。27.—種制備權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的多肽的方法，所述方法包括在使得編碼所述多肽的多核苷酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)編碼所述多肽的權(quán)利要求23的宿主細(xì)胞或者編碼所述多肽的權(quán)利要求22的載體，并回收表達(dá)的多肽。28.使用權(quán)利要求27的方法產(chǎn)生的多肽。29.—種特異性結(jié)合權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的多肽的分離的抗體。30.—種組合物，其包含至少一種權(quán)利要求l-15任一項(xiàng)的多肽、至少一種權(quán)利要求16-20任一項(xiàng)的多核苷酸、權(quán)利要求21或22的載體、權(quán)利要求23或24的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求25或26的重組細(xì)胞和/或權(quán)利要求29的抗體，及一或多種可接受的載體。31.—種裂解含胺除草劑的組合物，所述組合物包含至少一種權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的多肽及一或多種可接受的載體。32.權(quán)利要求30或31的組合物，其進(jìn)一步包含金屬離子。33.權(quán)利要求32的組合物，其中所述金屬離子是Co2+、Z,和/或Mg2+。34.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的多肽或者編碼所述多肽的多核苷酸作為選擇標(biāo)記在檢測(cè)和/或選擇重組細(xì)胞中的應(yīng)用。35.—種檢測(cè)重組細(xì)胞的方法，所述方法包括i)將細(xì)胞或細(xì)胞群與編碼權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的多肽的多核苷酸在使得所述多核苷酸被所述細(xì)胞攝取的條件下接觸，及ii)通過(guò)將得自步驟i)的細(xì)胞或其子代細(xì)胞暴露于含胺除草劑，從而選擇重組細(xì)胞。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述多核苷酸包含編碼權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的多肽的第一個(gè)開(kāi)放讀框，及不編碼權(quán)利要求l-15任一項(xiàng)的多肽的第二個(gè)開(kāi)放讀框。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述第二個(gè)開(kāi)放讀框編碼多肽。38.權(quán)利要求36的方法，其中所述第二個(gè)開(kāi)放讀框編碼不翻譯的多核苷酸。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述不翻譯的多核苷酸編碼催化性核酸、dsRNA分子或反義分子。40.權(quán)利要求35-39任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。42.權(quán)利要求35-41任一項(xiàng)的方法，其中所述含胺除草劑是草甘膦或草43.—種裂解含胺除草劑的方法，所述方法包括將所述含胺除草劑與權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的多肽接觸。44.權(quán)利要求43的方法，其中所述多肽是由權(quán)利要求23或24的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的。45.—種包含外源多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物，所述多核苷酸編碼至少一種權(quán)利要求l-15任一項(xiàng)的多肽。46.權(quán)利要求45的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述多肽至少在所述轉(zhuǎn)基因植物的氣生部分中產(chǎn)生。47.權(quán)利要求45或46的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述多核苷酸被穩(wěn)定摻入所述植物的基因組中。48.—種產(chǎn)生對(duì)于含胺除草劑的抗性增強(qiáng)的植物的方法，所述方法包括如下步驟a)向植物細(xì)胞的基因組中插入如下多核苷酸，所述多核苷酸包含在植物細(xì)胞中起作用導(dǎo)致RNA序列產(chǎn)生的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子可操縱地連接至以下結(jié)構(gòu)DNA序列；導(dǎo)致編碼權(quán)利要求l-15任一項(xiàng)的多肽的RNA序列產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)DNA序列，所述結(jié)構(gòu)DNA序列可操縱地連接至以下3'非翻譯區(qū)；3'非翻譯區(qū)，其在植物細(xì)胞中起作用導(dǎo)致在所述RNA序列的3'末端添加聚腺苷酸化核苷酸；其中所述啟動(dòng)子與所述結(jié)構(gòu)DNA是異源的且適于引起所述多肽的足夠表達(dá)，以增強(qiáng)用所述DNA分子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞對(duì)于含胺除草劑的抗性；b)獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；c)從所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的植物，其對(duì)于含胺除草劑的抗性增強(qiáng)。49.使用權(quán)利要求48的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。50.—種裂解樣品中含胺除草劑的方法，所述方法包括將所述樣品暴露于權(quán)利要求45-47或49任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物。51.權(quán)利要求50的方法，其中所述樣品是土壤。52.—種包含外源多核苷酸的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，所述多核苷酸編碼至少一種權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的多肽。53.—種分離的節(jié)桿菌菌株，于2006年4月11日保藏在澳大利亞全國(guó)測(cè)量學(xué)院，保藏號(hào)為V06/010960。54.—種裂解含胺除草劑的組合物，所述組合物包含權(quán)利要求53的菌株及一或多種可接受的載體。55.以下物質(zhì)的提取物權(quán)利要求23或24的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求25或26的重組細(xì)胞、權(quán)利要求45-47或49任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物、權(quán)利要求52的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物、或者權(quán)利要求53的菌株，其包含權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的多肽。56.—種裂解含胺除草劑的組合物，所述組合物包含權(quán)利要求55的提取物及一或多種可接受的載體。57.—種裂解含胺除草劑的方法，所述方法包括將含胺除草劑暴露于權(quán)利要求53的菌株和/或權(quán)利要求55的提取物。58.—種分離的細(xì)菌，其產(chǎn)生權(quán)利要求l-15任一項(xiàng)的多肽。59.權(quán)利要求58的細(xì)菌，其是節(jié)桿菌。60.—種產(chǎn)生權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的多肽的分離的天然存在的細(xì)菌在裂解含胺除草劑中的應(yīng)用。61.—種用于裂解含胺除草劑的聚合的海綿或泡沫，所述泡沫或海綿包含固定于聚合的多孔支持物上的權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的多肽。62.—種裂解含胺除草劑的方法，所述方法包括將含胺除草劑暴露于權(quán)利要求61的海綿或泡沫。63.—種從權(quán)利要求45-47或49任一項(xiàng)的植物中產(chǎn)生的產(chǎn)品。64.權(quán)利要求45-47或49任一項(xiàng)的植物的部分。65.權(quán)利要求64的植物的部分，其是種子。66.—種產(chǎn)生具有增強(qiáng)的裂解含胺除草劑能力的多肽的方法，所述方法包括(i)改變權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的第一多肽的一或多個(gè)氨基酸，(ii)確定得自步驟(i)的改變的多肽裂解含胺除草劑的能力，及(iii)選擇當(dāng)與該第一多肽對(duì)比時(shí)具有增強(qiáng)的裂解含胺除草劑能力的改變的多肽。67.通過(guò)權(quán)利要求66的方法產(chǎn)生的多肽。68.—種篩選能裂解含胺除草劑的微生物的方法，所述方法包括i)在存在含胺除草劑作為唯一氮源的條件下培養(yǎng)候選微生物，及ii)確定所述微生物是否能生長(zhǎng)和/或分裂。69.—種試劑盒，其包含至少一種權(quán)利要求1-15、28或67任一項(xiàng)的多肽、至少一種權(quán)利要求16-20任一項(xiàng)的多核苷酸、權(quán)利要求21或22的載體、權(quán)利要求23或24的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求25或26的重組細(xì)胞、權(quán)利要求29的抗體、權(quán)利要求30-33、54或56任一項(xiàng)的組合物、至少一種權(quán)利要求53的菌株、至少一種權(quán)利要求55的提取物、至少一種權(quán)利要求58或59的細(xì)菌、至少一種權(quán)利要求61的聚合的海綿或泡沫、至少一種權(quán)利要求63的產(chǎn)品，和/或至少一種權(quán)利要求64或65的部分。全文摘要本發(fā)明涉及一種新型酶以及編碼這些酶的多核苷酸，所述酶能降解含胺除草劑如草甘膦和草胺膦。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生這些酶的轉(zhuǎn)基因植物，其對(duì)于含胺除草劑活性具有抗性。另外，本發(fā)明提供了依賴于這種新型酶活性的生物修復(fù)方法。文檔編號(hào)C07K14/305GK101484463SQ200780025660公開(kāi)日2009年7月15日申請(qǐng)日期2007年5月11日優(yōu)先權(quán)日2006年5月12日發(fā)明者C·J·哈特利,J·G·奧克肖特,L·J·布里格斯,M·R·威廉斯,R·J·魯賽爾,S·J·德里安申請(qǐng)人:聯(lián)邦科學(xué)技術(shù)研究組織;糧食研究發(fā)展公司