專利名稱：：在咖啡中編碼類苯基丙烷途徑酶的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明尤其描述來(lái)自咖啡植物的多核苷酸，其編碼類苯基丙烷(phenylpropanoid)途徑中涉及的導(dǎo)致綠原酸合成的酶，本發(fā)明也涉及這些多核苷酸用于對(duì)咖啡豆的香味、香氣和其他特征進(jìn)行基因調(diào)節(jié)和操作的方法，以及防止咖啡植物患病和氧化脅迫的方法。
背景技術(shù)：
：在本說(shuō)明書中引用了多種出版物，包括專利、公開的應(yīng)用和學(xué)術(shù)文獻(xiàn)。各出版物在此處以其整體引用作為參考。在說(shuō)明書中沒(méi)有完全闡明的在說(shuō)明書末尾列出。對(duì)于消費(fèi)者優(yōu)選的咖啡品種和品牌，關(guān)鍵成份是咖啡的香氣和香味?？Х鹊奶卣餍韵銡夂拖阄秮?lái)源于烘焙咖啡豆的過(guò)程中出現(xiàn)的涉及香味前體的一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)(麥拉德反應(yīng)(Maillardreaction))。香味前體包括在綠色咖啡豆中存在的化學(xué)化合物和生物分子。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大于800種化學(xué)和生物分子對(duì)于咖啡的香p未和香氣有所貢獻(xiàn)(Flament，I.2002CVj^eF/tfvrrC^e附is外J'Wiley，U.K.)。由于咖啡消費(fèi)者越來(lái)越精益求精，因此希望生產(chǎn)具有改良的香氣和香味的咖啡，從而適應(yīng)消費(fèi)者的選擇。香氣和香味都可以通過(guò)化學(xué)方法人為地傳遞到咖啡產(chǎn)品中去。見例如美國(guó)專利號(hào)4，072,761(香氣)和美國(guó)專利號(hào)3,962,321(香味)。然而，迄今為止僅有很少的關(guān)于影響咖啡香氣和香味的天然咖啡粒成分(例如多糖、蛋白質(zhì)、色素和脂類)的信息。一種方法是從現(xiàn)存種質(zhì)中選擇具有高級(jí)香味特征的變種。此途徑的一個(gè)缺點(diǎn)是最高品質(zhì)的變種通常也帶有顯著的負(fù)面農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)性狀，例如低產(chǎn)量和對(duì)于疾病和環(huán)境脅迫的低抗性。也可以從育種試驗(yàn)中選擇新的變種，其中具有不同工業(yè)和農(nóng)藝性狀的變種之間進(jìn)行雜交，在它們的子代中篩選高品質(zhì)和好的農(nóng)藝學(xué)性能。然而，后一途徑非常費(fèi)時(shí)，一個(gè)雜交試驗(yàn)和超過(guò)三個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)的篩選最少需要7-8年。因此，可選擇的提高咖啡品質(zhì)的途徑是利用分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)增強(qiáng)在咖啡豆中天然存在的負(fù)責(zé)香味和香氣的元素，或者增加非天然存在于咖啡豆中的香氣和香味增強(qiáng)元素?；蚬こ烫貏e適合于實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)。例如，可以交換不同咖啡品種中的咖啡蛋白質(zhì)?？蛇x擇地，可以提高編碼對(duì)咖啡香味有積極貢獻(xiàn)的天然存在咖啡蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)。相反，可以抑制編碼對(duì)咖啡香味不利的天然存在咖啡蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)。當(dāng)用同樣方法烘焙和加工綠色顆粒樣品時(shí)，不同變種和來(lái)源的咖啡展現(xiàn)顯著的香味和香氣品質(zhì)的變化。品質(zhì)的差異是在顆粒樣品中化學(xué)的和物理的明顯變化，其主要由不同的生長(zhǎng)和加工條件及母本植物和顆粒的不同的遺傳背景所導(dǎo)致。在化學(xué)組合物的水平上，至少部分香味品質(zhì)可以與小的代謝產(chǎn)物的水平相關(guān)聯(lián)，例如發(fā)現(xiàn)糖、酸、酚類和咖啡因與不同變體的顆粒相關(guān)。公認(rèn)有其他未充分表征的香味和香味前體分子。另外，可能顆粒中結(jié)構(gòu)的變化也導(dǎo)致咖啡品質(zhì)的差異。發(fā)現(xiàn)咖啡粒中與咖啡品質(zhì)有關(guān)的成分的一個(gè)途徑是研究在具有不同品質(zhì)特征的不同變種的顆粒樣品成熟過(guò)程中差異表達(dá)的基因和蛋白質(zhì)。同樣，可以研究參與香味和香味前體分子生物合成的基因和蛋白質(zhì)。綠原酸是備選香味和香味前體分子的實(shí)例。綠原酸(CGA)是在綠色咖啡粒中發(fā)現(xiàn)的一組重要的非揮發(fā)性化合物。CGA由某些反式肉桂酸(咖啡酸和阿魏酸)和套尼酸之間形成的酯類家族組成(Clifford等人，2000)。在咖啡豆中，多數(shù)CGA可以被歸類為3類之一綠原酸(CQA;3-CQA，4-CQA和5-CQA);二咖啡酰查尼酸(diCQA;3，4-diCQA，3，5-diCQA和4,5-diCQA);和阿魏酰查尼酸(FQA)。在成熟的綠色咖啡粒中，CGA水平是可變的，在卡尼福拉咖啡(Oy^"c朋印/^m)(羅巴斯特種(robusta))中占干物質(zhì)成分(DMB)的大約7.88%到14.4%,在阿拉比卡咖啡(0/^fl爿mWoi)中占DMB的大約3.4%到4.8%(Ky等人，2001)。Clifford提出CGA含量在卡尼福拉咖啡中占DMB的7%到10%，而在阿拉比卡咖啡中占DMB的5%到7.5%(Clifford等人，1985)。在卡尼福拉咖啡中，估計(jì)總CGA含量的67%由CQA組成，約20%由diCQA組成，和約13%由FQA組成。在阿拉比卡咖啡中，CQA、diCQA和FQA分別相應(yīng)于總CGA含量的平均80、15和5。/。(Ky等人，2001)。對(duì)于在植物中合成CGA的早期類苯基丙烷途徑已有很多了解。(Dixon，R.和Paiva，N.1995PlantCell7，1085-1097;Douglas,CJ.1996TrendsPlantSci.，l171-178)。此生物合成途徑的概況在圖1中概述(Hoffmann等人，2004)。第一步涉及苯丙氨酸通過(guò)苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)轉(zhuǎn)變?yōu)槿夤鹚?。在擬南芥中已經(jīng)表征了4個(gè)不同的PAL基因，并且那些基因可以歸為兩個(gè)不同的組(Raes，J等人2003，PlantPhysiology133,1051-1071)。不同的PAL亞型的表達(dá)和活性代表植物初級(jí)和次級(jí)代謝之間的主要分支點(diǎn)，這樣，不同PAL亞型在復(fù)雜的調(diào)節(jié)控制下。(Dixon,R.和Paiva，N.1995PlantCell7，1085-1097;Rohde，A"等人2004PlantCell,16p2749-2771)。此途徑中的另一種酶是反式肉桂酸酯-4-羥化酶(C4H)(登錄號(hào)BAA24355;CYP73A5擬南芥)，其將肉桂酸轉(zhuǎn)換成(對(duì))-香豆酸。迄今為止，在擬南芥中僅發(fā)現(xiàn)此類P450-依賴的單氧化酶的一個(gè)基因，而在一些其他植物中發(fā)現(xiàn)歸為兩個(gè)不同類別的兩個(gè)或更多的C4H基因(Reas等人，2003)。此途徑的下一個(gè)步驟是由4-香豆酸酯:輔酶連接酶(4CL)執(zhí)行的。在擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)至少4個(gè)4CL基因和9個(gè)4CL類基因(Raes等人，2003)。4CL可在輔酶A和酚類化合物(例如(對(duì))-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、5-羥基阿魏酸和芥子酸)之間形成酯類(Hu等人，1998)。雖然在類苯基丙烷途徑的早期部分中涉及的酶已經(jīng)為人們所認(rèn)知幾年了，但是僅在最近才純化出在接下來(lái)的步驟中所需要的?；D(zhuǎn)移酶，羥基肉桂酰-輔酶A轉(zhuǎn)移酶(HCT)(煙草)和羥基肉桂酰-輔酶A奎尼酸酯羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(HQT)(來(lái)自番茄和煙草)，并且克隆和研究了相應(yīng)的DNA序列(Hoffmann等人2003J.BiolChem278，95-103;Niggeweg等人20048,22，746-754)。這些酶催化(對(duì))-香豆酰-輔酶A或咖啡酰-輔酶A與莽草酸酯或奎尼酸酯之間的酯類形成，從而產(chǎn)生CGA。HCT也可以催化逆向反應(yīng)，即CGA降解(Hoffmann等人，2003)。在擬南芥中只有一個(gè)基因(HCT)編碼此步驟中的酶(Raes等人，2003)。僅在最近才闡明了類苯基丙烷途徑的下一個(gè)步驟，即香豆酸酯第3位點(diǎn)的羥基化作用。Schoch等人發(fā)現(xiàn)一種擬南芥P450蛋白質(zhì)(CYP98A3)能夠使香豆酸酯第3位點(diǎn)羥基化，但是僅在其被酯化為莽草酸酯或奎尼酸酯的情況下(2001J.BiolChem276，36566-36574)。在擬南芥基因組中鑒定出3個(gè)基因編碼該酶，即(對(duì))-香豆酸酯3-羥化酶(C3H)。然而，Raes等人(2003)發(fā)現(xiàn)這些基因中只有一個(gè)(C3H1)在所有檢驗(yàn)的組織中表達(dá)，而另外兩個(gè)基因僅在有限數(shù)目的組織中和在發(fā)育的特定時(shí)間表達(dá)。類苯基丙烷途徑的現(xiàn)有模型(圖l)提示HCT/HQT的正向和反向活性具有調(diào)控木質(zhì)素前體水平的作用，并且由此影響在植物中形成的木質(zhì)素的量和類型。在C3H介導(dǎo)的羥基化作用之后，通過(guò)HCT/HQT從咖啡?？崴峄蚩Х弱ＣР菟嶂嗅尫趴Х弱?輔酶A，然后在活性咖啡酰-輔酶A3-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT)的作用下形成阿魏酰輔酶A(Zhang和Chinnappa1997J.Biosci.22，161-175;Zhong等人1998.PlantCell10，2033-2046)。CCoAOMT也可以使5-幾基阿魏酰-輔酶A甲基化形成芥子酰-輔酶A(Zhong等人，1998)。在擬南芥中有7個(gè)推定的CCoAOMT基因，而在其他植物中存在兩類CCoAOMT基因(Zhong等人1998;Raes等人2003)。目前在煙草中3個(gè)不同的CCoAOMT類已經(jīng)被表征(Maury等人1999)。第1類CCoAOMT基因包括僅在擬南芥中表征的CCoAOMT基因(CCoAOMT-l)，和在多數(shù)其他植物中表征的CCoAOMT基因。剩余的推定CCoAOMT基因歸于第2類(Raes等人，2003)。擬南芥CCoAOMT誦l是表達(dá)量最高的基因，在所有檢驗(yàn)的組織中都能檢測(cè)到其表達(dá)；也能在所有組織中檢測(cè)到擬南芥CCoAOMT-5和CCoAOMT-7的較低表達(dá)，而在特異性組織中可以檢測(cè)到CCoAOMT-2、-3、-4和-6的低表達(dá)(Raes等人，2003)。由于其相對(duì)高的普遍表達(dá)，擬南芥CCoAOMT-1和其在其他植物中可能的直向同源物被認(rèn)為在與細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的木質(zhì)化過(guò)程中起主要作用(Raes等人，2003)。最初，關(guān)于類苯基丙烷途徑的許多研究集中于理解用于黃酮類、花青素、不同形式木質(zhì)素的前體合成的全部通量，和如何調(diào)節(jié)該途徑。然而，由于越來(lái)越多的證據(jù)表明富含抗氧化劑的飲食可以通過(guò)對(duì)氧化脅迫的防御而減少癌癥和退行性疾病的風(fēng)險(xiǎn)(Bazzano，L.等人2002;Astley，S.，2003)，最近的研究認(rèn)為存在高水平的類苯基丙烷途徑的中間代謝產(chǎn)物，并具有高抗氧化劑活性(Hoffmann等人2004，Niggeweg等人2004)。例如，綠原酸構(gòu)成植物性食品(例如蘋果、梨、蕃茄、馬鈴薯和茄子，以及綠色和烘焙的咖啡粒(豆))中重要的抗氧化劑類。事實(shí)上可以通過(guò)消耗植物性食物而最好地完成^L食攝取CGA，除此之外，此類分子也顯示顯著的生物利用度(Nardini等人，2002，丄AgricFoodChem.50，57355741;Couteau等人，2001,J.AppliedMicrobiol.90，873-881;Clifford,M.2004，PlantaMed70，1103-1114)。已經(jīng)直接證明在植物減少氧化脅迫中涉及CGA。例如，Shadle等人(2003)證明在煙草中過(guò)表達(dá)負(fù)責(zé)CGA生物合成第一步的PAL酶會(huì)導(dǎo)致CGA含量相對(duì)于野生型植物增加約5倍，并且證明可以抵抗真菌病原體尾孑包真菌(Omw/wflwi'cW朋fle)。Niggeweg等人(加(M)通過(guò)在蕃茄中使用組成型啟動(dòng)子pX358啟動(dòng)子)來(lái)過(guò)量生產(chǎn)HQT的研究提出另外的證據(jù)。其證明在CGA合成中直接相關(guān)的酶HQT的水平越高，CGA的水平就越高，從而提高對(duì)氧化脅迫的抵抗力，和增加植物對(duì)微生物病原體的抗性。人們逐漸認(rèn)識(shí)到飲食的CGA在血漿抗氧化劑庫(kù)中可能的重要作用，并且一種或多種CGA類型的分子可能轉(zhuǎn)化為新的或附加的具有促進(jìn)健康活性的代謝產(chǎn)物(例如見Clifford，2004)。而且，很明顯CGA在植物對(duì)疾病的抗性中發(fā)揮作用。因此，需要更好的了解和促進(jìn)植物中這些化合物的合成和累積。綠原酸在咖啡中含量豐富。盡管此類分子對(duì)于植物和人類的健康、以及咖啡的香味、香氣和品質(zhì)具有重要作用，但是分析咖啡中類苯基丙烷途徑的研究還很少，而且對(duì)于咖啡中CGA的可利用的數(shù)據(jù)也有限。Campa等人鑒定了推定CCoAOMT的部分序列(登錄號(hào)AF534905)(Campa等人，2003)，并繪制了該序列在咖啡基因組中的圖鐠。另外，發(fā)現(xiàn)鑒定的該基因的兩條等位基因之一與綠原酸的整體水平相關(guān)。Bauman等人分離了編碼咖啡PAL的兩個(gè)部分cDNA序列(登錄號(hào)AAF27655和AAF27654)，且Campa等人分離了編碼PALI(登錄號(hào)AAN32866)和PAL2(登錄號(hào)AAN32867)的兩個(gè)cDNA序列。用ClustalW將相應(yīng)4個(gè)蛋白質(zhì)的重疊區(qū)域進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這4個(gè)序列高度相關(guān)，在蛋白質(zhì)水平具有94-99.5%的預(yù)測(cè)同一性，且在核苷酸水平具有大于97.1%的同一性。此同一性水平提示這4個(gè)序列可能代表單一的咖啡PAL。在咖啡烘焙過(guò)程中，綠原酸進(jìn)行性降解(DeMaria等人，1995)。事實(shí)上，這些改變代表在此過(guò)程中出現(xiàn)的重要組成性改變之一(Bicchi等人，1995)。有報(bào)道表明每1。/。干物質(zhì)的喪失伴隨CGA含量喪失超過(guò)8-10%。(Clifford等人，1985，1998)。在烘焙過(guò)程中，CGA轉(zhuǎn)化成一系列揮發(fā)性和非揮發(fā)性的化合物(S.Homma，2001)。例如，異構(gòu)化作用和水解作用會(huì)導(dǎo)致多種奎尼酸和奎尼內(nèi)酯、及肉桂酸的產(chǎn)生(Homma，2001)，后者進(jìn)一步通過(guò)脫羧作用降解為一系列酚類化合物，包括揮發(fā)性化合物例如4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，其與通常的咖啡香氣相關(guān)(Homma2001，F(xiàn)arah等人，2005;和RizziG等人,1993"Flavorchemistrybasedonthethermally-induceddecarboxylationofp-hydroxycinnamicacids.InFoodFlavors,IngredientsandComposition(Charalambous編輯)第663-670頁(yè)ElsevierSciencePublishers,Amsterdam,Netherlands)。、CGA的降解產(chǎn)物，尤其是綠原酸內(nèi)酯和奎尼酸內(nèi)酯的形成，與釀造咖啡的苦味相關(guān)，咖啡釀造后的酸度增加與游離奎尼酸的產(chǎn)生有關(guān)(Homma，2001，Leloup等人，1995;和Buffo等人，2004)。最近，Muller和Hofmann發(fā)現(xiàn)綠原酸和它們的熱降解產(chǎn)物可作為巰基結(jié)合位點(diǎn)(2005,J.Agric和BiolChem53，2623-2629)。因?yàn)楹瑤€基的化合物(例如2-糠基硫醇和3-曱基-2-丁烯-1-硫醇)是咖啡香氣的重要組成部分，已經(jīng)提出綠原酸和相關(guān)化合物與咖啡々大料中的香氣化合物反應(yīng)，其在釀造之后有效地減少咖啡的香氣(Muller和Hofmann，2005)。盡管很清楚咖啡中的綠原酸影響香氣，但是仍然不確定是否所有的綠原酸都具有同等的作用。因此需要產(chǎn)生其CGA鐠具有清楚差別的確定的咖啡變體。選擇具有不同鐠的咖啡變體有兩種不同的途徑。第一種是使用經(jīng)典的育種和選擇，有關(guān)CGA生物合成途徑的遺傳信息可以顯著地輔助此途徑。此信息可以鑒定主基因的等位基因，和隨后的育種材料和子代。第二種通用的途徑是直接改變CGA合成過(guò)程中涉及的特異性主基因。此途徑可以通過(guò)誘變和篩選(TILLING)，或通過(guò)使用基因克隆和咖啡轉(zhuǎn)化來(lái)改變特異性基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。隨后以它們的綠原酸降解產(chǎn)物的含量和烘焙后的香味i普來(lái)評(píng)估來(lái)自這些新的非-GMO、或GMO變體的具有改變的CGA傳的顆粒。然后選擇那些具有更高級(jí)的香味和其他特征的顆粒進(jìn)一步研究?？Х攘Ｖ芯G原酸含量的增加會(huì)導(dǎo)致烘焙過(guò)程中涉及香氣的CGA-衍生揮發(fā)物的增加。因此，在咖啡粒中通過(guò)對(duì)負(fù)責(zé)CGA生物合成的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生進(jìn)行基因調(diào)控從而調(diào)控CGA含量，是提高由此類基因工程咖啡豆所生產(chǎn)的咖啡飲料和咖啡產(chǎn)品的香氣的一種新方法。在咖啡豆中CGA含量的增加也可能有利于由此類咖啡豆所生產(chǎn)的咖啡々欠料和產(chǎn)品的消費(fèi)者的整體健康。另外，調(diào)節(jié)咖啡植物中的CGA含量也有利于咖啡植物的整體健康和疾病抵抗力。由于這些理由，就需要分離咖啡CGA生物合成途徑中的多核苷酸和多肽，并發(fā)展利用這些分子用于一個(gè)或多個(gè)上述目的的方法。發(fā)明概述本發(fā)明在此處描述編碼咖啡植物中導(dǎo)致綠原酸生物合成的類苯基丙烷途徑中的酶的基因，它們編碼的多肽，和這些多核苷酸和多肽用于對(duì)咖啡豆的香味、香氣和其他特征進(jìn)行基因調(diào)節(jié)和操作的方法。本發(fā)明一方面描述從某種咖啡(Oy^fl印/k)中分離的核酸分子，其含有一個(gè)編碼類苯基丙烷途徑酶的編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，此類酶是羥基肉桂酰-輔酶A莽草酸酯/套尼酸酯羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶，該酶與SEQIDNO:9或SEQIDNO:10至少有86.9。/。的同一性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此類酶是羥基肉桂酰-輔酶A奎尼酸酯羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶，該酶與SEQIDNO:ll或SEQIDNO:12至少有78.1%的同一性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此類酶是(對(duì))-香豆酰3，羥化酶，該酶與SEQIDNO:13至少有82.9%的同一性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該酶是咖啡酰-輔酶A3-氧位-曱基轉(zhuǎn)移酶，其與SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:16至少有86.3%的同一性。在某個(gè)實(shí)施方案中，核酸分子是具有開放讀碼框的基因，其包含編碼序列。可選擇地，其可以包含該基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA分子，或mRNA分子通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA分子。本發(fā)明也描述長(zhǎng)度在8-100堿基之間的寡核苷酸，其與上述核酸分子的片段互補(bǔ)。本發(fā)明的另一方面描述包含上述編碼類苯基丙烷途徑酶的核酸分子的載體。在特定實(shí)施方案中，載體是選自質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、桿狀病毒、桿粒、細(xì)菌、酵母和病毒載體的表達(dá)載體。在特定實(shí)施方案中，載體包含有效連接于組成型啟動(dòng)子的核酸分子的編碼序列。在其他實(shí)施方案中，編碼序列有效連接于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在其他實(shí)施方案中，核酸分子的編碼序列有效連接于組織特異型啟動(dòng)子，例如種子特異型啟動(dòng)子，優(yōu)選咖啡種子特異性啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是植物、細(xì)菌、真菌、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在特定實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是選自咖啡、煙草、擬南芥、玉米、小麥、稻、大豆、大麥、黑麥、燕麥、高粱、苜蓿、三葉草、油菜、紅花、向曰葵、花生、可可、番茄特梅提諾(tomatotomatillo)、馬鈴薯、胡椒、茄子、甜菜、胡蘿卜、黃瓜、萵苣、豌豆、紫菀、秋海裳、菊、翠雀草(delphinium)、百日草(zinnia)和草碎草中任一種的植物細(xì)胞。本發(fā)明也描述由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生所產(chǎn)生的可育轉(zhuǎn)基因植物。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，可育轉(zhuǎn)基因植物是咖啡種。本發(fā)明的另一方面描述調(diào)控咖啡豆的香p木或香氣的方法。i玄方法包括在咖啡種子中調(diào)控一種或多種類苯基丙烷途徑酶的產(chǎn)生。在某些實(shí)施方案中，該方法包括增加一種或多種類苯基丙烷途徑酶的產(chǎn)生，例如通過(guò)在咖啡種子中增加編碼一種或多種內(nèi)源類苯基丙烷途徑酶的基因的表達(dá)，或通過(guò)向植物中引入編碼類苯基丙烷途徑酶的轉(zhuǎn)基因。在其他實(shí)施方案中，該方法包括降低一種或多種類苯基丙烷途徑酶的產(chǎn)生，例如通過(guò)向咖啡中引入核酸分子從而抑制編碼一種或多種類苯基丙烷途徑酶的基因的表達(dá)。參考如下附圖、詳細(xì)說(shuō)明和實(shí)施例將幫助理解本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)。附圖概述圖1.類苯基丙烷途徑。該植物的類苯基丙烷途徑的表示是來(lái)自Hoffman等人，2004的修改版。PAL,苯丙氨酸脫氨酶；C4H，肉桂酸酯4-羥化酶；4CL,4-羥基肉桂酰-輔酶A連接酶；HCT，羥基肉桂酰-輔酶A莽草酸酯/奎尼酸鹽羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶；HQT，羥基肉桂酰-輔酶A奎尼酸鹽羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶；C3H，(對(duì))-香豆酸酯3-羥化酶；CCoAOMT，咖啡酰-輔酶A氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶；CAD，肉桂醇脫氫酶；CCR，肉桂酰-輔酶A還原酶；COMTI，咖啡^/5-羥基阿魏酸氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶；F5H，阿魏酸5-羥化酶；SAD，芥子醇脫氫酶。圖2.來(lái)自卡尼福拉咖啡的CcHCT完全ORF的分離和表征。A)包含卡尼福拉咖啡的/TCT完全ORF的cDNA的分離。獲得兩個(gè)覆蓋Cc好CT完全ORF的cDNA克隆，即含有卡尼福拉咖啡好CT的5'端的5，RACE產(chǎn)物(Race1—Cc及CT)(SEQIDNO:17)和含有該基因剩余3，端的部分cDNA克隆pcccwc22wl4m23(SEQIDNO:18)(見實(shí)施例中的方法)。用這些序列來(lái)設(shè)計(jì)新的引物從卡尼福拉咖啡BP409cDNA(顆粒，黃色期)中以PCR擴(kuò)增1388bp的片段(pMLl中的Cc好CT)(SEQIDNO:l)。5，非翻譯區(qū)以深黑色條顯示，ORF區(qū)域以陰影線條顯示，并標(biāo)出翻譯起始(ATG)和終止(TGA)密碼子。3，非翻譯區(qū)以淺黑色線顯示。B)pMLl的插入序列(SEQIDNO:l)與cDNA序列pcccwc22wl4m23(SEQIDNO:18)和Racel—CcHCT(SEQIDNO:17)進(jìn)行比對(duì)。用CLUSTALW程序(Lasergenepackage,14DNASTAR)和手動(dòng)優(yōu)化進(jìn)行比對(duì)。標(biāo)記為灰色的核酸與pMLl(Cc^TT)插入序列(SEQIDNO:l)相匹配。圖3.來(lái)自阿拉比卡咖啡的CaHCT完全ORF的分離和表征。A)包含阿拉比卡咖啡的HCT完全ORF的cDNA的分離。獲得編碼阿拉比卡咖啡HCT5，端的基因組DNA片段(GW1—C"i7Cr)(SEQIDNO:19)(見實(shí)施例中的方法)，其包含與卡尼福拉咖啡HCTcDNApcccwc22wl4m23(SEQIDNO:18)重疊的部分。獲得的阿拉比卡咖啡基因組序列與5'端引物序列HCT-FullUpl(SEQIDNO:50)幾乎完全匹配，因此用該引物與CcHCT-Rl從阿拉比卡咖啡T2308cDNA(顆粒黃色期)中以PCR擴(kuò)增1388bp的片段(pML5中的Oi/TCT)(SEQIDNO:2)。5，非翻譯區(qū)以深黑色條顯示，ORF區(qū)域以陰影線條顯示，并標(biāo)出翻譯起始(ATG)和終止(TGA)密碼子。3，非翻譯區(qū)以淺黑色線顯示?；蚪M區(qū)域以深灰色線顯示。值得注意的是該基因的5，非翻譯區(qū)的主要部分還沒(méi)有確定。B)用CLUSTALW程序和手動(dòng)優(yōu)化將pML5的插入序列與阿拉比卡咖啡基因組序列GW1_C"HCT(SEQIDNO:19)和卡尼福拉咖啡cDNA序列pcccwc22wl4m23(SEQIDNO:18)進(jìn)行比對(duì)。標(biāo)記為灰色的核酸與pML5(Cfl好C7)(SEQIDNO:2)插入序列相匹配。圖4.CcHCT、CaHCT、CcHQT和CaHQT與其他植物的HCT和HQT的蛋白質(zhì)序列比對(duì)。用CLUSTALW(Lasergenepackage,DNASTAR)將Cc好CT(SEQIDNO:9)、C"i7CT(SEQIDNO:10)、OJfgr(SEQIDNO:ll)和Cc^2r(SEQIDNO:12)基因編碼的蛋白質(zhì)序列與其他從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的HCT和HQT蛋白質(zhì)進(jìn)行比對(duì)。標(biāo)記為灰色的氨基酸表示最常見的殘基。列出基因名，并在括號(hào)中給出登陸號(hào)。NtHCT(煙草(Mcotianatabacum),CAD47830(SEQIDNO:20))、AtHCT(擬南芥，NP_199704(SEQIDNO:21))、IbHCBT(甘薯(/;w附ea辦a,atos)，BAA87043.1(SEQIDNO:22))、NtHQT(煙草，CAE46932.1(SEQIDNO:23))和LeHQT(食用番癡(Z^o/7erwVwi^cn/ew似柳)，CAE46933.1(SEQIDNO:24))。綠色和藍(lán)色的盒表示保守的氨基酸殘基，分別為HXXXD(SEQIDNO:25)和DFGWG(SEQIDNO:26)。在pML3蛋白質(zhì)序列的272位點(diǎn)劃圏的X代表由pML3插入序列編碼的終止密碼子。但是，如在實(shí)施例6中所確定的，該終止密碼子在PCR步驟被插入，因?yàn)榛蚪M序列在該位點(diǎn)編碼的是谷氨酰胺。圖5.來(lái)自卡尼福拉咖啡的CcHQT完全ORF的分離和表征。A)包含卡尼福拉咖啡的CcHQT完全ORF的cDNA的分離。獲得兩個(gè)覆蓋CcHQT完全ORF的cDNA片段(Race3—Cci7gr(SEQIDNO:27)和pcccs30wl3p12(SEQIDNO:28))(見實(shí)施例中的方法)。用這些序列來(lái)設(shè)計(jì)引物從卡尼福拉咖啡BP409(果皮，低綠色期)中以PCR擴(kuò)增1534bp的片段(pML2中的CcHQT)(SEQIDNO:3)。蛋白質(zhì)編碼區(qū)域以陰影線條顯示，并標(biāo)出翻譯起始(ATG)和終止(TGA)密碼子。3，非翻譯區(qū)以淺黑色線顯示。標(biāo)志與圖2和3中相同。B)pML2的插入序列與cDNA序列Race3—OrHgr(SEQIDNO:27)和pcccs30wl3p12(SEQIDNO:28)進(jìn)行比對(duì)。用CLUSTALW程序(Lasergenepackage,DNASTAR)和手動(dòng)優(yōu)化進(jìn)行比對(duì)。標(biāo)記為灰色的核酸與pML2(CdygJ)插入序列(SEQIDNO:3)相匹配。圖6.來(lái)自阿拉比卡咖啡的CaHQT完全ORF的分離和表征。A)包含阿拉比卡咖啡的編碼CaHQT完全ORF的cDNA的分離。獲得編碼阿拉比卡咖啡HQT5'端的5，RACEcDNA片段(Race2C"^27)(SEQIDNO:29)。先前用于CcHQTPCR擴(kuò)增的引物HQT-FullUp2(SEQIDNO:52)和HQT-FullLow2(SEQIDNO:53)也可成功用于從阿拉比卡咖啡T2308cDNA(全花)中以PCR擴(kuò)增1533bp的片段(pML3中的CaHQT)(SEQIDNO:4)。標(biāo)志與圖2和3中一致。B)pML3的插入序列(SEQIDNO:4)與阿拉比卡咖啡cDNA序列Race2j:"/T0r(SEQIDNO:29)和卡尼福拉咖啡序列pcccs30wl3p12(SEQIDNO:28)進(jìn)行比對(duì)。用CLUSTALW程序和手動(dòng)優(yōu)化進(jìn)行比對(duì)。標(biāo)記為灰色的核酸與pML3(Cfl好g7)序列(SEQIDNO:4)相匹配。正如正文和圖4的圖注中所述，劃圏的堿基顯示pML3(SEQIDNO:4)的ORF中的終止密碼子。圖7.CcC3H與其他植物C3H蛋白質(zhì)序列的比對(duì)。由CcCH(在pcccl20d10(SEQIDNO:5)中)編碼的蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:13)與在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的其他高度相關(guān)C3H蛋白質(zhì)用CLUSTALW進(jìn)行比對(duì)(注這些蛋白質(zhì)是CYP相關(guān)蛋白質(zhì)，因此擬南芥蛋白質(zhì)最初為AtCYP)。標(biāo)記為灰色的氨基酸是CcC3H序列(SEQIDNO:13)。AtCYP(擬南芥22203)(SEQIDNO:30)、ObC3H(羅勒(Od附"柳6"w7/cw附)，AAL99201)(SEQIDNO:31)、推定的LeC3H(食用番茄，TC163965(TIGR番茄基因索引注釋)(SEQIDNO:32))。圖8.在卡尼福拉咖啡(羅巴斯特種，BP409)和阿拉比卡咖啡(阿拉比卡(arabica)，T2308)中HQT、HCT、C3H、CCoAOMTl、CCoAOMT2和CCoAOMT3的定量表達(dá)分析。如方法中所述，各基因的表達(dá)用TaqMan特異性探針進(jìn)行定量RT-PCR來(lái)確定。各組織樣品的RQ值通過(guò)將測(cè)試基因轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)于所分析的樣品中廣泛表達(dá)的rpl39基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行均一化來(lái)確定。顯示的數(shù)據(jù)代表各樣品3次擴(kuò)增反應(yīng)獲得的平均值，誤差線表示SD。圖9.來(lái)自阿拉比卡咖啡的CaCCoAOMT-Ll(pNT8)的完全ORF的分離和表征。A)包含阿拉比卡咖啡的CCoAOMT-Ll(SEQIDNO:7)完全ORF的cDNA的分離。從卡尼福拉咖啡(顆粒，黃色期)獲得一個(gè)cDNA片段(Racel—CcCCoAOMT-Ll)(SEQIDNO:33),其覆蓋全部卡尼福拉咖啡CCoAOMT-Ll(SEQIDNO:7)的ORF的5，端(見實(shí)施例中的方法)。物CCoAOMT-Ll-FullUp(SEQIDNO:56)和CCoAOMT-LlFullLow(SEQIDNO:57)，從阿拉比卡咖啡T2308(顆粒，黃色期)中擴(kuò)增含有完全ORF(pNT8中的CaCCoAOMT-Ll)(SEQIDNO:7)的片段。標(biāo)志與圖2和3中一致。B)用CLUSTALW程序和手動(dòng)優(yōu)化將pNT8的插入序列(SEQIDNO:7)與cDNA序列Racel—CcCG^(9iWT-Ll(SEQIDNO:33)和pcccs30w29k18(SEQIDNO:34)進(jìn)行比對(duì)。標(biāo)記為灰色的堿基與該位點(diǎn)最經(jīng)常出現(xiàn)的堿基相匹配。圖10.來(lái)自卡尼福拉咖啡的CcCCoAOMT-L2(pNT4)完全ORF的分離和表征。A)包含阿拉比卡咖啡的CCoAOMT-L2的完全ORF(SEQIDNO:8)的cDNA的分離。從阿拉比卡咖啡(顆粒，黃色期)獲得一個(gè)cDNA片段(Racel—CViCO^OAfr-^2)(SEQIDNO:35),其覆蓋全部阿拉比卡咖啡CCoAOMT-L2(SEQIDNO:8)的ORF的5，端(見實(shí)施例中的方法)。該序列和pcccs46w30m24(SEQIDNO:36)中包含的插入序列可用于設(shè)計(jì)引物CCoAOMT-L2-FullUp(SEQIDNO:58)和CCoAOMT-L2-FullLow(SEQIDNO:59)，這些引物用于從卡尼福拉咖啡BP409(顆粒，黃色期)中擴(kuò)增CcCCoAOMT-L2(pNT4)(SEQIDNO:8)片段。標(biāo)志與圖2和3中一致。B)pNT4的插入序列(SEQIDNO:8)與cDNA序列Racel_C"(XV^OiWT-Z^(SEQIDNO:35)和pcccs46w30m24(SEQIDNO:36)進(jìn)行比對(duì)。標(biāo)記為灰色的堿基與該位點(diǎn)最經(jīng)常出現(xiàn)的堿基相匹配。圖11.CcCCoAOMT-l(pcccll5a11)、CaCCoAOMT國(guó)Ll(pNT8)和CcCCoAOMT-L2(pNT4)的蛋白質(zhì)序列比對(duì)。用CLUSTALW程序和手動(dòng)優(yōu)化將分別由(SEQIDNO:6、7、8)編碼的CcC0^40Mr-7、CflCa^OMT-LJ和CcCO^OMr-L2蛋白質(zhì)序列(分別為SEQIDNO:14、15、16)進(jìn)行比對(duì)。標(biāo)記為灰色的氨基酸與在該位點(diǎn)最經(jīng)常出現(xiàn)的殘基相匹配。最近在與反應(yīng)產(chǎn)物復(fù)合的苜蓿(紫花苜蓿(3/^^嘆0^1^"))CCoAOMT的晶體結(jié)構(gòu)中表征了隨后的氨基酸相互作用(Ferrer等人，2005):粉色盒表示與輔酶A的腺苷3，-5，二磷酸部分帶負(fù)電荷的3，-磷酸鹽基團(tuán)相互作用的氨基酸，藍(lán)色盒表示涉及底物識(shí)別的氨基酸，綠色盒表示涉及二價(jià)金屬離子和輔因子結(jié)合的氨基酸。圖12.CcCCoAOMT-l(pcccll5a11)、MsCCoAOMT、匿CoAOMT、VvCCoAOMT、CaCCoAOMT-Ll(pNT8)和CcCCoAOMT-L2(pNT4)的蛋白質(zhì)序列比對(duì)。用CLUSTALW程序和手動(dòng)優(yōu)化將從NCm數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的蛋白質(zhì)序列MsCCoAOMT(SEQIDNO:37)、NtCCoAOMT(SEQIDNO:38)和VvCCoAOMT(SEQID碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)。標(biāo)記為灰色的氨基酸與在該位點(diǎn)最經(jīng)常出現(xiàn)的殘基相匹配。最近在與反應(yīng)產(chǎn)物復(fù)合的苜蓿(紫花苜蓿)CCoAOMT晶體結(jié)構(gòu)中表征了隨后的氨基酸相互作用(Ferrer等人，2005):粉色盒表示與輔酶A的腺苷3，-5，二磷酸部分帶負(fù)電荷的3，-磷酸鹽基團(tuán)相互作用的氨基酸，藍(lán)色盒表示涉及底物識(shí)別的氨基酸，綠色盒表示涉及二價(jià)金屬離子和輔助因子結(jié)合的氨基酸。括號(hào)中給出從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的蛋白質(zhì)序列的登錄號(hào)MsCCoAOMT(紫花苜蓿，AAC28973(SEQIDNO:37))、NtCCoAOMT(煙草，AAC49913(SEQIDNO:38))和VvCCoAOMT(葡萄(Wrisv/附/era),CAA卯969(SEQIDNO:39))。圖13.重組CcHCT蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化。A)來(lái)自重組GST-CcHCT融合蛋白質(zhì)(pGTPcl03a一HCT)的表達(dá)和純化的多種階段的提取物通過(guò)以下方法分析，A)用5-18%SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色和B)用蛋白質(zhì)印跡分析(見實(shí)施例中的方法)。A中的泳道1.含有pGTPcl03a_HCT并以0.2mMIPTG誘導(dǎo)的B121重組細(xì)胞的總裂解物，2.裂解物的可溶部分，3.裂解物的不可溶部分，4.用洗滌緩沖液對(duì)NiNTA柱的第一步洗滌液，5到9為用洗脫緩沖液對(duì)M-NTA柱進(jìn)行洗脫的連續(xù)級(jí)分，9.分子量標(biāo)記。B中的泳道1.從Ni-NTA柱洗脫的混合物質(zhì)。2.分子量標(biāo)記。圖14.重組CcHQT蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化。A)來(lái)自重組GST-CcHQT融合蛋白質(zhì)(pGTPcl03a一HQT)的表達(dá)和純化的多種階段的提取物通過(guò)以下方法分析，A)用5-18%SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色和B)用蛋白質(zhì)印跡分析(見實(shí)施例中的方法)。A中的泳道1.含有pGTPcl03a_HQT并以0.2mMIPTG誘導(dǎo)的B121重組細(xì)胞的總裂解物，2.裂解物的可溶部分，3.裂解物的不可溶部分，4.用洗滌緩沖液對(duì)NiNTA柱的第一步洗滌液，5到9為用洗脫緩沖液對(duì)Ni-NTA柱進(jìn)行洗脫的連續(xù)級(jí)分，9.分子量標(biāo)記。B中的泳道1.從M-NTA柱洗脫的混合物質(zhì)。2.分子量標(biāo)記。圖15.CcCCoAOMT-1(pNT16)表達(dá)和純化的分析。A)His-標(biāo)簽-CcCCoAOMTl融合蛋白質(zhì)的表達(dá)在12%SDS-PAGE凝膠上分析，并用考馬斯亮藍(lán)染色。A-泳道l.含pNT16并用0.2%d，阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)的B121重組細(xì)胞的粗提物，2.含pNT16并用0.1。/。葡萄糖抑制表達(dá)的B121重組細(xì)胞的粗提物。B-泳道1.在NiNTA柱中填裝的裂解物，2.第一步洗滌級(jí)分，3.第二步洗滌級(jí)分，4到7.用洗脫緩沖液對(duì)MNTA柱進(jìn)行l(wèi)-4步洗脫的級(jí)分。MW:分子量標(biāo)記(精確加預(yù)染全藍(lán)(Biorad#161-0373))。圖16.CaCCoAOMT-Ll(pNT12)表達(dá)和純化的分析。A)His-標(biāo)簽-CaCCoAOMT-Ll融合蛋白質(zhì)的表達(dá)在12%SDS-PAGE凝膠上分析，并用考馬斯亮藍(lán)染色。A-泳道l.含pNT12并用0.2。/。d，阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)的B121重組細(xì)胞的粗提物，2.含pNT12并用0.1。/。葡萄糖抑制表達(dá)的B121重組細(xì)胞的粗提物。MW:分子量標(biāo)記(精確加預(yù)染全藍(lán)(Biorad#161-0373))。B-泳道1到4.用洗脫緩沖液對(duì)NiNTA柱進(jìn)行1-4步洗脫的級(jí)分。MW:分子量標(biāo)記(未染色精確寬分子量范圍(Biorad#161-0362))。圖17.CcCCoAOMT-L2(pNT17)表達(dá)和純化的分析。A)His-標(biāo)簽-CcCCoAOMT-L2融合蛋白質(zhì)的表達(dá)在12%SDS-PAGE凝膠上分析，并用考馬斯亮藍(lán)染色。A-泳道l.含pNT17并用0.2。/。d，阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)的B121重組細(xì)胞的粗提物，2.含pNT17并用0.1%葡萄糖抑制表達(dá)的B121重組細(xì)胞的粗提物，MW:分子量標(biāo)記(精確加預(yù)染全藍(lán)(Biorad#161-0373))。B-泳道1到4.用洗脫緩沖液對(duì)NiNTA柱進(jìn)行1-4步洗脫的級(jí)分。MW:分子量標(biāo)記(未染色精確寬分子量范圍(Biorad#161-0362))。圖18.His標(biāo)簽-CcCCoAOMTl重組蛋白質(zhì)的活性分析。在方法部分描述的活性反應(yīng)樣品填裝到HPLC柱中，并在324nm測(cè)量洗脫語(yǔ)。A欄為分別在0、6和24小時(shí)取得的含40將重組蛋白質(zhì)的反應(yīng)樣品的HPLC洗脫鐠。B欄為在相同時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有加入酶的對(duì)照反應(yīng)的HPLC語(yǔ)。圖19.CcCCoAOMTl蛋白質(zhì)的未知產(chǎn)物鑒定為阿魏酸。通過(guò)在圖18A中所示的24小時(shí)酶樣品中直接加入的阿魏酸"峰"，鑒定在保留時(shí)間14.8分鐘的峰為阿魏酸。表示為24小時(shí)樣品+和-"峰，，在324nm的紫外吸光度。綠色曲線代表24小時(shí)樣品的洗脫譜，黃色曲線代表24小時(shí)樣品加上阿魏酸"峰"的洗脫鐠未知產(chǎn)物清楚地與阿魏酸"峰"共同洗脫。圖20.在40。C活性緩沖液中5CQA樣品的HPLC洗脫諳(陰性對(duì)照)。20A:T-0HPLC光鐠，B:T2小時(shí)HPLC光語(yǔ)，C:T4小時(shí)HPLC光i脊。圖21.由重組HCT(AcTEV蛋白酶切割后釋放)和5CQA底物反應(yīng)獲得的樣品的HPLC洗脫謙。A:T=0時(shí)樣品的HPLC語(yǔ)，B:在40。C培育4小時(shí)后樣品的HPLC譜，C:在40。C培育24小時(shí)后樣品的HPLC鐠。與標(biāo)準(zhǔn)注入相比較，鑒定保留時(shí)間約14.4分鐘的峰為5CQA。同樣鑒定2分鐘的峰為輔酶A。說(shuō)明性實(shí)施方案的詳述定義在說(shuō)明書和權(quán)利要求中通篇使用了關(guān)于生物學(xué)分子和本發(fā)明其他方面的多種術(shù)語(yǔ)。術(shù)語(yǔ)"類苯基丙烷途徑多肽、蛋白質(zhì)或酶"指參與苯丙醇途徑的多肽，其與其他物質(zhì)一起導(dǎo)致植物中綠原酸的生物合成，且特別是在咖啡植物中。該術(shù)語(yǔ)包含此途徑中各蛋白質(zhì)的特異作用機(jī)制。多肽包括(不限于)此處例舉的苯丙氨酸氨裂解酶、肉桂酸4-羥化酶、4-羥基肉桂酰輔酶A連接酶(也指4香豆酰-輔酶A連接酶)、羥基肉桂酰輔酶A莽草酸酯羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶、羥基肉桂酰輔酶-A套尼酸鹽羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶、(對(duì))-香豆酸酯3-羥化酶、咖啡酰-輔酶A氧位-曱基轉(zhuǎn)移酶、肉桂醇脫氫酶、肉桂酰-輔酶A還原酶、咖啡^/5-羥基阿魏酸氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶、阿魏酸鹽5-羥化酶、芥子醇脫氬酶等。"分離的"指從天然狀態(tài)進(jìn)行"人工"改變。如果組合物或底物天然存在，那么如果將其從原始環(huán)境改變或移出、或兩者同時(shí)進(jìn)行，其即為"分離的"。例如，如此處所用的術(shù)語(yǔ)，天然存在于活的植物或動(dòng)物中的多核苷酸或多肽不是"分離的"，但是從其天然狀態(tài)的共存材料中分離出的同樣多核苷酸或多肽則是"分離的"。"多核苷酸"也指"核酸分子"，通常指任意多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核糖核苷酸，其可以是未修飾的RNA或DNA、或修飾的RNA或DNA。"多核苷酸"包括(不限于)單鏈和雙鏈DNA、單鏈和雙鏈區(qū)混合的DNA、單鏈和雙鏈RNA、和單鏈和雙鏈區(qū)混合的RNA、包含DNA和RNA的雜化分子(可以是單鏈、或更通常為雙鏈或單鏈和雙鏈區(qū)混合)。另外，"多核苷酸，，指包含RNA或DNA、或RNA和DNA兩者的三鏈區(qū)。術(shù)語(yǔ)多核苷酸也包括含有一個(gè)或多個(gè)修飾堿基的DNA或RNA，以及為穩(wěn)定性或其他原因而進(jìn)行主鏈修飾的DNA或RNA。"修飾"堿基包括例如三苯甲基化的堿基和稀有堿基(例如肌香)?？梢詫?duì)DNA和RNA進(jìn)行多種修飾；因此，"多核苷酸"包含天然存在的多核苷酸的化學(xué)的、酶的或代謝的修飾形式，以及病毒和細(xì)胞的特征DNA和RNA的化學(xué)形式。"多核苷酸"也包含相對(duì)短的多核苷酸，通常指寡核苷酸。"多肽"指包含兩個(gè)或多個(gè)彼此以肽鍵或修飾肽鍵(即肽等構(gòu)物)相連接的氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。"多肽"既指短鏈，通常指肽、寡肽或寡聚物，也指較長(zhǎng)的鏈，通常指蛋白質(zhì)。多肽可以包含除基因編碼的20個(gè)氨基酸以外的氨基酸。"多肽，，包括通過(guò)天然方法(例如翻譯后加工)修飾的氨基酸序列，或通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)熟知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾的氨基酸序列。此類修飾在基本文本和更詳細(xì)的專題文章、以及許多研究文獻(xiàn)中都有詳細(xì)描述?？梢栽诙嚯牡娜我馕恢眯揎棧闹麈?、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。應(yīng)該理解在給定多肽中的幾個(gè)位點(diǎn)可以存在相同或不同程度的同樣類型的修飾。同樣，給定多肽可以包含許多類型的修飾。由于泛素化作用，多肽可以是有分支的，而且它們可以是有或沒(méi)有分支的環(huán)形。環(huán)形、分支和分支環(huán)形多肽可以來(lái)源于天然的翻譯后加工，或通過(guò)合成方法形成。修飾包括乙酰化、?；?、ADP核糖基化、酰胺化、共價(jià)連接黃素、共價(jià)連接血紅素部分、共價(jià)連接核苷酸或核苷酸衍生物、共價(jià)連接脂類或脂類衍生物、共價(jià)連接磷脂酰肌醇、交聯(lián)、環(huán)化、形成二硫鍵、脫甲基、形成共價(jià)交聯(lián)、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、曱?；?、，羧化、糖基化、形成GPI錨、羥基化、碘化、曱基化、豆蔻?；?、氧化、蛋白酶加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋、硒基化(sdenoylation)、硫酸化、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA介導(dǎo)的向蛋白質(zhì)添加氨基酸(例如精氨酰化)，和泛素化。例如見蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子性質(zhì)，笫二版,T.E.Creighton，W.H.FreemanandCompany,NewYork,1993和Wold,F.，翻譯后蛋白質(zhì)4務(wù)飾前景和展望，1-12頁(yè)，蛋白質(zhì)翻譯后共價(jià)修飾，B.C.Johnson,編輯，學(xué)術(shù)出版社，NewYork,1983;Seifter等人，蛋白質(zhì)修飾和非蛋白質(zhì)輔助因子的分析，MethEnzymol(19卯)182:626-646和Rattan等人，蛋白質(zhì)合成翻譯和修飾和衰老，AnnNYAcadSci(1992)663:48-62。此處所用術(shù)語(yǔ)"變體"指分別與參照多核苷酸或多肽不同的多核普酸或多肽，但是其保留了基本的性質(zhì)。通常多核苷酸變體與參照多核苷酸具有不同的核苷酸序列。變體的核苷酸序列的變化可以改變或不改變參照多核苷酸所編碼的多肽的氨基酸序列。如下所述，核苷酸變化可以導(dǎo)致參照序列編碼的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。通常多肽變體與參照多肽具有不同的氨基酸序列。通常，差異是有限的，從而使參照多肽和變體在整體上接近類似，并且在許多區(qū)域是同一的。變體和參照多肽的氨基酸序列的不同可以是一個(gè)或多個(gè)取代、添加或缺失的任意組合。取代或插入的氨基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼編碼的。多核苷酸或多肽的變體可以天然存在，例如等位變體，或可以不是天然存在的。多核苷酸或多肽的非天然存在的變體可以通過(guò)誘變技術(shù)形成或直接合成。關(guān)于突變植物，術(shù)語(yǔ)"無(wú)效突變"或"喪失功能的突變"用于指引起基因產(chǎn)物無(wú)功能或大量缺失的生物體或基因組DNA序列的突變。此類突變存在于基因的編碼和/或調(diào)節(jié)區(qū)，且可能改變單個(gè)殘基、或插入或缺失核酸區(qū)域。這些突變也可以發(fā)生于其他調(diào)節(jié)或控制基因和/或編碼蛋白質(zhì)的基因的編碼和/或調(diào)節(jié)區(qū)，從而使蛋白質(zhì)無(wú)功能或大量缺失。術(shù)語(yǔ)"基本相同"指核酸或氨基酸序列的序列變化在本質(zhì)上不影響蛋白質(zhì)本性(即蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定特性、底物特異性和/或生物學(xué)活性)。尤其對(duì)于核酸序列，術(shù)語(yǔ)"基本相同，，指編碼區(qū)和管理表達(dá)的保守序列，并且主要指編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子，或在編碼的多肽中編碼保守取代氨基酸的替代密碼子。對(duì)于氨基酸序列，術(shù)語(yǔ)"基本相同"通常指在不涉及決定結(jié)構(gòu)或功能的多肽區(qū)域的保守取代和/或改變。術(shù)語(yǔ)"同一性百分比"和"相似性百分比"也在此處用于氨基酸和核23酸序列中的比較。當(dāng)指氨基酸序列時(shí)，"同一性，，或"同一性百分比，，指在用序列分析程序進(jìn)行氨基酸序列的比對(duì)中，與同一性氨基酸匹配的受試氨基酸序列的氨基酸百分比。"相似性百分比"指與同一性或保守氨基酸匹配的受試氨基酸序列的氨基酸百分比。保守氨基酸是那些結(jié)構(gòu)不同但是具有相似物理性質(zhì)的氨基酸，從而使它們互相交換時(shí)并不改變最終蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。保守取代在Taylor(1986，J.Theor.Biol.119:205)中定義。當(dāng)指核酸分子時(shí)，"同一性百分比"指使用序列分析程序，受試核酸序列的核苷酸與同一性核苷酸配對(duì)的百分比。術(shù)語(yǔ)"同一性"或"同一的"可與術(shù)語(yǔ)"同源性"或"同源的"互換使用。"同一性"和"相似性"可以通過(guò)已知方法容易地計(jì)算?？梢允褂糜?jì)算機(jī)程序來(lái)比較核酸序列和氨基酸序列，列出相似的核酸或氨基酸序列，由此得出差異。在優(yōu)選的方法中，使用BLAST程序(NCBI)和此處所用的參數(shù)，和使用DNAstar系統(tǒng)的Lasergene程序包(麥迪遜，WI)來(lái)比對(duì)基因組DNA序列的片段、以及cDNA和蛋白質(zhì)序列。然而，可以通過(guò)使用任意標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)軟件來(lái)獲得同等比對(duì)和相似性/同一性判定。例如GCG威斯康辛程序包9.1版本，獲自威斯康辛州麥迪遜的遺傳計(jì)算組，并且使用該程序所用的缺省參數(shù)(空位產(chǎn)生罰分=12,空位延伸罰分=4)來(lái)比較序列同一性和相似性。此處所用"抗體，，包括多克隆和單克隆抗體，嵌合、單鏈和人化抗體，及抗體片段(例如Fab、Fab，、F(ab，)2和F》，包括Fab或其他免疫球蛋白表達(dá)庫(kù)的產(chǎn)物。關(guān)于抗體，術(shù)語(yǔ)"免疫特異性"或"特異性"指結(jié)合于目的蛋白質(zhì)一個(gè)或多個(gè)表位的抗體，但是其在含有混合抗原生物分子的樣品中基本不識(shí)別和結(jié)合其他分子。確定抗體結(jié)合特異性的篩選測(cè)定方法是在本領(lǐng)域內(nèi)熟知的和常規(guī)的進(jìn)行。此類測(cè)定方法的綜合討論見Harlow等人(編輯)，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)；ColdSpringHarborLaboratory;ColdSpringHarbor,NY(1988)，第6章。術(shù)語(yǔ)"基本純化"指以重量計(jì)包含至少50-60%的目的化合物(例如核酸、寡核苷酸、蛋白質(zhì)等等)的制品。更優(yōu)選地，制品以重量計(jì)包含至少70%、和最優(yōu)選90-99%的目的化合物。通過(guò)對(duì)于目的化合物合適的方法(例如層析法、瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳、HPLC分析等等)來(lái)測(cè)量純度。對(duì)于單鏈核酸分子，術(shù)語(yǔ)"特異性雜交，，指充分互補(bǔ)序列的兩個(gè)單鏈核酸分子之間的相互結(jié)合，以允許此類雜交在本領(lǐng)域常用的預(yù)定條件下進(jìn)行(有時(shí)稱為"基本互補(bǔ)")。具體地，該術(shù)語(yǔ)指寡核苷酸與單鏈DNA或RNA分子中含有的基本互補(bǔ)序列之間的雜交，基本排除寡核苷酸與單鏈核酸的非互補(bǔ)序列之間的雜交。"編碼序列"或"編碼區(qū)"指當(dāng)表達(dá)該序列時(shí)，具有產(chǎn)生基因產(chǎn)物必需的序列信息的核酸分子。編碼序列可以在翻譯區(qū)內(nèi)包含非翻譯序列(例如內(nèi)含子或5，或3，非翻譯區(qū))，或可以缺少此類插入的非翻譯序列(例如在cDNA中的)。"內(nèi)含子"指核酸中的多核苷酸序列，其不編碼與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的信息。此類序列被轉(zhuǎn)錄為mRNA，但是在mRNA被翻譯成蛋白質(zhì)之前被除去。術(shù)語(yǔ)"有效連接"或"有效插入"指將表達(dá)編碼序列所需的調(diào)節(jié)序列放入核酸分子中相對(duì)于編碼序列的合適位置，從而使編碼序列能夠表達(dá)。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)時(shí)，該啟動(dòng)子是與編碼序列有效連接的。編碼序列可以以正向或反向的方向有效連接啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ)"有效連接"有時(shí)應(yīng)用于在表達(dá)載體中其他轉(zhuǎn)錄控制元件(例如增強(qiáng)子)的排列。轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列是DNA調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多腺苷酸化信號(hào)、終止子等等，其負(fù)責(zé)在宿主細(xì)胞中編碼序列的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"、"啟動(dòng)子區(qū)"或"啟動(dòng)子序列"通常指基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，其可以在編碼區(qū)的5，或3，側(cè)，或在編碼區(qū)之內(nèi)，或在內(nèi)含子之內(nèi)。通常啟動(dòng)子是DNA調(diào)節(jié)區(qū)，其能夠在細(xì)胞中結(jié)合RNA聚合酶和起始下游(3，方向)編碼序列的轉(zhuǎn)錄。通常5，啟動(dòng)子序列的3，末端結(jié)合于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并延伸到上游(5，方向)，從而包括在超過(guò)背景的可檢測(cè)水平上起始轉(zhuǎn)錄所必需的最少數(shù)目的堿基或元件。在啟動(dòng)子序列之內(nèi)是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(通過(guò)核酶Sl繪制圖譜可以方便地確定)，和負(fù)責(zé)結(jié)合RNA聚合酶的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(共有序列)。"載體"是復(fù)制子，例如質(zhì)粒、噬菌體或病毒，另一核酸分子片段可以有效地插入其中，從而引起該片段的復(fù)制或表達(dá)。術(shù)語(yǔ)"核酸構(gòu)建體"或"DNA構(gòu)建體"有時(shí)用于指編碼序列或有效連接于合適調(diào)節(jié)序列和插入載體中用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的序列。該術(shù)語(yǔ)可以與術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化DNA"或"轉(zhuǎn)基因"互換使用。此類核酸構(gòu)建體可以包含目的基因產(chǎn)物的編碼序列，同時(shí)具有可篩選標(biāo)記基因和/或報(bào)告基因。"標(biāo)記基因，，或"可篩選標(biāo)記基因"是編碼具有一種特性的基因產(chǎn)物的基因，該特性使含有該基因的細(xì)胞能夠從不含該基因的細(xì)胞中篩選出來(lái)。基因工程中使用的載體通常包含一個(gè)或多個(gè)可篩選標(biāo)記基因?？珊Y選標(biāo)記基因的類型包括(l)抗生素抗性基因，(2)除草劑耐受性或抗性基因，和(3)代謝或營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因，其可使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠合成正常細(xì)胞不能產(chǎn)生的主要成分，通常是氨基酸。"報(bào)告基因"也是一類標(biāo)記基因。其通常編碼用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室方法(例如酶活性、焚光)可測(cè)定或可檢測(cè)的基因產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"、"表達(dá)的"或基因的"表達(dá)"指基因產(chǎn)物的生物合成。該過(guò)程涉及基因轉(zhuǎn)錄為mRNA，和隨后mRNA翻譯為一個(gè)或多個(gè)多肽，并且包含所有天然存在的翻譯后修飾。"內(nèi)源的"指例如在特定生物中天然發(fā)現(xiàn)的任意組成型基因或核酸、或多肽。核酸構(gòu)建體的"異源的"區(qū)域是在較大分子中核酸分子的可識(shí)別片段，其在天然情況下并不與較大分子相結(jié)合。因此，當(dāng)異源區(qū)域編碼基因時(shí)，該基因通常在DNA的旁邊，而其在起源生物的基因組中并不在基因組DNA的旁邊。在另一實(shí)施例中，異源區(qū)域是構(gòu)建體，其中編碼序列本身不是天然存在的(例如基因組編碼序列包含內(nèi)含子的cDNA,或具有與天然基因不同的密碼子的合成序列)。等位變體或天然存在的突變事件不能形成此處定義的DNA的異源區(qū)域。如上所定義，術(shù)語(yǔ)"DNA"構(gòu)建體也用于指異源區(qū)域，尤其是為轉(zhuǎn)化細(xì)胞而構(gòu)建的構(gòu)建體。當(dāng)外源或異源DNA被引入到細(xì)胞中時(shí)，該細(xì)胞為被此類DNA"轉(zhuǎn)化的"或"轉(zhuǎn)染的"。轉(zhuǎn)化DNA可以整合(共價(jià)連接)或不整合到細(xì)胞基因組中。例如在原核、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化DNA可以維持在附加型元件，例如質(zhì)粒中。對(duì)于真核細(xì)胞，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中轉(zhuǎn)化DNA整合到染色體中，從而使其可以通過(guò)染色體復(fù)制而遺傳到子細(xì)胞中。可以通過(guò)真核細(xì)胞建立細(xì)胞系的能力或含轉(zhuǎn)化DNA的子細(xì)胞形成克隆的能力來(lái)證明此種穩(wěn)定性。"克隆，，是從單個(gè)細(xì)胞或共同祖先通過(guò)有絲分裂而衍生的細(xì)胞群體。"細(xì)胞系"是原代細(xì)胞的克隆，能夠在體外穩(wěn)定生長(zhǎng)許多代。"顆粒"、"種子"或"豆"指開花植物的生殖單位，能夠發(fā)育為另一個(gè)此類植物。此處所用的這些術(shù)語(yǔ)是同義的并可互換使用，尤其是對(duì)于咖啡植物。此處所用的術(shù)語(yǔ)"植物"包括參照整體植物、植物器官(例如葉、莖、枝干、根)、種子、花粉、植物細(xì)胞、植物細(xì)胞器、和其子代。在本發(fā)明的范圍內(nèi)應(yīng)該理解轉(zhuǎn)基因植物的部分包括例如來(lái)源于轉(zhuǎn)基因植物或它們的子代的植物細(xì)胞、原生質(zhì)體、組織、愈傷組織、胚，以及花、莖、種子、花粉、果實(shí)、葉、或根。說(shuō)明一方面，本發(fā)明描述來(lái)自咖啡的核酸分子，其編碼構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多種蛋白質(zhì)，其導(dǎo)致綠原酸的生物合成以及具有其他功能。從數(shù)據(jù)庫(kù)47,000個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽(EST),來(lái)自從不同發(fā)育階段收獲的櫻桃的嫩葉及顆粒和果皮組織中分離的RNA制成的幾個(gè)卡尼福拉咖啡(羅巴斯特種)cDNA文庫(kù)。鑒定出重疊的EST,并"聚類"成包含完全編碼序列的單基因(重疊群)。通過(guò)將單基因序列對(duì)NCBI(生物技術(shù)信息國(guó)家中心)的非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST查詢來(lái)注釋單基因序列。上述分析顯示代表咖啡植物中類苯基丙烷途徑的幾個(gè)重要酶的基因序列。目前已獲得了代表這些序列的幾個(gè)全部開放讀碼框(ORF)的cDNA。這些cDNA和它們編碼的蛋白質(zhì)在此處列出如下<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>編碼的蛋白質(zhì)分子量約為48.06kDaCcHCT(SEQIDNO:9)、48.19kDaCaHCT(SEQIDNO:10)、47.72kDaCcHQTSEQIDNO:ll)、47.54kDaCaHQT(SEQIDNO:12)、57.9kDaCcC3H(SEQIDNO:13)、27.97kDaCcCCoAOMTl(SEQIDNO:14)、25.71kDaCaCCoAOMLI(SEQIDNO:15)和26.3kDaCcCCoAOMTL2(SEQIDNO:16)。盡管此處描述和例舉了來(lái)源于卡尼福拉咖啡和阿拉比卡咖啡的編碼構(gòu)成類苯基丙烷途徑的蛋白質(zhì)的多核苷酸，但是本發(fā)明也預(yù)期包含來(lái)自其他足夠相似的咖啡種的核酸和編碼的蛋白質(zhì)，其根據(jù)下面描述的目的可以與例舉的咖啡多核苷酸和蛋白質(zhì)互換使用。相應(yīng)地，當(dāng)此處使用術(shù)語(yǔ)"構(gòu)成類苯基丙烷途徑"的多肽或蛋白質(zhì)時(shí)，其預(yù)期包含具有此處描述的一般物理、生物化學(xué)和功能性特性的所有咖啡蛋白質(zhì)，以及編碼它們的多核苦酸?？紤]到它們的序列，編碼構(gòu)成類苯基丙烷途徑的蛋白質(zhì)的本發(fā)明的多核苷酸包括SEQIDNO:1-8的等位變體和天然突變，其可能在不同變種的卡尼福拉咖啡和阿拉比卡咖啡中被發(fā)現(xiàn)，并且可能在不同咖啡種中發(fā)現(xiàn)SEQIDNO:l-8的同系物。因?yàn)槠谕祟愖凅w和同系物具有一定的核苷酸和氨基酸序列的差異，所以本發(fā)明提供的編碼構(gòu)成類苯基丙烷途徑的蛋白質(zhì)的分離的多核苷酸與SEQIDNO:9-16具有至少約50%,優(yōu)選至少約60、65或70%,更優(yōu)選至少約71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%或80%，甚至更優(yōu)選81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%，和甚至更優(yōu)選90%、91%、92%、93%、94%、95%，和最優(yōu)選96%、97%、98%和99%或更高的同一性，并且包含與SEQIDNO:1-8的任一個(gè)具有相同范圍同一性的核苷^列。因?yàn)樵跇?gòu)成類苯基丙烷途徑的蛋白質(zhì)和在不同咖啡變種和物種中編碼它們的基因中，可能存在天然的序列變體，所以本領(lǐng)域的技術(shù)人員期望發(fā)現(xiàn)此水平的變化，而仍然保持本發(fā)明的多肽和多核苷酸的獨(dú)特性質(zhì)。此類預(yù)期一部分是由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，以及已知的保守氨基酸序列改變的進(jìn)化，而其并不改變編碼的蛋白質(zhì)的本性。因此，認(rèn)為此類變體和同系物基本上彼此相同，并包括在本發(fā)明的范疇內(nèi)。實(shí)用性的，并包含在本發(fā)明的范疇內(nèi)。來(lái)源于任意咖啡種的編碼構(gòu)成類苯法獲得，并且可能根據(jù)本發(fā)明而利用。在其它利用中，可以使用掌管編碼動(dòng)子和調(diào)節(jié)元件用于優(yōu)化、改變或修飾構(gòu)成類苯基丙烷途徑的蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而提高含有此類修飾的咖啡豆所產(chǎn)生的咖啡產(chǎn)品的香味和香氣。下面的部分涉及實(shí)踐本發(fā)明的一般過(guò)程。對(duì)于所述具體材料的范圍，其目的只在于說(shuō)明，而非意在限制本發(fā)明。除非另外說(shuō)明，4吏用一般的生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法，例如在Sambrook等人，分子克隆，ColdSpringHarborLaboratory(1989)或Ausubel等人(編輯)，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法,JohnWiley和Sons(2005)中描述的。核酸分子、蛋白質(zhì)和抗體本發(fā)明的核酸分子可以通過(guò)兩種一般的方法制備(l)可以從適當(dāng)?shù)暮塑杖姿岷铣?，?2)可以從生物來(lái)源分離。兩者都利用本領(lǐng)域熟知的方法?？衫玫暮塑账嵝蛄行畔?例如具有SEQIDNO:1-8的cDNA)使通過(guò)寡核苷酸合成來(lái)制備本發(fā)明的分離核酸成為可能?？梢酝ㄟ^(guò)亞磷酰胺方法29使用應(yīng)用生物系統(tǒng)38ADNA合成儀或類似裝置來(lái)制備合成的寡核香酸?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域公知的方法，例如高效液相色鐠(HPLC)來(lái)純化合成的構(gòu)建體。由于現(xiàn)有寡核苷酸合成方法對(duì)于分子大小的內(nèi)在局限性，長(zhǎng)的雙鏈多核香酸(例如本發(fā)明的DNA分子)必須按階段合成。因此，可以以幾個(gè)適當(dāng)互補(bǔ)的較小片段合成例如一個(gè)長(zhǎng)的雙鏈分子。將這樣產(chǎn)生的互補(bǔ)片段退火從而使每個(gè)片段具有用于祐附鄰近片段的合適的粘性末端。鄰近的片段可以在DNA連接酶的存在下通過(guò)粘性末端退火而連接，從而構(gòu)建全長(zhǎng)的雙鏈分子。可以隨后在合適的載體中克隆和擴(kuò)增這樣構(gòu)建的合成DNA分子。與本發(fā)明一致，可以通過(guò)使用適當(dāng)嚴(yán)格性條件下的雜交和洗脫來(lái)鑒定與編碼構(gòu)成類苯基丙烷途徑蛋白質(zhì)的基因的編碼和/或調(diào)節(jié)區(qū)域的部分或整體具有適當(dāng)水平的序列同源性的核酸。應(yīng)該理解通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員，上述策略應(yīng)用于基因組序列時(shí)，其不但可以分離編碼構(gòu)成類苯基丙烷途徑蛋白質(zhì)的基因的編碼序列，而且也可以分離與編碼構(gòu)成類苯基丙烷途徑蛋白質(zhì)的基因相連接的啟動(dòng)子和其他基因調(diào)節(jié)序列，盡管調(diào)節(jié)序列本身可以沒(méi)有適合于雜交的足夠的同源性。按照一般的說(shuō)明，可以根據(jù)Sambrook等人的方法進(jìn)行雜交，使用的雜交溶液包含5xSSC、5xDenhardt試劑、1.0%SDS、100pg/ml變性的鮭精DNA片段、0.05%焦磷酸鈉和高達(dá)50%的甲酰胺。雜交在37-42。C進(jìn)行至少6小時(shí)。雜交后，按如下步驟洗脫(l)在2xSSC和1%SDS中于室溫洗脫5分鐘；(2)在2xSSC和0.1%SDS中于室溫洗脫15分鐘；(3)在2xSSC和0.1%SDS中于37。C洗脫30分鐘到1小時(shí)；(4)在2xSSC和0.1%SDS中于,45-55。C洗脫2小時(shí)，每30分鐘更換溶液。用于計(jì)算具有特定同源性的核酸分子之間雜交所需達(dá)到的嚴(yán)格性條件的通用公式(Sambrook等人，1989):Tm=81.5。C+16.6Log[Na++0.41(%G+C)-0.63(%甲酰胺)-600/#bp雙鏈中對(duì)于上述公式的說(shuō)明，使用[3+]=和50%甲酰胺，GC含量為42%,并且平均探針大小為200堿基，Tm值為57。C。同源性每降低1%會(huì)使DNA雙鏈的Tm值降低l-:L5。C。因此，使用42。C的雜交溫度將觀察到靶標(biāo)具有大于約75%的序列同一性。使用上述雜交和洗脫溶液，在一個(gè)實(shí)施方案中，雜交在37。C進(jìn)行，而最終洗脫在42。C進(jìn)行；在另一個(gè)實(shí)施方案中，雜交在42。C進(jìn)行，而最終洗脫在50。C進(jìn)行；并且在另外一個(gè)實(shí)施方案中，雜交在42。C進(jìn)行，而最終洗脫在65。C進(jìn)行。高嚴(yán)格性條件包括在上述雜交溶液中于42。C雜交和在0.1xSSC和0.1%SDS中于65。C最終洗脫10分鐘。本發(fā)明的核酸可以在任意方便克隆的載體中作為DNA維持。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，克隆維持在質(zhì)?？寺?表達(dá)載體中，例如pGEM-T(普洛麥格(Promega)生物才支術(shù)，麥迪遜，WI)、pBluescript(斯徹特基因7>司(Stratagene)，LaJolla，CA)、pCR4-TOPO(英杰公司(Invitrogen)，卡爾斯巴德，CA)或pET28a十(諾瓦根(Novagen)，麥迪遜，WI)，所有這些載體可以在合適的大腸桿菌宿主細(xì)胞中繁殖。本發(fā)明的核酸分子包括cDNA、基因組DNA、RNA和其片段，可以是單鏈、雙鏈或甚至是三鏈的。因此，本發(fā)明提供具有能夠與至少一種本發(fā)明核酸分子序列雜交的序列的寡核苷酸(DNA或RNA的正義或反義鏈)。此類寡核苷酸作為有用的探針，可以用于例如通過(guò)PCR擴(kuò)增在測(cè)試的植物組織樣品中檢測(cè)編碼構(gòu)成類苯基丙烷途徑的蛋白質(zhì)的基因或mRNA，或用于在mRNA翻譯為蛋白質(zhì)過(guò)程中或翻譯之前對(duì)編碼構(gòu)成類苯基丙烷途徑的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)進(jìn)行正或負(fù)調(diào)控。在此類測(cè)定中使用寡核苷酸或多核苦酸作為探針的方法包括(但是不限于)(l)原位雜交；(QDNA雜交；(3)RNA雜交；和(4)組合的擴(kuò)增反應(yīng)，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR，包括RT-PCR)和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)?？梢愿鶕?jù)已知方法通過(guò)多種方式制備由本發(fā)明的核酸編碼的多肽。如果原位產(chǎn)生，可以從適當(dāng)來(lái)源，例如種子、果皮或其他的植物部分來(lái)純化該多肽?？蛇x擇地，可以利用編碼多肽的核酸分子使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的體外表達(dá)方法產(chǎn)生蛋白質(zhì)。例如可以將cDNA或基因克隆到合適的體外轉(zhuǎn)錄載體，例如用于體外轉(zhuǎn)錄的pSP64或pSP65中，隨后在合適的無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)(例如小麥胚或兔網(wǎng)織紅細(xì)胞)中進(jìn)行無(wú)細(xì)胞翻譯。體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)是商業(yè)上可獲得的，例如來(lái)自普洛麥格生物技術(shù)，麥迪遜，WI，BRL，Rockville，MD或英杰公司，卡爾斯巴德，CA。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，可以通過(guò)在合適的原核或真核系統(tǒng)中表達(dá)而產(chǎn)生更大量的構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽。例如，將部分或全部DNA分子(例如具有SEQIDNO:1-8的cDNA)插入到適合在細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌)或酵母細(xì)J包(例如釀酒酵母(S""/r"附j(luò);cescceviwV^))中表達(dá)的質(zhì)粒載體中，或插入到用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的桿狀病毒載體中。此類載體包含在宿主細(xì)胞中表達(dá)DNA所必需的調(diào)節(jié)元件，其放置的順序允許DNA在宿主細(xì)胞中表達(dá)。此類表達(dá)所需的調(diào)節(jié)元件包括啟動(dòng)子序列、轉(zhuǎn)錄起始序列和任選的增強(qiáng)子序列?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域公知的方法純化在重組原核或真核系統(tǒng)中通過(guò)基因表達(dá)產(chǎn)生的構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用商業(yè)上可獲得的表達(dá)/分泌系統(tǒng)，其中表達(dá)并從宿主細(xì)胞中分泌出來(lái)重組蛋白質(zhì)，從而使其容易地從周圍培養(yǎng)基中純化。如果不使用表達(dá)/分泌栽體，可選擇的方法包括通過(guò)親和分離純化重組蛋白質(zhì)，例如通過(guò)與特異性結(jié)合重組蛋白質(zhì)的抗體之間的免疫相互作用。此類方法是技術(shù)人員通常使用的。本發(fā)明的多肽也可以作為與一種或多種附加結(jié)構(gòu)域連接的融合蛋白質(zhì)而合成和表達(dá)，例如產(chǎn)生更具免疫性的肽，從而使重組的合成肽更容易分離，并能鑒定和分離抗體和表達(dá)抗體的B細(xì)胞等等。利于檢測(cè)和純化的結(jié)構(gòu)域包括例如金屬螯合肽(例如允許在固定化金屬上純化的多組氨酸束和組氨酸-色氨酸模塊)，允許在固定化免疫球蛋白上純化的蛋白A結(jié)構(gòu)域，和在FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)(ImmunexCorp,SeattleWash.)中應(yīng)用的結(jié)構(gòu)域。在純化結(jié)構(gòu)域和含基序的肽或多肽之間包含可切割的連接序列(例如因子Xa或腸激酶(英杰公司，圣地亞哥加利福尼亞))，以利于純化。例如，表達(dá)載體可以包括編碼表位的核酸序列，連接于其隨后為硫氧還蛋白和腸激酶切割位點(diǎn)的6個(gè)組氨酸殘基(見例如Williams,5/oc&挑/s^y1995，34:1787-1797;Dobeli，/VW""五x/m1998，12:404-14，)。組氨酸殘基有利于檢測(cè)和純化，而腸激酶切割位點(diǎn)提供用于從剩余的融合蛋白質(zhì)中純化表位的方法。編碼融合蛋白質(zhì)的載體的相關(guān)技術(shù)和融合蛋白質(zhì)的應(yīng)用在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述(見例如Kroll,DA^CW/.說(shuō)W.1993，12:441-53)。肽?？梢允褂脧目Х戎屑兓蛑亟M制備的構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽根據(jù)已知方法產(chǎn)生此處定義的多克隆或單克隆抗體、抗體片段或衍生物。如果抗體對(duì)于構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽具有特異性，那么抗體也可以是識(shí)別和結(jié)合本發(fā)明的構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽的片段。例如，如果蛋白質(zhì)或DNA分析和克隆分析(見如下)表明克隆的基因?qū)儆诙嗷蚣易?，那么可以產(chǎn)生由相應(yīng)于蛋白質(zhì)非保守區(qū)域的合成肽所形成的成員特異性抗體。用于此處描述的任意目的的包含本發(fā)明抗體的試劑盒也包括在本發(fā)明的范疇之內(nèi)。通常，此類試劑盒包括具有免疫特異性抗體的對(duì)照抗原。綠原酸可能在人類健康的多方面起作用。已經(jīng)證明綠原酸在體外是強(qiáng)的抗氧化劑(Rice-Evands，CA等人1996)，其在體外具有對(duì)抗DNA損傷的保護(hù)性作用(Shibata，H等人1999)，具有抗癌和抗誘變性質(zhì)，并且可能最終減少特定癌癥的風(fēng)險(xiǎn)(Olthof，MR等人2001;和Hollman，PC2001)，和可能防御心血管疾病(Olthof，MR等人2001;和Hollman,PC2001)。綠原酸的這些有益健康的作用仍需要詳細(xì)說(shuō)明，而且還假設(shè)其具有許多目前未知的其他有益健康的作用。相應(yīng)地，此處描述和例舉的構(gòu)成綠原酸生物合成途徑的咖啡多肽預(yù)期可以用于多種食品、健康的應(yīng)用。例如，構(gòu)成綠原酸生物合成途徑的咖啡多肽、或其各自的綠原酸產(chǎn)物可以用作食品添加物、或用于多種食品和飲料產(chǎn)品。獲得構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽的上述一種或多種應(yīng)用，以利用重組生物體(例如在畢赤酵母(尸Z"Vi戶肪toWs)或適合食品的乳酸桿菌、或植物細(xì)胞中)產(chǎn)生大量的純化蛋白質(zhì)，并且隨后以新的或已建立的測(cè)定方法來(lái)測(cè)試蛋白質(zhì)用作抗氧化劑、化學(xué)防護(hù)或化學(xué)治療、促進(jìn)心血管健康的可能性等等?？梢允褂眠@些蛋白質(zhì)產(chǎn)生的綠原酸根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)合適的已建立或發(fā)展的方法來(lái)進(jìn)行類似的測(cè)試。如果認(rèn)為特異純化的蛋白質(zhì)、或此類蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的綠原酸產(chǎn)物特別有用，那么也可以從富含那些構(gòu)成類苯基丙烷途徑的特定多肽的咖啡粒中分離那些蛋白質(zhì)和它們的綠原酸產(chǎn)物的天然版本。載體、細(xì)胞、組織和植物根據(jù)本發(fā)明，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞的載體和試劑盒也被表征，所有寡核苷酸，或其正向或反向的同源物、類似物或變體，或在細(xì)胞或組織特異性啟動(dòng)子和其他調(diào)節(jié)序列控制下的報(bào)告基因和其他構(gòu)建體。合適的宿主細(xì)胞包括(但不限于)植物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、酵母和其他真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)化多種這些宿主細(xì)胞的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。它們包括(但是不限于)質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、桿狀病毒、桿粒、細(xì)菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)、以及其他細(xì)菌、酵母和病毒載體。通常產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞的試劑盒包含一種或多種合適的載體和用載體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的說(shuō)明書。試劑盒還包括一種或多種附加部分，例如培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基、用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的試劑和用于測(cè)試轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中基因表達(dá)的試劑，這里僅列出少許。本發(fā)明包括含有編碼構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽的基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝、或抑制植物內(nèi)源的構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽的產(chǎn)生和功能的核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物。這可以通過(guò)用轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)基因包含如下所述由天然或重組的調(diào)節(jié)序列控制的構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽的部分或全部編碼序列、或其突變體、反義序列或變體、包括RNA。轉(zhuǎn)基因植物咖啡種優(yōu)選包括(不限于)C.a6eoA:wtoe、阿拉比卡咖啡、Cl"r"oM"鼎、Ca,"H^附/e"51/51,dew^f/my/s、卡尼福拉咖啡、Ccwige"51/51Ccfewvm'、Ce;cce&fl、Ce"gewi》/cfes和C/rete/wflr/yA:、CA:tf/mA;a似、Ch^似/"""和Cz""g"e6肌Vieo本發(fā)明也包括任意物種的植物；這些包括(但不限于)煙草、擬南芥和其他"可實(shí)驗(yàn)室使用"的物種，谷類作物例如玉米、小麥、稻、大豆、大麥、黑麥、燕麥、高粱、苜蓿、三葉草等等，產(chǎn)油植物例如油菜、紅花、向日葵、花生、可可等等，蔬菜作物例如番茄特梅提諾、馬鈴薯、胡椒、茄子、甜菜、胡蘿卜、黃瓜、萵苣、豌豆等等，園藝植物例如紫菀、秋海棠、菊、翠雀、牽牛花、百日草、菌苔(lawii)和草坪草等等?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)植物轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。這些包括(但不限于)農(nóng)桿菌載體、原生質(zhì)體的聚乙二醇處理、生物射彈DNA遞送、紫外激光微束、復(fù)染色體病毒載體或其他植物病毒栽體、原生質(zhì)體的磷酸鉤處理、分離的原生質(zhì)體的電穿孔、在含用轉(zhuǎn)化DNA包被的微珠的溶液中攪拌細(xì)胞懸液、直接攝取DNA、脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA攝取等等。此類方法已在本領(lǐng)域中公開。見例如植物分子生物學(xué)方法(Weissbach和Weissbach，編輯，1988);植物分子生物學(xué)方法(Schuler和Zielinski,編輯，1989);植物分子生物學(xué)手冊(cè)(Gelvin,Schilperoort，Verma，編輯，1993);植物分子生物學(xué)方法-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Maliga，Klessig,Cashmore，Gruissem&Varner,編輯，1994)。轉(zhuǎn)化的方法依賴于被轉(zhuǎn)化的植物。農(nóng)桿菌屬載體通常用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物物種。農(nóng)桿菌二元載體包括(但不限于)BIN19和其衍生物、pBI載體系列、和二元載體pGA482、pGA492、pLH7000(基因文庫(kù)登錄號(hào)AY234330)和任意合適的pCAMBIA載體之一(衍生自Hajdukiewicz，Svab和Maliga，(1994)PlantMolBiol25:989-994中構(gòu)建的pPZP載體，獲自CAMBIA，GPOBox3200，CanberraACT2601，Australia,或者通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)的CAMBIA.org獲得)。對(duì)于單子葉植物物種的轉(zhuǎn)化，核轉(zhuǎn)化中常用的是以轉(zhuǎn)化DNA包被的顆粒和以轉(zhuǎn)化DNA包被的硅纖維進(jìn)行生物射彈轟擊?？蛇x擇地，農(nóng)桿菌"超二元，，載體已成功用于轉(zhuǎn)化稻、玉米和多種其他單子葉植物物種。用于轉(zhuǎn)化選定植物而構(gòu)建的DNA包含有效連接于5，調(diào)節(jié)序列(例如啟動(dòng)子和翻譯調(diào)節(jié)序列)和3'調(diào)節(jié)序列(例如終止子)的目的編碼序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用在天然的5'和3，調(diào)節(jié)元件控制下的編碼構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽的編碼序列。在其他實(shí)施方案中，交換編碼和調(diào)節(jié)序列從而改變具有改良表型(例如香味、香氣或其他特征)的轉(zhuǎn)化植物的種子中的蛋白質(zhì)含量。在一個(gè)可選擇實(shí)施方案中，基因的編碼序列置于強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子之下，例如花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子或玄參花葉病毒35S啟動(dòng)子。本發(fā)明中可以使用的其他組成型啟動(dòng)子包括(但不限于)T-DNA甘露堿合酶、胭脂堿合酶和章魚堿合酶啟動(dòng)子。在其他實(shí)施方案中，使用強(qiáng)的單子葉植物啟動(dòng)子，例如玉米泛素蛋白啟動(dòng)子、稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或稻微管蛋白啟動(dòng)子(Jeon等人，PlantPhysiology.123:1005-14，2000)。本發(fā)明的范疇之內(nèi)也包含具有在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下表達(dá)構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽的編碼序列的轉(zhuǎn)基因植物。誘導(dǎo)型植物啟動(dòng)子包括四環(huán)素抑制子/操縱子控制的啟動(dòng)子、熱激基因啟動(dòng)子、脅迫(例如創(chuàng)傷)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、防御應(yīng)答基因啟動(dòng)子(例如苯丙氨酸氨裂解酶基因)、創(chuàng)傷誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子(例如富含羥脯氨酸的細(xì)胞壁蛋白質(zhì)基因)、化學(xué)誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子(例如硝酸鹽還原酶基因、葡聚糖酶基因、甲殼酶基因等等)和黑暗誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(例如天冬酰胺合成酶基因)，這里僅列出少許。本發(fā)明中也^f吏用組織特異型和發(fā)育特異型啟動(dòng)子。種子特異型啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括Ciml(細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)的通信)、cZWBl(玉米l9kDa玉米醇溶蛋白)、milps(myo-肌醇-l-磷酸合酶)、和celA(纖維素合酶)(美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)09/377,648)、大豆p-菜豆球蛋白、油菜籽蛋白、p-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白、玉米15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、蠟、shrunken1、shrunken2、和球蛋白1、大豆11S豆球蛋白(Baumlein等人，1992)、和卡尼福拉咖啡11S種子儲(chǔ)存蛋白(Marraccini等人，1999，PlantPhysiol.Biochem.37:273-282)。也見WO00/12733，其中公開了來(lái)自endl和end2基因的種子優(yōu)選型啟動(dòng)子。也可以使用其他咖啡種子特異型啟動(dòng)子，包括36(但不限于)在共有的PCT申請(qǐng)?zhí)朥S2006/026121中描述的油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子、在共有的PCT申請(qǐng)?zhí)朥S2006/026234中描述的脫水蛋白(dehydrin)基因啟動(dòng)子、和在共有的PCT申請(qǐng)?zhí)朥S2006/34402中描述的9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素二氧化酶基因啟動(dòng)子。其他組織特異型啟動(dòng)子的實(shí)例包括(但不限于)二磷酸核酮糖羧化酶(RuBisCo)小亞基基因啟動(dòng)子(例如Marracini等人，2003中描述的咖啡小亞基啟動(dòng)子)或在光合作用組織中表達(dá)的葉綠素a/b結(jié)合蛋白(CAB)基因啟動(dòng)子；和期望在根中表達(dá)的根特異型谷氨酸合成酶基因啟動(dòng)子。編碼區(qū)也有效連接于合適的3，調(diào)節(jié)序列。在不使用天然3，調(diào)節(jié)序列的實(shí)施方案中，可以使用胭脂堿合酶多腺苷酸化區(qū)域。其他有用的3，調(diào)節(jié)區(qū)包括(但不限于)章魚堿合酶多腺苷酸化區(qū)域。在合適調(diào)節(jié)元件控制之下的可篩選編碼區(qū)有效連接于核抗藥性標(biāo)簽，例如卡那霉素抗性。其他有用的可篩選標(biāo)簽系統(tǒng)包括給予抗生素或除草劑抗性的基因(例如對(duì)潮霉素、磺酰脲、膦絲菌素或草甘膦的抗性)、或給予選擇性生長(zhǎng)的基因(例如磷酸甘露糖異構(gòu)酶，使植物細(xì)胞能夠在甘露糖上生長(zhǎng))。可篩選標(biāo)簽基因包括(但不限于)編碼抗生素抗性的基因，例如那些編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NEO)、二氫葉酸還原酶(DHFR)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的基因，以及給予對(duì)除草劑化合物的抗性的基因，例如草甘膦抗性EPSPS和/或草甘膦氧化還原酶(GOX)、抗溴草腈的溴草腈腈水解酶(BXN)、抗咪唑啉酮的AHAS基因、磺酰脲抗性基因、和2，4-二氯苯氧乙酸鹽(2，4-D)抗性基因。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明包含的啟動(dòng)子和其他表達(dá)調(diào)節(jié)序列有效連接于報(bào)告基因。本發(fā)明中使用的報(bào)告基因包括(但不限于)編碼綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(DsRed)、藍(lán)綠色熒光蛋白(CFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、?？?Cerianthus)橙色熒光蛋白(cOFP)、堿性磷酸酶(AP)、卩-內(nèi)酰胺酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、腺苷脫氨基酶(ADA)、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo、G4181)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPH)、胸苷激酶(TK)、lacZ(編碼a-半乳糖苷酶)、和黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)、p-葡萄糖醛酸苷酶(gus)、胎盤堿性磷酸酶(PLAP)、分泌的胚胎堿性磷酸酶(SEAP)、或螢火蟲或細(xì)菌熒光素酶(LUC)的基因。根據(jù)與本發(fā)明實(shí)踐相聯(lián)系的許多標(biāo)準(zhǔn)操作，技術(shù)人員可以了解具有標(biāo)簽或報(bào)告基因功能的附加序列。本領(lǐng)域公知，額外序列的修飾可以增強(qiáng)細(xì)胞宿主中的基因表達(dá)。這些#^飾包括除去編碼多余的多腺苷酸化信號(hào)、外顯子-內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號(hào)、轉(zhuǎn)座子類重復(fù)的序列，和其他此類可能有害于基因表達(dá)的已良好表征的序列?？蛇x擇地，如果需要，可以將編碼序列的G/C含量調(diào)節(jié)到給定咖啡植物細(xì)胞宿主的平均水平，通過(guò)參考在咖啡植物細(xì)胞中表達(dá)的已知基因來(lái)計(jì)算。同樣，如果可能，可以修飾編碼序列從而避免預(yù)測(cè)的mRNA的發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)。另一個(gè)增強(qiáng)基因表達(dá)的可選擇方法是使用5，前導(dǎo)序列。翻譯前導(dǎo)序列是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的，其包括煙草花葉病毒5，前導(dǎo)序列(w)的順式-作用衍生物(co，)，雀麥草花葉病毒、苜?；ㄈ~病毒和蕪蕢黃花葉病毒的5'前導(dǎo)序列。轉(zhuǎn)化植物并隨后篩選一種或多種性質(zhì)，包括轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的存在、轉(zhuǎn)基因編碼的mRNA、或與轉(zhuǎn)基因的表達(dá)相關(guān)的改變的表型。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到在轉(zhuǎn)化的植物中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的量以及其組織特異型和瞬時(shí)特異型表^^莫式可以依賴于其插入到核基因組中的位點(diǎn)而改變。此類位點(diǎn)效應(yīng)是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的。為此，應(yīng)該再生幾個(gè)核轉(zhuǎn)化體并測(cè)試轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。方法可以在許多方法的任意一種中使用本發(fā)明的核酸和多肽，其中可以在咖啡植物中表達(dá)蛋白質(zhì)產(chǎn)物，從而使蛋白質(zhì)行使保護(hù)植物免受感染或氧化脅迫的作用，并JU吏表達(dá)該蛋白質(zhì)的咖啡植物豆最終所產(chǎn)生的咖啡々大料或咖啡產(chǎn)品的香味和/或香氣有所增強(qiáng)。同樣，可以在許多方法的任意一種中使用本發(fā)明的多肽，其中由多肽合成的綠原酸和其他此類植物化學(xué)產(chǎn)物可以行使保護(hù)植物免受感染或氧化脅迫的作用，并且使含有綠原酸的咖啡植物豆最終所產(chǎn)生的咖啡飲料或咖啡產(chǎn)品的香味和/或香氣有所增強(qiáng)。關(guān)于保護(hù)植物避免疾病、且尤其是感染疾病的方面，已經(jīng)證明增加CGA產(chǎn)生可以減少植物對(duì)微生物感染的易感性。例如，在番茄植物中增加CGA的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致丁香假單胞菌(/^"^wiomw^r,Vig"e)細(xì)菌的:i^較慢和感染水平較低。(MggewegR，等人2004)。同樣，抑制CGA的產(chǎn)生會(huì)增加煙草植物對(duì)真菌感染的易感性。(MaherEA等人1994)。此類研究強(qiáng)調(diào)了類苯基丙烷的重要性(例如CGA有助于植物健康)。因此操作植物(例如咖啡)中構(gòu)成綠原酸生物合成途徑的多肽產(chǎn)物的能力，或者甚至使用本發(fā)明多核苷酸和蛋白質(zhì)檢測(cè)有關(guān)基因表達(dá)的能力，將使研究和操縱咖啡植物對(duì)病原體的應(yīng)答成為可能。由此，可能產(chǎn)生遺傳修飾的咖啡植物，其對(duì)植物病原體(尤其是咖啡植物病原體)的抗性增加。咖啡病原體的實(shí)例包括"咖啡銹病"的病原體咖啡銹菌(及e附,7"avflWa^x:)、和"咖啡漿果病"的病原體咖啡漿果病原體(CW/etorn'cA"附coj^a""ifi)、和"咖啡枯萎，，的病原體丁香假單胞菌咖啡致病變種(i^ewfifo附做w明的一個(gè)方面描述在植物中(優(yōu)選在咖啡植物中)通過(guò)調(diào)控構(gòu)成類苯基丙烷方法。關(guān)于保護(hù)植物避免氧化脅迫的方面，已經(jīng)證明綠原酸在植物中具有抗氧化劑的能力。在許多植物物種中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)環(huán)境脅迫，例如高亮度、低溫、植物組織損傷、氮缺乏和感染可以觸發(fā)CGA的生物合成。(GraceSC等人2000)。已經(jīng)證明綠原酸具有清除自由基的性質(zhì)(OhnishiM等人l"4)，包括清除2，2，-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-硫酸的穩(wěn)定綠色自由基正離子和超氧負(fù)離子。(GraceSC等人2000)。在植物中，光脅迫(例如過(guò)亮)下或暴露于環(huán)境污染物(例如臭氧)中，會(huì)形成氧化劑。因此，對(duì)植物中構(gòu)成綠原酸生物合成途徑的多肽產(chǎn)物操作的能力，或者甚至使用本發(fā)明多核苷酸和蛋白質(zhì)檢測(cè)此類基因表達(dá)的能力，會(huì)使研究和操作咖啡植物響應(yīng)環(huán)境脅迫和產(chǎn)生氧化物種成為可能。由此，可能產(chǎn)生遺傳上修飾的咖啡植物，其在強(qiáng)烈或延長(zhǎng)的環(huán)境脅迫條件下能夠更好的健康生長(zhǎng)和進(jìn)行作物生產(chǎn)。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面描述在植物中(優(yōu)選在咖啡植物中)通過(guò)調(diào)控構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽的表達(dá)和調(diào)控植物中的綠原酸諳來(lái)增強(qiáng)自由基清除作用的方法。關(guān)于烘焙的咖啡粒的香^^未和香氣方面，預(yù)期通過(guò)烘焙過(guò)程中存在的麥拉德反應(yīng)，憑借蛋白質(zhì)自身的含量、或它們所產(chǎn)生的產(chǎn)物例如綠原酸，使構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽對(duì)咖啡后代的香味產(chǎn)生一定的影響。蛋白質(zhì)、尤其是蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物(肽和氨基酸)代表重要的香味前體組(Spanier等人，2004)。因此，相對(duì)豐富的蛋白質(zhì)(例如構(gòu)成類苯基丙烷途徑的蛋白質(zhì))可以促進(jìn)咖啡烘焙過(guò)程中出現(xiàn)的香味生成反應(yīng)。此類作用可能取決于咖啡豆中蛋白質(zhì)自身的濃度，或蛋白質(zhì)所最終產(chǎn)生的綠原酸的濃度。與此處所述方法一致，本發(fā)明的多核苷酸提供了監(jiān)測(cè)(例如通過(guò)標(biāo)簽輔助的育種)或操作構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽的蛋白質(zhì)表達(dá)譜的能力。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面描述在植物(優(yōu)選咖啡)中改變構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽的傳的方法，包含在植物中增加或減少一種或多種構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽的量或活性。例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，編碼被用于轉(zhuǎn)化植物從而增加植物中多肽的產(chǎn)生。可選擇地，構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽的編碼區(qū)有效連接于異源表達(dá)控制區(qū)，例如組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中，可能希望在植物中減少一種或多種構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽的產(chǎn)生。這可以通過(guò)幾種方法實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)篩選天然存在的變體從而找到構(gòu)成類苯基丙烷途徑多肽的表達(dá)減少的變體，或通過(guò)篩選天然存在的變體從而找到多種綠原酸水平降低的變體。例如，創(chuàng)造功能缺失(無(wú)效)突變的植物或從當(dāng)前可獲得的植物突變體種群中篩選。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解也可以利用一種或多種此處所述方法在突變體植物種群中篩選過(guò)表達(dá)特定的構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽的突變體?？梢酝ㄟ^(guò)化學(xué)誘變、輻射誘變和轉(zhuǎn)座子或T-DNA插入、或基因組中定向誘導(dǎo)的局部損傷(TILLING,見例如Henikoff等人，2004，PlantPhysiol.135(2):630-636;Gilchrist&Haughn，2005，Curr.Opin.PlantBiol.8(2):211-215)來(lái)形成突變體種群。形成突變體種群的方法是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的?？梢允褂帽景l(fā)明的核酸鑒定在多種植物物種中構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽的突變體。在例如玉米或擬南芥種中，其中轉(zhuǎn)座子插入的品系是可獲得的，可以設(shè)計(jì)寡核苷酸引物來(lái)篩選編碼構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽的基因的插入品系。通過(guò)育種，可以隨后發(fā)展斷裂基因的雜合或純合的植物品系。也可以設(shè)計(jì)植物使其展現(xiàn)與誘變技術(shù)所產(chǎn)生的無(wú)效突變相似的表型?？梢酝ㄟ^(guò)表達(dá)所選的構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽的突變形式產(chǎn)生"顯性負(fù)效應(yīng)"，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因無(wú)效突變。此類突變蛋白質(zhì)與野生型蛋白質(zhì)竟?fàn)幗Y(jié)合蛋白質(zhì)或其他細(xì)胞因子，但是并不是將本發(fā)明限制于任一個(gè)機(jī)制。此類"顯性負(fù)效應(yīng)"的實(shí)例對(duì)于昆蟲和脊推動(dòng)物系統(tǒng)都是熟知的(Radke等人，1997，Genetics145:163-171;Kolch等人，1991，Nature349:426-428)。轉(zhuǎn)基因無(wú)效突變的另一個(gè)類型可以通過(guò)用"轉(zhuǎn)錄后基因沉默"抑制編碼類苯基丙烷途徑酶的mRNA的翻譯來(lái)產(chǎn)生。可以利用來(lái)自定向下調(diào)物種的基因或其片段來(lái)控制編碼蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。為此目的可以使用全長(zhǎng)的反義分子?？蛇x擇地，可以利用靶向?qū)Ψg很重要的mRNA的特定區(qū)域的反義寡核苷酸。使用反義分子降低預(yù)定基因的表達(dá)水平是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。反義分子可以由含有DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞原位提供，該構(gòu)建體通過(guò)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義RNA序列?？梢栽O(shè)計(jì)此類構(gòu)建體來(lái)產(chǎn)生全長(zhǎng)或部分的反義序列。通過(guò)轉(zhuǎn)基因來(lái)過(guò)量表達(dá)基因編碼序列的正義和反義RNA從而產(chǎn)生大量的dsRNA，可以增強(qiáng)此類基因沉默效應(yīng)(例如見Waterhouse等人，1998，PNAS2^:13959-13964)。在這一方面，含有對(duì)應(yīng)于至少一個(gè)內(nèi)含子的部分或全部序列的dsRNA尤其有效。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)轉(zhuǎn)基因表達(dá)部分或全部的編碼序列的反義鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)使用當(dāng)前對(duì)植物系統(tǒng)有效的多種其他轉(zhuǎn)錄后基因沉默(RNA沉默)技術(shù)來(lái)使編碼類苯基丙烷途徑酶的基因沉默。RNA沉默涉及雙鏈RNA(dsRNA)通過(guò)基于RNA酶H的酶("Dicer"或41"Dicer類")形成小的21-28個(gè)核苷酸的片段的過(guò)程。剪切產(chǎn)物為siRNA(小的干涉RNA)或miRNA(微小RNA)，它們摻入蛋白質(zhì)效應(yīng)復(fù)合物中以序列特異性方式調(diào)控基因表達(dá)(植物中RNA沉默的綜述見Horiguchi，2004，Differentiation72:65-73;Baulcombe，2004,Nature431:356-363;Herr，2004，Biochem.Soc.Trans.32:946-951)。可以化學(xué)合成或在體外轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增小的干涉RNA，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中?？梢酝ㄟ^(guò)顯微注射(TuschlT等人，2002)、化學(xué)轉(zhuǎn)染(AgrawalN等人，2003)、電穿孔或陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(BmmmelkampTR等人，2002;ElbashirSM等人，2002)、或?yàn)榧夹g(shù)人員所理解的本領(lǐng)域的任意其他有效方法進(jìn)行轉(zhuǎn)移?？蛇x擇地，可以通過(guò)例如質(zhì)粒的方法向目的細(xì)胞中插入siRNA的DNA模板，從而在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA(TuschlT等人，2002)，且siRNA也可以特異性地靶向所選細(xì)胞。已經(jīng)可以將小的干涉RNA成功引入到植物中(KlahreU等人，2002)。本發(fā)明中優(yōu)選的RNA沉默的方法是使用短的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(shRNA)。通過(guò)常用方法將包含編碼特定siRNA序列的DNA序列的載體轉(zhuǎn)移到耙細(xì)胞中。一旦在細(xì)胞中，DNA序列即持續(xù)轉(zhuǎn)錄成RNA分子，它們自身形成環(huán)狀并且通過(guò)分子內(nèi)堿基配對(duì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這些發(fā)夾結(jié)構(gòu)經(jīng)細(xì)胞處理后等同于siRNA分子，被細(xì)胞用于介導(dǎo)所希望蛋白質(zhì)的RNA沉默。Horiguchi,2004，s"/;ni中描述了在植物中用于RNA沉默的特定用途的多種構(gòu)建體。通常，此類構(gòu)建體包含啟動(dòng)子、要沉默的靶基因"正義"方向的序列、間隔、靶基因的反義序列和終止子。如果希望在多數(shù)或所有植物組織中表達(dá)，那么可以使用強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子(例如CaMV35S啟動(dòng)子)。同樣，如上所述，在其他實(shí)施方案中也可以選擇組織特異型、發(fā)育特異型或順時(shí)特異型啟動(dòng)子。通過(guò)"共抑制，，技術(shù)也可以產(chǎn)生其他類型的合成的無(wú)效突變(Vaucheret等人，1998，PlantJ.16(6):651-659)。用靼向抑制的內(nèi)源基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。在許多情況下，這樣會(huì)導(dǎo)致天然基因和轉(zhuǎn)基因的完全抑制。在一個(gè)實(shí)施方案中，將來(lái)自目的植物物種的編碼構(gòu)成類苯基丙烷途徑多肽的基因分離并用于轉(zhuǎn)化同物種的細(xì)胞。通過(guò)任意上述方法產(chǎn)生的突變體或轉(zhuǎn)基因植物也具有與本發(fā)明一致的特征。優(yōu)選地，植物是可育的，因而可用于育種的目的。因此，展現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)上述所希望表型的突變體或植物可以用于植物育種，或直接應(yīng)用于農(nóng)業(yè)或園藝。它們也可以作為研究工具用于進(jìn)一步闡明構(gòu)成類苯基丙烷途徑的多肽在與色素和光合作用相關(guān)聯(lián)的咖啡種子的香味、香氣和其他特征中的參與作用。包含轉(zhuǎn)基因或特異性突變的植物也可以與包含互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因或基因型的植物雜交，從而產(chǎn)生具有增強(qiáng)或組合表型的植物。本發(fā)明也描述了在植物中以種子優(yōu)選或種子特異性方式產(chǎn)生任意選擇的異源基因產(chǎn)物的組合物和方法。目的編碼序列在種子特異型咖啡啟動(dòng)子和其他合適的調(diào)節(jié)序列的控制之下，從而產(chǎn)生種子特異性的嵌合基因。通過(guò)任意此處所述或本領(lǐng)域內(nèi)已知的轉(zhuǎn)化方法將嵌合基因引入到植物細(xì)胞中。用于在植物中產(chǎn)生多種目的基因產(chǎn)物的這些嵌合基因和方法包括(但不限于)(l)如上述列舉的可檢測(cè)的基因產(chǎn)物，例如GFP或GUS;("具有農(nóng)學(xué)或園藝優(yōu)勢(shì)的基因產(chǎn)物，例如那些酶活性導(dǎo)致產(chǎn)生孩支量營(yíng)養(yǎng)素(例如維生素原A，也稱為p-胡蘿卜素)或抗氧化劑(例如抗壞血酸、co脂肪酸、蕃茄紅素、異戊二烯、萜類)的基因產(chǎn)物；或(3)控制病原體或害蟲的基因產(chǎn)物，例如Mourgues等人，(1998),TibTech16:203-210中所描述的，或者其他已知的保護(hù)植物種子或防御病原體侵害的基因產(chǎn)物。下述實(shí)施例提供對(duì)本發(fā)明更詳細(xì)的描述。實(shí)施例意在說(shuō)明而非限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1用于RNA提取的植物材料在發(fā)育不同階段新鮮收獲的根、嫩葉、莖、花和果實(shí)來(lái)自阿拉比卡咖啡丄.cv.CVi/Mmir-2卵，嫩葉組織從Tours(25°C，70RH)溫室條件下生長(zhǎng)的卡尼福拉咖啡變種羅巴斯特種BP409收獲。所有來(lái)自卡尼福拉咖啡BP-409的其他組織在EastJava,印度尼西亞的田地生長(zhǎng)。發(fā)育階段定義如下少綠色果實(shí)(SG)、大綠色果實(shí)(LG)、黃色果實(shí)(Y)和紅色果實(shí)(R)。新鮮組織立即在液氮里冷凍，然后儲(chǔ)存于-80。C直到用于RNA提取。實(shí)施例2總RNA的提取方法、cDNA的產(chǎn)生和PCR反應(yīng)條件為找到在咖啡中控制綠原酸(CGA)合成關(guān)鍵步驟的編碼部分或全部咖啡酶HCT(羥基肉桂酰-輔酶A莽草酸酯/奎尼酸酯羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶)、HQT(羥基肉桂酰-輔酶A奎尼酸酯羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶)、C3H((對(duì))-香豆酰3，羥化酶)、和CCoAOMT(咖啡酰輔酶A-3-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶)的DNA序歹寸，用TBLASTN算法發(fā)現(xiàn)了與公用數(shù)據(jù)庫(kù)中編碼植物(例如蕃茄、煙草和擬南芥)HCT、HQT、C3H和CCoAOMT蛋白質(zhì)的序列具有高度相似性的咖啡單基因序列(Altschul等人，1990)。與各蛋白質(zhì)序列最佳匹配的各單基因的最長(zhǎng)cDNA之一隨后被全部測(cè)序。如果認(rèn)為最長(zhǎng)的EST所編碼的蛋白質(zhì)序列不包含完整的ORF,那么使用5，RACEPCR或者引物輔助的基因組步移來(lái)分離缺少的蛋白質(zhì)編碼序列。一旦建立起這些咖啡基因的每一個(gè)的完整開放讀碼框(ORF)序列，則對(duì)各個(gè)基因進(jìn)行基因表達(dá)分析從而證實(shí)從EST數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的預(yù)期的表達(dá)信息。根據(jù)Rogers等人(1999)的方法，從阿拉比卡咖啡(T230804-2003)和卡尼福拉咖啡(BP409)四個(gè)不同的成熟期一少綠色("SG")、大綠色("LG")、黃色("Y，，)、和紅色("R")的不同組織，即根、莖、葉、花、果皮和顆粒中提取RNA。根據(jù)兩種不同方法從提取的RNA制備cDNA。在第一種方法中，從ljtg總RNA和50ng寡聚dT州(希格瑪化學(xué)有限公司(SigmaChemicalCo.),St.Loius，MO)制備各個(gè)特異性的cDNA樣品，具體如下將1照總RNA樣品和寡聚dT懸浮于體積為12pi的DEPC處理的水中。該混合物在70°C培育10分鐘，隨后迅速在冰上冷卻。然后，加入4.0nl第一鏈緩沖液5x(英杰公司)、2.0pi的0.1MDTT(英杰公司)和1.0pi的dNTP混合物(各10mM，英杰公司)。這些反應(yīng)混合物在42。C培育2分鐘，然后加入1.0plSuperscriptIIIRNA酶H-反轉(zhuǎn)錄酶(200U/fil)(英杰公司)。然后在25'C反應(yīng)10分鐘，42。C反應(yīng)50分鐘，隨后在70。C加熱10分鐘使酶失活。將產(chǎn)生的cDNA樣品用無(wú)菌水稀釋10倍，儲(chǔ)存于-20'C用于不同實(shí)驗(yàn)(RT-PCR、實(shí)時(shí)RT-PCR、5，和3，RACE和全長(zhǎng)cDNA克隆的分離)。在第二種方法中，將1jig總RNA樣品和870ng寡聚dT(Proligo)混懸于終體積為13jd的DEPC處理的水中來(lái)制備特異性cDNA樣品。將該混合物在65'C培育5分鐘使核酸變性，然后將樣品置于水上。接著加入轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)緩沖液(羅氏公司(Roche))到1x濃度，并加入10.0U的核糖核酸酶抑制劑(希格瑪公司(Sigma))、最終1mM的各dNTP(羅氏公司)和10U的轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄酶(20U/jil)(羅氏公司)。將20jil反應(yīng)體系渦旋混合，然后短暫離心?；旌衔镌?5"C培育50分鐘，然后向反應(yīng)體系中加入1.0U的RNA酶H(英杰公司)，再于37。C培育30分鐘。樣品隨后儲(chǔ)存于-20'C。使用5，RACE系統(tǒng)用cDNA末端快速擴(kuò)增試劑盒(英杰公司)根據(jù)制造商說(shuō)明書進(jìn)行5次不同的5，RACE反應(yīng)。首先純化該實(shí)驗(yàn)中所使用的cDNA制品，從而除去任何未摻入的核苷酸(因?yàn)樗鼈儠?huì)干擾dC加尾反應(yīng))。使用S.N.A.P柱(英杰公司)根據(jù)制造商說(shuō)明書進(jìn)行純化。純化以后，在50pl無(wú)菌水中恢復(fù)cDNA，然后在用于5，RACEPCR之前儲(chǔ)存于-20。C。所有的5，RACE實(shí)驗(yàn)都以各特異性S.N.A.P.純化的cDNA的TdT尾開始。多聚dC加尾反應(yīng)如下5nl純化的cDNA、11.5filDEPC處理的水、5pl5xTdT加尾緩沖液(英杰公司)和2.5jil2mMdCTP組成25jil的反應(yīng)體系。反應(yīng)在94。C進(jìn)行3分鐘，隨后在冰上冷卻。然后加入lfilTdT，在37。C反應(yīng)10分鐘。在65。C加熱10分鐘以終止反應(yīng)，并隨后置于冰上。在最終體積為50jd的體系中進(jìn)行第一輪5，RACEPCR反應(yīng)，體系如下5jil的各加尾的cDNA、5fil10xPCR緩沖液(ThermoPol緩沖液)、400nM各基因特異性引物1(GSP1)和縮短的錨定引物(AAP)(不同的GSP和其他引物列于表1中)、200jiM各dNTP和2.5UTaqDNA聚合酶(BioLabs)。第一輪PCR循環(huán)條件如下94。C2分鐘；然后94。C1分鐘、退火溫度(表2中所示)1分鐘和72°C2分鐘，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。附加72°C7分鐘的最終延伸步驟。隨后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色來(lái)分析PCR產(chǎn)物。在最終體積為50jil的體系中進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，體系如下5pl1%稀釋的PCR(第一輪)產(chǎn)物、5^110xPCR緩沖液(LA緩沖液II加Mg++)、200nM各GSP2引物(基因特異性引物2)和縮短的通用擴(kuò)增引物(AUAP)(見表1中的引物)、200nM各dNTP和0.5U的TakaraLATaqDNA聚合酶(康柏生物科學(xué)(CambrexBioScience)),PCR循環(huán)條件如下94°C2分鐘；然后94。Cl分鐘、退火溫度(表2中所示)1分鐘和72。C1.5分鐘，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。附加72'C7分鐘的最終延伸步驟。隨后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色來(lái)分析PCR產(chǎn)物。表l.5，RacePCR實(shí)驗(yàn)中使用的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>表2.5，RacePCR實(shí)驗(yàn)的引物和退火溫度<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>存在的cDNA序列和從5，RACE或引物輔助的基因組步移實(shí)驗(yàn)中獲得的新的5'序列用于設(shè)計(jì)5，和3，UTR序列中的引物，用來(lái)擴(kuò)增包含CcHCT、CaHCT、CcHQT、CaHQT、CaCCoAOMT畫Ll和CcCCoAOMT-L2完全ORF序列的靶cDNA序列。用上述cDNA合成的第一種方法來(lái)制備用于分離這些完全ORFDNA序列的所有cDNA。在各基因ATG起始密碼子上游區(qū)域和3，UTR中設(shè)計(jì)兩個(gè)基因特異性引物，它們?cè)诒?中給出。表4中列出在不同PCR反應(yīng)中使用的特異性cDNA和退火溫度。對(duì)于CcJ7CT(pMLl)(SEQIDNO:l)、CflHCT(pML5)(SEQIDNO:2)、(pML2)(SEQIDNO:3)、CVi邵71(pML3)(SEQIDNO:4)和CcCO^OiWT-ZJ(pNT4)(SEQIDNO:8)，在50jil反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，體系如下5jilcDNA(表4)、5jil10xPCR緩沖液(LA緩沖液II加Mg++)、800nM各基因特異性引物、200fiM各dNTP和0.5UTakaraLATaqDNA聚合酶(康柏生物科學(xué))。94變性2分鐘以后，在94°C1分鐘、退火溫度(表4)1分鐘和72X:延伸2分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增(除CcCO^OiWT-Z^(SEQIDNO:8)以外，其擴(kuò)增40個(gè)循環(huán))。附加72°C7分鐘的最終延伸步驟。隨后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色來(lái)分析PCR產(chǎn)物。然后根據(jù)制造商提供的說(shuō)明書用測(cè)序用TOPOTA克隆試劑盒(英杰公司)將預(yù)期大小的片段克隆到pCR4-TOPO中。隨后對(duì)產(chǎn)生的質(zhì)粒的插入序列進(jìn)行全部測(cè)序。對(duì)于CaCCoAOMT-Ll(pNT8)(SEQIDNO:7)，在50fil反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，體系如下5jilcDNA(表4)、5jil10xPCR緩沖液(克隆Pfu反應(yīng)緩沖液)、400nM各基因特異性引物、200jiM各dNTP和1.25UPfuTurboDNA聚合酶。94變性2分鐘以后，在94'C1分鐘、55。Cl分鐘和72'C延伸2分鐘，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。附加72。C7分鐘的最終延伸步驟。隨后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色來(lái)分析PCR產(chǎn)物。然后根據(jù)制造商提供的說(shuō)明書(pENTR定向TOPO克隆試劑盒，英杰公司)將預(yù)期大小的片段以5，到3，方向克隆到pENTR/D-TOPO中。產(chǎn)生的質(zhì)粒的插入序列(pNT8)隨后進(jìn)行全部測(cè)序。表3.用于擴(kuò)增Cc/Tgr(^iktt2)、Oi^gr、Cc必CT(^/ktt"、<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表4.分離ORF的退火溫度<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>CcCCoAOMT-L2BP糾9(黃色顆粒)CCoAOMT-L2-FullUp/56/5755。C(pNT4)CCoAOMT-L2-FullLow根據(jù)如下方法對(duì)亞克隆到質(zhì)粒中的cDNA進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)制造商提供的說(shuō)明書用Qiagen試劑盒從宿主中純化質(zhì)粒DNA。制備的重組質(zhì)粒DNA和PCR產(chǎn)物用Sanger等人的雙脫氧終止法通過(guò)GATCBiotechAG(Konstanz，德國(guó))進(jìn)行測(cè)序?？梢詫?duì)從5，RACE和基因組步移實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的獨(dú)特PCR產(chǎn)物不經(jīng)純化和使用擴(kuò)增它們的特異性引物克隆即進(jìn)行測(cè)序，或者在克隆之后進(jìn)行測(cè)序。用LaserGene軟件包(DNASTAR)進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析。用BLAST程序確定其對(duì)基因庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)的序列同源性。(Altschul等人，19卯)。根據(jù)如下方法進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR。按制造商的推薦使用TaqMan-PCR試劑盒(AppliedBiosystems，Perkin國(guó)Elmer)，并且長(zhǎng)口先前Privat等人，2004中所述對(duì)通過(guò)上述第一種方法制備的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。TaqMan緩沖液包含AmpEraseUNG(尿嘧啶-N-糖基化酶)，其于50'C在最初2分鐘有活性，然后在PCR循環(huán)開始的95X:失活。使用PRIMEREXPRESS軟件(應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems))設(shè)計(jì)所用的Q-PCR引物和TaqMan探針，并在表5中列出。用相對(duì)定量的方法進(jìn)行定量，以組成型表達(dá)的核糖體蛋白rpl39作為基線參照。為使用相對(duì)定量方法，在使用確定引物和探針時(shí)的候選cDNA序列的擴(kuò)增效率要與參照序列(rpl39cDNA序列)的擴(kuò)增效率大致相等。為了確定這種相對(duì)的相等，將含有合適cDNA序列的質(zhì)粒DNA稀釋1/1000、1/10,000、1/100,000和1/1,000,000倍，并使用上述Q-PCR的條件；對(duì)于各質(zhì)粒/引物/TaqMan探針組計(jì)算曲線斜率Ct=f(DNA量的對(duì)數(shù))。質(zhì)粒/引物/TaqMan探針組給出的曲線斜率接近3.32是可以接受的，其代表100%的效率。在表5中列出的質(zhì)粒/引物/TaqMan探針組都給出可以接受的Ct==f(DNA量的對(duì)數(shù))值。所有的MGB探針都在5，末端以熒光報(bào)告基因染料6-羧基熒光素(FAM)標(biāo)記和在3，端具有淬滅染料6-羧基-4甲基-羅丹明(rhodamine)(TAMRA)，而RPL39探針在5，末端以熒光報(bào)告基因染料VIC標(biāo)記和在3，末端具有淬滅TAMRA。49表5.用于Q-RT-PCR實(shí)驗(yàn)的引物和TaqMan探針<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>實(shí)施例3卡尼福拉咖啡編碼羥基肉桂酰-輔酶A莽草酸酯/奎尼酸酯羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(CcHCT)的cDNA克隆的分離和表征為了找到編碼咖啡HCT的cDNA，以煙草HCT蛋白質(zhì)序列(登錄號(hào)CAD47830(SEQIDNO:20);Hoffmann等人，2003)作為查詢序列，使用tblastn算法對(duì)5組"單基因，，進(jìn)行BLAST查詢。獲得的最佳匹配序列為單基因#123197(e值=e-150)，盡管也發(fā)現(xiàn)第二個(gè)咖啡單基因(#125212)與煙草HCT序列高度相關(guān)(e值-e-108)。單基因#123197和#125212的在計(jì)算機(jī)上的DNA和蛋白質(zhì)序列比對(duì)表明盡管它們可能相關(guān)，但是這兩個(gè)單基因序列編碼不同的咖啡基因。代表單基因#123197(pcccwc22wl4m23)(SEQIDNO:18)的5'末端的cDNA并且因此編碼與煙草HCT相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)中最長(zhǎng)的咖啡cDNA被分離和測(cè)序。pcccwc22wl4m23(SEQIDNO:18)的插入序列長(zhǎng)度為1465bp，并編碼389個(gè)氨基酸的部分ORF序列。因?yàn)槿L(zhǎng)煙草蛋白質(zhì)是435個(gè)氨基酸長(zhǎng)，假設(shè)該咖啡HCTcDNA缺少大約150個(gè)堿基對(duì)(即全長(zhǎng)咖啡HCTcDNA預(yù)期編碼另外約46個(gè)氨基酸)?；谟蓀cccwc22wl4m23(SEQIDNO:18)編碼的咖啡HCT序列的重要部分，設(shè)計(jì)在已確立的5，RACEPCR技術(shù)中使用的特異性引物從而分離相應(yīng)基因序列的5，端。使用上述實(shí)施例2的第二種方法從紅色發(fā)育期的卡尼福拉咖啡(BP409)顆粒的RNA得到的cDNA，并且在第一輪PCR中使用基因特異性引物22wl4m23-GSPl(SEQIDNO:44)和在第二輪PCR中使用22wl4m23-GSP2(SEQIDNO:45)，該實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生約300堿基對(duì)的PCR片段(在瓊脂糖凝膠中估計(jì)長(zhǎng)度)，其可以用基因特異性引物22wl4m23-GSP2(SEQIDNO:45)直接測(cè)序。獲得的序列(Racel—CcHCT)(SEQIDNO:17)長(zhǎng)度為209bp，并且與cDNA克隆pcccwc22wl4m23(SEQIDNO:18)的5'末端重疊(圖2a:重疊序列為60bp)。該新分離的咖啡5，末端HCT序列(Racelj:cHCT)(SEQIDNO:17)和cDNApcccwc22wl4m23(SEQIDNO:18)中接近全長(zhǎng)的編碼序列，允許設(shè)計(jì)兩個(gè)新的引物(HCT-FullUpl(SEQIDNO:50)和CcHCT-Rl(SEQIDNO:51)，表3和4)，從而使用通過(guò)方法1從黃色發(fā)育期的卡尼福拉咖啡(BP-409)顆粒的RNA得到的cDNA來(lái)特異性擴(kuò)增咖啡HCT的完全ORF序列。該P(yáng)CR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生包含在質(zhì)粒pMLl中的cDNA序列CcHCT(SEQIDNO:l)(圖2b)。pMLl插入序列(SEQIDNO:l)的序列分析表明該cDNA長(zhǎng)度為1388bp，其完全ORF長(zhǎng)1305bp，編碼預(yù)期分子量為48.06kDa的長(zhǎng)434個(gè)氨基酸的多肽(SEQIDNO:9)。IDNO:9)與煙草HCT蛋白質(zhì)序列和擬南芥中的相關(guān)序列(登錄號(hào)分別為CAD47830(SEQIDNO:20)和NP—199704(SEQIDNO:21)，見圖4)之間的比對(duì)驗(yàn)證了用BLAST對(duì)該咖啡序列的最初注解，即pMLl(SEQIDNO:l)的ORF編碼咖啡HCT蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)水平，咖啡序列(SEQIDNO:9)分別與煙草和擬南芥序列具有86.9%和78.3%的同源性(圖4)。在核酸水平，咖啡序列的完全ORF分別與煙草和擬南芥完全ORF序列具有78.5%和70%的同源性。蛋白質(zhì)序列比對(duì)也顯示pMLl的咖啡HCT序列具有兩段保守序列，HXXXD(SEQIDNO:25)和DFGWG(SEQIDNO:26)，其被鑒定為植物蛋白質(zhì)的酰基轉(zhuǎn)移酶類的關(guān)鍵區(qū)域。實(shí)施例4編碼羥基肉桂酰-輔酶A莽草酸酯/奎尼酸酯羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(CaHCT)的阿拉比卡咖啡cDNA克隆的分離和表征用Crouzillat等人，(1996)的方法從溫室中收獲的阿拉比卡咖啡T2308的新鮮葉中提取總基因組DNA。根據(jù)制造商建議的方法使用通用基因組步移試劑盒(BD生物科學(xué))進(jìn)行引物輔助步移。此處使用的4個(gè)基因組步移(GenomeWalker)文庫(kù)是之前從阿拉比卡咖啡T2308基因組DNA構(gòu)建的，將其用Dral、EcoRV、Pvul、Stul消化，然后平末端連接到通用基因組步移試劑盒的基因組步移接頭上?；蚪MDNA的消化和基因組步移接頭連接反應(yīng)的進(jìn)行與制造商的說(shuō)明書一致。隨后將4個(gè)文庫(kù)用作使用HCT-GSP基因特異性引物的PCR反應(yīng)的模板(表6)。PCR反應(yīng)混合物終體積為50fil，包含10nl基因組步移文庫(kù)模板(1/100稀釋)、5jUlOxPCR緩沖液(LA緩沖液11加]\^++)、200jiM各dNTP、400nM各引物(AP1和HCT畫GSPl)和0.5U的TakaraLATaqDNA聚合酶(康柏生物科學(xué))。第一輪PCR使用如下條件95。C變性2分鐘以后，首先95。C20秒、72。C退火和延伸3分鐘，進(jìn)行7個(gè)循環(huán)。再在95。C25秒、67。C退火/延伸3分鐘，進(jìn)行31個(gè)循環(huán)。附加的最終延伸步驟在67。C進(jìn)行7分鐘。第二輪PCR反應(yīng)的體系與上述第一輪中描述的一樣，除了DNA底物為第一輪擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物1/50稀釋后的1jd。PCR循環(huán)條件為首先95°C25秒、72。C退火和延伸3分鐘，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)。再在95°C25秒、67°C退火/延伸3分鐘，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。附加的最終延伸步驟在67°C進(jìn)行7分鐘。得到的PCR片段用瓊脂糖凝膠電泳分離。來(lái)自StuI文庫(kù)的一個(gè)PCR產(chǎn)物命名為GW1—CaHCT，其顯示唯一條帶，隨后使用用于測(cè)序的TOPOTA克隆試劑盒(英杰公司)將其克隆到pCR4-TOPO中，然后在分離的陽(yáng)性菌落中進(jìn)行PCR。用T7和T3引物對(duì)具有預(yù)期長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。獲得的序列(GWl-CaHCT)(SEQIDNO:19)長(zhǎng)度為685bp,與pcccwc22wl4m23(SEQIDNO:18)序列重疊超過(guò)117bp(圖3A、3B)。注意該基因組序列可能編碼約430bp的CaHCT基因5，非編碼區(qū)，并且因此編碼至少部分的該基因啟動(dòng)子。表6.用于基因組步移實(shí)驗(yàn)的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>使用相同的特異性引物組和用于分離卡尼福拉咖啡HCT(CcHCT)的完全ORF的PCR條件來(lái)分離編碼阿拉比卡咖啡HCT的完全ORF的cDNA(詳見實(shí)施例2和表3和4)。使用方法1從黃色期的阿拉比卡咖啡(T2308)顆粒的RNA獲得cDNA，并克隆到質(zhì)粒pML5中(圖3b)。pML5插入序列(SEQIDNO:2)的序列分析表明該cDNA長(zhǎng)度為1388bp，具有1305bp的完全ORF，其編碼預(yù)期分子量為48.186kDa的434個(gè)氨基酸的多肽(SEQIDNO:10)。用ClustaFW將pMLl(CcHCT)(SEQIDNO:l)和pML5(CaHCT)(SEQIDNO^)的插入序列進(jìn)行最優(yōu)比對(duì)，結(jié)果顯示兩序列在DNA水平上具有98.9%的同一性，兩序列之間觀察到有14個(gè)單核苷酸差異。這些在ORF的DNA序列中的差異會(huì)翻譯成5個(gè)改變的氨基酸序列(圖4)。值得注意的是在這些基因的5'和3，UTR序列中預(yù)期有更顯著的序列改變，其中大部分是來(lái)自pMLl和pML5缺失的。如圖4所示，所有4個(gè)HCT序列在高度保守的HXXXD(SEQIDNO:25)盒中都具有相同的序列(HHAAD)(SEQIDNO:85)。這進(jìn)一步支持了pMLl和pML5編碼咖啡HCT蛋白質(zhì)的論點(diǎn)。實(shí)施例5編碼羥基肉桂酰-輔酶A查尼酸酯幾基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(CcHOT)的卡尼?！┝⒖Х萩DNA克隆的分離和表征以最近公開的煙草HQT蛋白質(zhì)序列(NtHQT，登錄號(hào)CAE46932;Niggeweg等人，2004)和番茄HQT蛋白質(zhì)序列(LeHQT，登錄號(hào)CAE46933,Niggeweg等人，2004》作為查詢序列，使用tblastn算法對(duì)5組"單基因，，進(jìn)行查詢。以煙草NtHQT作為查詢序列，獲得的兩個(gè)最匹配序列為單基因#125212(e值=e-119)和單基因#123197(e值=e-100)。以番茄LeHQT作為查詢序列，獲得的兩個(gè)最匹配序列為單基因#125212(e值=e-127)和單基因#123197(e值=e-103)。通過(guò)BLAST查詢得到的單基因#125212與NtHQT和LeHQT蛋白質(zhì)序列具有很高的e值，強(qiáng)烈表明該計(jì)算機(jī)上得到的單基因序列可能編碼HQT蛋白質(zhì)。單基因#125212(pcccwc30wl3p12)(SEQIDNO:28)的最長(zhǎng)EST之一被從果皮文庫(kù)中分離和完全測(cè)序。序列分析顯示該cDNA編碼長(zhǎng)度為1056bp的插入序列，其含有編碼292個(gè)氨基酸的部分ORF序列。用Megalign軟件(LaserGene軟件包，DNASTAR)將由pcccwc30wl3p12(SEQIDNO:28)編碼的多肽序列與煙草和番茄HQT蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)。這些手動(dòng)優(yōu)化的比對(duì)證實(shí)pcccwc30wl3p12(SEQIDNO:28)的部分ORF可能編碼HQT蛋白質(zhì)。這些比對(duì)也表明該cDNA克隆不包含完全的ORF。將由pcccwc30wl3p12(SEQIDNO:28)編碼的多肽序列與單基因123197(pcccwc22wl4m23)(SEQIDNO:18)的最長(zhǎng)cDNA編碼的多肽序列進(jìn)行比對(duì)。該蛋白質(zhì)比對(duì)顯示這兩個(gè)序列有顯著差異(用ClustalW方法得到氨基酸水平上約61.3%的同一性)，并且因此這些序列代表不同的基因。番茄和煙草HQT蛋白質(zhì)序列與pcccs30wl3p12(SEQIDNO:28)序列的部分ORF之間的比對(duì)顯示該咖啡HQT序列N-末端缺少約"O-l50個(gè)氨基酸。然而，基于pcccs30wl3p12(SEQIDNO:28)編碼的咖啡HQT序列的主要部分，可以設(shè)計(jì)用于已建立的5，RACEPCR技術(shù)的特異性引物，來(lái)分離咖啡HQT編碼序列缺失的5，端序列。使用通過(guò)方法1從卡尼福拉咖啡(BP40"果皮中分離的RNA(所有發(fā)育階段混合)制備的cDNA，并且使用上述實(shí)施例2中的引物和PCR條件，獲得長(zhǎng)度約為750bp的唯一片段，并且用擴(kuò)增該片段的特異性引物22ml2-GSP2(SEQIDNO:43)直接測(cè)序。獲得的序列(RACE3_CcHQT)(SEQIDNO:27)長(zhǎng)639bp，與pcccs30wl3p12(SEQIDNO:28)的5，端序列重疊62bp(圖5a)。該新分離的卡尼福拉咖啡5'末端HQT序歹寸(RACE3—CcHQT)(SEQIDNO:27)和cDNApcccwc30wl3m12(SEQIDNO:28)的編碼序列，允許設(shè)計(jì)兩個(gè)新的引物，從而使用從少綠色期的卡尼福拉咖啡(BP-409)果皮的RNA得到的cDNA來(lái)特異性擴(kuò)增咖啡HCT的CcHQT的完全ORF序列。(表3和4)。將獲得的cDNA克隆到pML2質(zhì)粒中(圖5A和5B)。pML2插入序列(SEQIDNO:3)的序列分析表明該cDNA長(zhǎng)度為1534bp，且其完全ORF長(zhǎng)1293bp，編碼預(yù)期分子量為47.72kDa的長(zhǎng)430氨基酸的多肽(SEQIDNO:ll)。完全CcHQTORF序列(SEQIDNO:3)與先前表征的煙草和番茄HQT序列和甘薯中的高度相關(guān)序列IbHCBT(登錄號(hào)為BAA87043(SEQIDNO:22))之間的比對(duì)驗(yàn)證了最初用BLAST分析對(duì)該咖啡序列的注解，即pML2(SEQIDNO:3)的ORF編碼咖啡HQT蛋白質(zhì)(SEQIDNO:ll)(圖4)。在蛋白質(zhì)水平，咖啡HQT蛋白質(zhì)序列分別與煙草、番茄和甘薯序列具有75.8%、75.1%和78.1%的同源性。在核酸水平，咖啡HQTORF序列分別與煙草、番茄和甘薯ORF序列具有72.1。/。、70.1%和71.1%的同一性。圖4的比對(duì)也顯示pML2的咖啡HQT序列(SEQIDNO:ll)具有兩段保守序列，HXXXD(SEQIDNO:25)和DFGWG(SEQIDNO:26)，其被鑒定為植物蛋白質(zhì)的?；D(zhuǎn)移酶類的關(guān)鍵區(qū)域(Yang等人1997,St-Pierre等人2000，Hoffmann等人2003)。如圖4所示，在高度保守的HXXXD(SEQIDNO:25)盒中，所有5個(gè)HQT序列具有幾乎相同的序列(HT/NLSD)，進(jìn)一步支持pML2編碼咖啡HQT蛋白質(zhì)的論點(diǎn)。實(shí)施例6編碼羥基肉桂酰-輔酶A奎尼酸酯羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(CaHOT)的阿拉比卡咖啡cDNA克隆的分離和表征用分離卡尼福拉咖啡HQT完全ORF所用的同樣特異性引物組和PCR條件來(lái)分離編碼阿拉比卡咖啡HQT的完全ORF的cDNA(見實(shí)施例2和表3和4)。從阿拉比卡咖啡(T2308)花中分離的RNA通過(guò)方法1制備所用的cDNA，并將擴(kuò)增的特異性CaHQT片段亞克隆產(chǎn)生pML3質(zhì)粒(圖6)。pML3插入序列的序列分析揭示該cDNA長(zhǎng)為1533bp，其可能的完全ORF長(zhǎng)1293bp，在其ORF序列中的814-816位點(diǎn)(在蛋白質(zhì)中的272位點(diǎn))被單個(gè)終止密碼子中斷。推測(cè)該突變是在用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增的過(guò)程中的單堿基對(duì)突變①AA到IAA)所導(dǎo)致的。為了確定終止密碼子由Taq產(chǎn)生，而不是基因組編碼的終止密碼子，使用方法l從阿拉比卡咖啡T2308根中分離的RNA來(lái)制備cDNA。然后使用該cDNA用PCR擴(kuò)增終止密碼子的區(qū)域。在終體積50nl體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述體系如下5plcDNA;10xPCR緩沖液(LA緩沖液II加Mg++)、500nM的引物HQT-FullLupl(5，CTGGAGGAAAGCAGAGAAGCAT3)(SEQIDNO:86)和HQT-FullLow2(SEQIDNO:52)(表3A)、200jiM各dNTP、0.5UTakaraLATaqDNA聚合酶(康柏生物科學(xué))。PCR反應(yīng)條件如下94°C2分鐘；然后在1分鐘、56°C1分鐘和72。C延伸2分鐘，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。附加進(jìn)行72匸7分鐘的最終延伸步驟。隨后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色來(lái)分析PCR產(chǎn)物。該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)生約1600bp長(zhǎng)的唯一片段。然后用HQT-FullLow2引物(SEQIDNO:52)(表4)對(duì)該唯一片段(R-CaHQT)直接測(cè)序。獲得的626bp的序列與pML3(CaHQT)序列(SEQIDNO:4)完全重疊。該新的cDNA56片段的序列編碼含有突變位點(diǎn)的區(qū)域(在626bp的重疊區(qū)域具有98.9%的同源性)，而且在突變位點(diǎn)，其具有g(shù)AA(預(yù)期的氨基酸Q)而不是在pML3中發(fā)現(xiàn)的TAA(終止子)?？寺〉腃cHQT(SEQIDNO:3)和CaHQT(SEQIDNO:4)cDNA序列的比對(duì)顯示15個(gè)單個(gè)核苷酸差異。多肽序列CcHQT(SEQIDNO:ll)和CaHQT(SEQIDNO:12)的最優(yōu)比對(duì)顯示7個(gè)氨基酸差異(圖4)。實(shí)施例7編碼(對(duì))-香豆酰3，羥化酶CcC3H的卡尼福拉咖啡cDNA克隆的分離和表征為了找到編碼(對(duì))-香豆酰莽草酸酯3，羥化酶(C3H)的咖啡cDNA，使用兩個(gè)編碼生物化學(xué)上有C3H活性特征的蛋白質(zhì)序列，羅勒(Odw"fi6w,7Zc"附)(對(duì))-香豆酰莽草酸酯3，羥化酶異構(gòu)體2(Gang等人，2002;登錄號(hào)AAL99201)和擬南芥細(xì)胞色素P450CYP98A3(Schoch等人，2001;登錄號(hào)022203)，用tblastn算法查詢5組"單基因"。該查詢揭示一個(gè)與羅勒和擬南芥C3H蛋白質(zhì)序列呈現(xiàn)高水平同源性的單基因(#124852)。可能編碼該蛋白質(zhì)完全ORF的代表單基因#124852(pcccl20d10(SEQIDNO:5))5，端的cDNA隨后4皮分離和測(cè)序。確定pcccl20d10(SEQIDNO:5)插入序列長(zhǎng)度為1728bp,編碼1527bp的ORF。推論出含508個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:13)，并且其預(yù)測(cè)分子量為57.9kDa。將pcccl20d10(SEQIDNO:5)的蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:13)與來(lái)自羅勒、擬南芥同源C3H蛋白質(zhì)序列以及來(lái)自番茄(丄.esc"/ew似附)的直向同源序列進(jìn)行比對(duì)(圖7)。該比對(duì)證明pcccl20d10(SEQIDNO:5)所編碼的蛋白質(zhì)(SEQIDNO:13)分別與這些蛋白質(zhì)序列具有75.1%、73.9%和82.9%的同源性。因此可以得出pcccl20d10(SEQIDNO:5)編碼卡尼福拉咖啡(對(duì))-香豆酰莽草酸酯3，羥化酶(CcC3H)全長(zhǎng)cDNA的結(jié)論。編碼pcccl20d10(SEQIDNO:5)中包含的ORF序列的DNA序列與編碼羅勒C3H和擬南芥細(xì)胞色素P450CYP98A3的ORF序列的DNA序列DNA序列與羅勒C3H和擬南芥P450CYP98A3DNA序列具有69.4%和69.2%的同一性。實(shí)施例8三個(gè)編碼CCoAOMT的卡尼福拉咖啡cDNA克隆的分離和表征為了找到編碼CCoAOMT的咖啡cDNA，使用兩個(gè)編碼有CCoAOMT活性特征的蛋白質(zhì)序列，煙草CCoAOMT(登錄號(hào)AAC49913(SEQIDNO:38)Martz等人，1998)和紫花苜蓿(苜蓿)CCoAOMT(登錄號(hào)AAC28973(SEQIDNO:37)，F(xiàn)errer等人，2005)，用tblastn算法查詢5組"單基因"。該分析揭示三個(gè)單基因與煙草CCoAOMT蛋白質(zhì)序列呈現(xiàn)高水平同源性，#119965(e值-e-125)、#122801(e值^e-63)和#119560(e值=e-56)。這些單基因也顯示與紫花苜蓿蛋白質(zhì)序列相對(duì)高的同源性，即#119965(e值-e-127)、#122801(e值-e-64)和弁119560(e值-e-59)。隨后從葉文庫(kù)中分離了可能編碼該蛋白質(zhì)完全ORF的代表該單基因#119965(pcccll5a11(SEQIDNO:6))的5，端的最長(zhǎng)cDNA之一，并進(jìn)行完全測(cè)序。確定pcccll5a11(SEQIDNO:6)的插入序列長(zhǎng)度為1144bp,并且編碼744bp的ORF。推論的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:14)長(zhǎng)度為247個(gè)氨基酸，并且其預(yù)測(cè)分子量為27.97kDa。圖12顯示pcccll5a11(SEQIDNO:6)的蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:14)與來(lái)自煙草和紫花苜蓿的CCoAOMT蛋白質(zhì)序列的最優(yōu)比對(duì)，顯示pcccll5a11蛋白質(zhì)分別與這些蛋白質(zhì)序列具有85.1%和86.3%的同源性。該比對(duì)也證明CcCCoAOMTl蛋白質(zhì)(SEQIDNO:14)包含F(xiàn)errer等人2005所確定的所有氨基酸殘基。Ferrer組通過(guò)x-射線衍射晶體分析法確定了苜蓿咖啡酰輔酶A3-氧位-曱基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)a)在輔酶A識(shí)別中相互作用，b)涉及底物識(shí)別，和c)涉及二價(jià)金屬離子和輔助因子結(jié)合。因此，該比對(duì)的數(shù)據(jù)支持pcccll5a11(SEQIDNO:6)編碼卡尼福拉咖啡咖啡酰輔酶A-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶(CcCCoAOMTl)(SEQIDNO:14)的全長(zhǎng)cDNA這一論點(diǎn)。值得注意的是公開數(shù)據(jù)庫(kù)包含來(lái)自卡尼福拉咖啡的部分cDNA(登錄號(hào)AF534905，編碼108個(gè)氨基酸的ORF)。當(dāng)與CcCCoAOMTl(SEQIDNO:14)比對(duì)時(shí)，該數(shù)據(jù)庫(kù)序列的合適區(qū)域在DNA水平顯示97.5%的同一性，表明部分卡尼福拉咖啡cDNA(登錄號(hào)AF534卯5)可能與CcCCoAOMTl中的完全cDNA是等位基因，因此為具有相同基因的兩個(gè)不同的卡尼福拉咖啡等位基因。從30周顆粒文庫(kù)中(開花以后30周)分離可能編碼CcCCoAOMT類蛋白質(zhì)的代表單基因#122801(cccs30w29k18)5'端的最長(zhǎng)cDNA，并進(jìn)行完全測(cè)序。確定pcccs30w29kl8(SEQIDNO:34)的插入序列長(zhǎng)度為722bp，并且編碼長(zhǎng)576bp的部分ORF。確定推論的部分蛋白質(zhì)序列編碼191個(gè)氨基酸。將pcccs30w29k18(SEQIDNO:34)編碼的部分多肽序列與來(lái)自煙草和紫花苜蓿的CCoAOMT蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)。該比對(duì)顯示pcccs30w29k18(SEQIDNO:34)的插入ORF序列與這些植物CCoAOMT蛋白質(zhì)序列都具有56.2%的同一性，證明該蛋白質(zhì)可能是CCoAOMT類蛋白質(zhì)。該比對(duì)也表明該cDNA克隆不包含完全ORF。基于pcccs30w29k18(SEQIDNO:34)編碼的序列設(shè)計(jì)特異性引物，從而用已建立的5，RACEPCR技術(shù)分離相應(yīng)基因序列的5，端。使用上述實(shí)施例2和表2中的RACEPCR條件，用基因特異性引物122801-GSP1(SEQIDNO:46)(第一輪RACEPCR)和122801-GSP2(SEQIDNO:47)(第二輪RACEPCR)，和從黃色發(fā)育期的卡尼福拉咖啡BP409顆粒分離的RNA通過(guò)方法1制備的cDNA，產(chǎn)生長(zhǎng)218堿基對(duì)的PCR片段，根據(jù)前述方法將其克隆到pCR4-TOPO中并測(cè)序。獲得的序列(Race1—CcCCoAOMT-Ll在pNT13(SEQIDNO:33))與cDNA克隆pcccs30w29k18(SEQIDNO:34)的5，端重疊(圖9A:61bp的重疊序列)。該新分離的咖啡5，端CcCCoAOMT-類序歹U(Racel—CcCCoAOMT-Ll(SEQIDNO:33))，和在cDNApcccs30w29k18(SEQIDNO:34)中的部分編碼序列，允許設(shè)計(jì)兩個(gè)新的引物(CO^03/:r-丄7畫FuUiip(SEQIDNO:54)和CO^OMr-ZJ畫FullLow(SEQIDNO:55)，表3和4)，從而使用從阿拉比卡咖啡(T2308)顆粒(黃色發(fā)育期)分離的RNA制備的cDNA來(lái)特異性擴(kuò)增咖啡CaCCoAOMT-Ll(SEQIDNO:15)的完全ORF序歹寸(表4)。在終體積50jil體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，體系如下5filcDNA、5Hl的10xPCR緩沖液(克隆的Pfu反應(yīng)緩沖液)、400nM兩種特異性引物、200fiM各dNTP、和1.25UPfuTruboDNA聚合酶(斯徹特基因公司)。PCR循環(huán)條件如下94匸變性2分鐘；然后在94°C1分鐘、退火溫度55。C1分鐘和72C延伸2分鐘，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。附加72'C7分鐘的最終延伸步驟。將該P(yáng)CR產(chǎn)生的cDNA片段直接克隆到pENTR/D-TOPO載體中，形成pNT8質(zhì)粒(圖9B)。pNT8插入序列(SEQIDNO:7)的序列分析表明該cDNA長(zhǎng)為717bp(包括在克隆中使用的CACC序列)。質(zhì)粒pNt8的完全ORF長(zhǎng)6卯bp，編碼具有預(yù)期分子量為25.71kDa的長(zhǎng)229個(gè)氨基酸的多肽(SEQIDNO:15)。圖11中呈現(xiàn)的比對(duì)證實(shí)了CaCCoAOMT-Ll(pNT8)的ORF不是CcCCoAOMT-l的等位基因，而明顯是不同的基因產(chǎn)物。有效地，CaCCoAOMT-Ll蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:15)是由pNT8(SEQIDNO:7)(與CcCCoAOMT-l同一性為54.6%)中包含的ORF所編碼。另外，該蛋白質(zhì)與所表征的MsCCoAOMT、NtCCoAOMT和VvCCoAOMT蛋白質(zhì)(基因庫(kù)登錄號(hào)分別為AAC28973(SEQIDNO:37)、AAC49913(SEQIDNO:38)和CAA90969(SEQIDNO:39)，見圖12)只有54.2%、57.8%和57.4%的同一性。如圖12所示，在苜蓿CCoAOMT的晶體結(jié)構(gòu)中描述的5個(gè)特征性位點(diǎn)在咖啡蛋白質(zhì)序列CCoAOMT-Ll中是不同的。已經(jīng)確定12個(gè)保守氨基酸中的2個(gè)涉及輔助因子的結(jié)合(Ferrer等人，2005):即MsCCoAOMT中的谷氨酸67和脯氨酸139在CaCCoAOMT-Ll(SEQIDNO:15)中分別被丙氨酸和谷氨酸殘基所取代，并且6個(gè)殘基中的3個(gè)涉及底物識(shí)別(Ferrer等人，2005):即在CaCCoAOMT-Ll(SEQIDNO:15)蛋白質(zhì)中精氨酸206、酪氨酸208和酪氨酸212分別被丙氨酸、谷氨酸和甘氨酸殘基所取代。隨后從46周顆粒文庫(kù)中(開花以后46周)分離了可能編碼該蛋白質(zhì)的部分ORF的、并且代表單基因#119560(cccs"wS0m2A的5，端的最長(zhǎng)序。序列分析顯示該cDNA(SEQIDNO:36)編碼長(zhǎng)度為934bp的插入序列。使用CLUSTALW將該插入序列的DNA序列與已表征的NtCCoAOMT和MsCCoAOMT(基因庫(kù)登錄號(hào)分別為AAC49913(SEQIDNO:38)和AAC28973(SEQIDNO:37))蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，表明該cDNA可能包含內(nèi)含子。使用CLUSTALW程序?qū)⑦M(jìn)行最優(yōu)比對(duì)，與pcccs46w30m24的插入序列相比，其他已表征的植物cDNA序列的ORFDNA序列中有一個(gè)72bp的插入序列。另外，cccs46w30m24插入序列的ORF編碼截短的蛋白質(zhì)序列，由于其在pcccs46w30m24預(yù)期的內(nèi)含子序列中有一個(gè)終止密碼子，因此其在C-末端比NtCCoAOMT和MsCCoAOMT短92個(gè)氨基酸?；趐cccs46w30m24cDNA序列(SEQIDNO:36)包含內(nèi)含子，經(jīng)電腦模擬產(chǎn)生加工的序列。在426-497bp進(jìn)行拼接加工，該位置代表假定的內(nèi)含子。獲得的拼接的862bp序列(pcccs46w30m24序列減去假定內(nèi)含子)的序列分析顯示該cDNA包含702bp的ORF,編碼233個(gè)氨基酸的部分蛋白質(zhì)。隨后將該假定的多肽序列與先前部分中所述的NtCCoAOMT和MsCCoAOMT蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)(圖12)，揭示了pcccs46w30m24的部分ORF與這些CCoAOMT序列各具有48.9%的同一性。與該部分ORF相關(guān)的蛋白質(zhì)稱為CcCCoAOMT-L2(SEQIDNO:16)。然而，由于pcccs46w30m24(SEQIDNO:36)編碼預(yù)期咖啡CCoAOMT-LIKE序列的主要部分，因此可以設(shè)計(jì)特異性引物來(lái)分離該基因缺失的5，端編碼序列。使用從阿拉比卡咖啡(T-2308)顆粒黃色期分離的RNA通過(guò)方法1制備的cDNA、引物119560-GSP1(SEQIDNO:48)(第一輪RACEPCR)和119560-GSP2(SEQIDNO:49)(第二輪RACEPCR)、和在實(shí)施例2和表2中所述的PCR條件，可以獲得唯一片段。將該片段直接克隆到pCR4-TOPO載體中產(chǎn)生pNT14,并用T3通用引物測(cè)序。獲得的插入序列(Race1—CflCG^OMT-丄2(SEQIDNO:35))長(zhǎng)度為預(yù)期的349bp，與pcccs46w30m24(SEQIDNO:36)的5'端序列重疊(圖10A，重疊序61列長(zhǎng)224bp)。該新分離的阿拉比卡咖啡5，端a》/40Afr-lME序列(Racel—OiCa^OAfr-丄2)(SEQIDNO:35)，和在cDNApcccs46w30m24(SEQIDNO:36)中的編碼序列，允許設(shè)計(jì)2個(gè)新的引物CC"OiWT-丄2-FullUp(SEQIDNO:58)和CC"OMn2-FullLow(SEQIDNO:59)(表3和4),從而能夠特異性擴(kuò)增CCoAOMT-L2(SEQIDNO:8)的完全ORF序列。通過(guò)方法1從卡尼福拉咖啡(BP-409)顆粒黃色發(fā)育期分離的RNA制備該實(shí)驗(yàn)中使用的擴(kuò)增CCoAOMT-L2的完全ORF的cDNA(使用同樣的cDNA用來(lái)產(chǎn)生HCT的全長(zhǎng)cDNA，見表4)。如實(shí)施例2中所述，用TakaraLATaqDNA聚合酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(PCR反應(yīng)在終體積50jil體系中進(jìn)行，體系如下5filcDNA(表4)、5jil10xPCR緩沖液(LAPCRII加Mg2+)、800nM各特異性引物、200jiM各dNTP、和0.5U的TakaraLATaqDNA聚合酶(康柏生物科學(xué))。PCR循環(huán)條件與實(shí)施例2中所述相同。該實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生單個(gè)主要PCR產(chǎn)物，按前述將其直接克隆到pCR4-TOPO載體中獲得質(zhì)粒pNT4(DNA序列見圖10B)。pNT4(SEQIDNO:8)編碼長(zhǎng)717bp的完全ORF，其編碼預(yù)期分子量為26.30kDa的長(zhǎng)238個(gè)氨基酸的多肽(SEQIDNO:16)。咖啡CCoAOMT-L2序列的完全ORF與先前表征的紫花苜蓿、煙草和葡萄CCoAOMT序列(如上所述)之間的比對(duì)證實(shí)了最初的用BLAST將pcccs46w30m24(SEQIDNO:36)部分咖啡序列注解為咖啡CCoAOMT-LIKE蛋白質(zhì)(圖12)。在蛋白質(zhì)水平，咖啡CcCCoAOMT-L2(pNT4)ORF序列與MsCCoAOMT蛋白質(zhì)序列有46.6%同一性、與NtCCoAOMT-l蛋白質(zhì)序列有47%同一性和與VvCCoAOMT蛋白質(zhì)序列有47.8%同一性。在圖11中展示的咖啡CcCoAOMT-L2序列(SEQIDNO:16)與上述咖啡CaCCoAOMT-Ll蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:15)和CcCCoAOMT-l(SEQIDNO:14)的比對(duì)清楚地顯示這三個(gè)蛋白質(zhì)序列代表不同的高度相關(guān)的蛋白質(zhì)組。用所有這三個(gè)蛋白質(zhì)(即咖啡CCoAOMT(SEQIDNO:14)和兩個(gè)CCoAOMT-LIKE蛋白質(zhì)(SEQIDNO:15和16))與圖12中已表征的CCoAOMT蛋白質(zhì)進(jìn)行二次比對(duì)，清楚地說(shuō)明咖啡CcCCoAOMT-L2蛋白質(zhì)(SEQIDNO:16)的序列與已表征的植物CCoAOMT蛋白質(zhì)之間比其與CaCCoAOMT-Ll蛋白質(zhì)(SEQIDNO:15)之間具有更遠(yuǎn)的相關(guān)性。另夕卜，值得注意的還有在圖12中，CcCCoAOMT-L2蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:16)在底物識(shí)別相關(guān)的區(qū)域中有幾個(gè)氨基酸改變(紫花苜蓿登錄號(hào)AAC28973(SEQIDNO:37)，F(xiàn)errer等人，2005)。實(shí)施例9CcCCoAOMTl的過(guò)表達(dá)和表征Gateaway技術(shù)(英杰公司)由兩個(gè)載體組成pENTR/D-TOPO和表達(dá)載體pDEST17，用于過(guò)量產(chǎn)生CcCCoAOMTl蛋白質(zhì)(SEQIDNO:14)。該策略包括將CcCCoAOMTl(SEQIDNO:6)的ORF按譯碼框轉(zhuǎn)移到第一個(gè)載體(pENTR/D-TOPO)中去，并帶有His標(biāo)簽序列。為此設(shè)計(jì)兩個(gè)特異性引物。第一個(gè)引物(CO^OiW77-Fullup(SEQIDNO:54)表3)包括該ORF的前幾個(gè)密碼子(從起始密碼子ATG開始)的特異序列，ATG密碼子的5，端是直接克隆到pENTR/D-TOPO中所需的CACC接頭。笫二個(gè)引物(CO^0ikm-FullLow,(SEQIDNO:55)表3)包含該ORF的終止密碼子和在3，UTR的幾個(gè)堿基(14bp)。然后，用上述特異性引物和PfuTurboDNA聚合酶(斯徹特基因公司)進(jìn)4亍PCR反應(yīng)，其在產(chǎn)物的5'端不產(chǎn)生腺嘌呤，并允許CcCCoAOMTlPCR產(chǎn)物直接克隆到pENTR/D-TOPO中。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在終體積50^1體系中進(jìn)行，體系如下5jil的pcccll5all質(zhì)粒(l/50稀釋)、5nl10xPCR緩沖液(克隆的Pfu反應(yīng)緩沖液)、400nM的各特異性引物、200jiM各dNTP、和1.25U的PfuTruboDNA聚合酶(斯徹特基因公司)。PCR循環(huán)條件如下94。C變性2分鐘；然后在94°C1分鐘、退火溫度55。C1分鐘和72。C延伸2分鐘進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。附加72。C7分鐘的最終延伸步驟。該實(shí)驗(yàn)將CcCCoAOMTlORF插入到pENTR/D-TOPO載體中形成質(zhì)粒63pNT15。然后，根據(jù)制造商(英杰公司)建議的GATEWAY方法將pNT15與pDEST17(氨爺青霉素抗性)重組，產(chǎn)生pNT16，其中ORF與pDEST17的讀碼框一致。將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞ToplO(英杰公司)和具有氨芐青霉素抗性的克隆中。通過(guò)使用表3所述的特異性引物CO^OAf77-FullUp(SEQIDNO:54)和CC"OiWT2-FullLow(SEQIDNO:55)進(jìn)行PCR篩選，來(lái)鑒定含有CCoAOMTl插入序列的陽(yáng)性克隆。純化以后，根據(jù)供應(yīng)商(英杰公司)建議的方法將pNT16轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BI21AI(用于蛋白質(zhì)表達(dá))中。對(duì)于蛋白質(zhì)表達(dá)，將與pNT16預(yù)培養(yǎng)的B121AI細(xì)胞在37。C、5ml含100jig/ml氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜。200fil各培養(yǎng)液接種于兩個(gè)培養(yǎng)瓶中(50ml含100照/ml氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基)，使細(xì)胞生長(zhǎng)到OD6()。nm=0.6。隨后用0.2%的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)克隆的蛋白質(zhì)的表達(dá)，培養(yǎng)物在27。C再培養(yǎng)6小時(shí)。也進(jìn)行使用抑制劑(通過(guò)制備另一個(gè)對(duì)照培養(yǎng)物加0.1。/。葡萄糖產(chǎn)生)的陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。然后將細(xì)胞沉淀、收集并重懸于2ml裂解緩沖液(50mMpH7.8的磷酸鉀、400mMNaCl、100mMKC1、20mMp-巰基乙醇、10%甘油、0.5%TritonX100、10mM咪唑)中。通過(guò)3個(gè)循環(huán)的水凍/融解(-180。C/42。C)進(jìn)行裂解，并且隨后進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的水上超聲處理(處理1分鐘/冷卻1分鐘)，所用的插入探針的功率為最大值的40%(VibraCe1172412，BIOBLOCKScientific)。然后將裂解的細(xì)胞離心(10，000g，30分鐘)，上清與M-Nta小珠(Qiagen產(chǎn)品1004494)—起培育1小時(shí)，隨后將全部混合物轉(zhuǎn)移到層析柱(英杰公司#貨號(hào))中。然后將該柱用4ml洗涂緩沖液(50mMTrisHC1pH7.5、500mMNaCL、20mM咪唑、20mMp畫巰基乙醇、10%甘油、0.2mMMgCl2)洗兩次。用5級(jí)分的0.5ml洗脫緩沖液(50mMTrisHC1pH7.5、500mMNaCL、0.2mMMgCl2、20mMP-巰基乙醇、10%甘油、250mM咪唑)洗脫帶his標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。將包含蛋白質(zhì)的級(jí)分集中以后，將其以活性緩沖液(50mMTrisHC1pH7.5、500mMNaCL、0.2mMMgCl2、20mM卩-巰基乙醇、10%甘油)透析。通過(guò)在12%SDS-PAGE凝膠上分析來(lái)證實(shí)蛋白質(zhì)的純化(圖15)。重組細(xì)胞的誘導(dǎo)產(chǎn)生大量預(yù)期分子量為30kDa的重組蛋白質(zhì)的累積(圖15A)，其相應(yīng)于CcCCoAOMTlHis-標(biāo)簽蛋白質(zhì)的預(yù)期大小。His-標(biāo)簽重組蛋白質(zhì)主要存在于前3個(gè)洗脫級(jí)分，并且在這幾個(gè)洗脫級(jí)分中沒(méi)有任何其他顯著的條帶，這顯示幾乎沒(méi)有非特異性蛋白質(zhì)的污染，凝膠分析也證明沒(méi)有重組蛋白質(zhì)的降解(圖15B)。該實(shí)驗(yàn)顯示His標(biāo)簽層析可以分離大量的His-標(biāo)簽CcCCoAOMTl蛋白質(zhì)。用Bradford標(biāo)準(zhǔn)方法(Bradford希格瑪公司試劑盒^B6916)進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化。用Inoue等人1998所使用的相關(guān)方法來(lái)進(jìn)行CcCCoAOMTl的測(cè)定。該測(cè)定在終體積為200jil的含40jig蛋白質(zhì)、150pMSAM和200jiM咖啡酸的活性緩沖液(50mMTrisHC1pH7.5、500mMNaCL、0.2mMMgCl2、20mMp-巰基乙醇、10%甘油)中進(jìn)行。反應(yīng)在30'C進(jìn)行，在所示時(shí)間通過(guò)加入9體積的終止緩沖液(0.1%(v/v)甲酸、5%(v/v)乙腈，pH2.5)終止反應(yīng)。隨后將這些樣品用0.22pM濾器澄清，取20jiL注入HPLC。進(jìn)4亍HPLC分才斤如下柱(MacheryNagelNucleosil5C18，8pm，4x250mm);梯度洗脫，溶劑A(0.1%(v/v)甲酸)和溶劑B(5%(v/v)乙腈)0-15分鐘5o/。B-50。/。B、15-17分鐘50o/oB-70。/oB、17-23分鐘70%B、23-25分鐘70%B—100%B、25-30分鐘100%B、30-32分鐘100%B-5%B、32-40分鐘5%B、流速lmL/分鐘，并通過(guò)紫外分光光度計(jì)在324nm檢測(cè)(Waters2487)。CcCCoAOMTl酶測(cè)定并不是以該酶的優(yōu)選底物咖啡酰輔酶A進(jìn)行的，因?yàn)樵摰孜锊荒軓纳虡I(yè)上獲得。作為替代，使用咖啡酸作為底物，其為先前用于紫花苜蓿重組蛋白質(zhì)CCoAOMT的化合物?？Х人峋哂休^低的特異性。(Inoue等人1998;Parvathi等人2001)。在該測(cè)定中，反應(yīng)的預(yù)期產(chǎn)物是阿魏酸。對(duì)照和測(cè)試反應(yīng)的HPLC分析譜之間的比較在圖18A和B中顯示。獲得的結(jié)果證明在6小時(shí)后14.8分鐘出現(xiàn)一個(gè)新的峰，該峰在24小時(shí)更大。經(jīng)鑒定該保留時(shí)間為阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)。另外，當(dāng)樣品顯示阿魏酸峰時(shí)，新加入的阿魏酸與預(yù)期的阿魏酸峰共同洗脫(圖19)，證明了CcCCoAOMTl產(chǎn)生的峰是阿魏酸。在保留時(shí)間15.2分鐘鑒定出第二個(gè)峰，并且由于在對(duì)照樣品(無(wú)酶)中不存在該峰，其可能是另一種CcCCoAOMTl產(chǎn)生的任一的另一產(chǎn)物、或阿魏酸的降解產(chǎn)物?？傊?，圖18的數(shù)據(jù)證明由CcCCoAOMTl編碼的蛋白質(zhì)具有一種與CcCCoAOMT蛋白質(zhì)(如MsCCoAOMT)相關(guān)的預(yù)期酶活性，因此CcCCoAOMTl編碼咖啡的咖啡酰輔酶A氧位-曱基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)。實(shí)施例10CaCCoAOMT-Ll和CcCCoAOMT-L2蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)相應(yīng)于CaCCoAOMT-Ll蛋白質(zhì)(SEQIDNO:15)的ORF(SEQIDNO:7)在入門載體pENTR/D-TOPO(即pNT8)中已經(jīng)存在。為了過(guò)表達(dá)CaCCoAOMT-Ll蛋白質(zhì)(SEQIDNO:15),如上述CcCCoAOMTl(SEQIDNO:14)—樣，將該ORF轉(zhuǎn)移到pDEST17中，從而產(chǎn)生質(zhì)粒pNT12。隨后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21-AI細(xì)胞中，除了用阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)在20°C過(guò)夜進(jìn)行以外，蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)和純化和CcCCoAOMTl—樣。圖16顯示該過(guò)表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。A欄(圖16)證明對(duì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的誘導(dǎo)產(chǎn)生近似預(yù)期大小(約26kDa)的蛋白質(zhì)的良好誘導(dǎo)。純化結(jié)果顯示雖然CaCCoAOMT-Ll相對(duì)地過(guò)表達(dá)，但是在His標(biāo)簽柱上純化并不是4艮有效(圖16，B欄)。這是由于多數(shù)蛋白質(zhì)產(chǎn)物是不可溶的，這些蛋白質(zhì)在離心步驟丟失。為了過(guò)表達(dá)CcCCoAOMT-L2蛋白質(zhì)(SEQIDNO:16)，設(shè)計(jì)兩個(gè)引物C0^40Mr-Z^-FM"t/p(SEQIDNO:58)和CG^OA/T-iL2-Fw//Z^w(SEQIDNO:59)(表3)，從質(zhì)粒pNT4上擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于CcCCoAOMT-L2的ORF?？梢杂门c所述CcCCoAOMTl同樣的策略將這些引物產(chǎn)生的PCR片段克隆到pENTR/D-TOPO中。使用PfuTurboDNA聚合酶的PCR反應(yīng)條件也與CcCCoAOMTl的相同，并產(chǎn)生pNT10。為了過(guò)表達(dá)CcCCoAOMT-L2蛋白質(zhì)，如上述CcCCoAOMTl—樣，將pNT10所包含的ORF轉(zhuǎn)移到pDEST17中，產(chǎn)生質(zhì)粒pNT17。隨后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21-AI細(xì)胞中，除了用阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)在20。C過(guò)夜進(jìn)行以外，蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)和純化和CcCCoAOMTl—樣。圖17顯示該過(guò)表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。A欄(圖17)證明誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生近似預(yù)期大小(約28kDa)的蛋白質(zhì)。純化結(jié)果顯示雖然CcCCoAOMT-L2相對(duì)地過(guò)表達(dá)，但是在His標(biāo)簽柱上純化并不是很有效。這是由于多數(shù)產(chǎn)生的CcCCoAOMT-L2蛋白質(zhì)是不可溶的，因此這些蛋白質(zhì)在離心步驟丟失。實(shí)施例11HCT和HOT蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)和純化為了證明可以以重組形式產(chǎn)生由pMLl(CcHCT(SEQIDNO:l))和pML2(CcHQT(SEQIDNO:3))編碼的蛋白質(zhì)，將這些蛋白質(zhì)在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)。使用表7中記錄的引物通過(guò)PCR擴(kuò)增各ORF。5'端PCR引物在ATG起始密碼子之前有一個(gè)BamHI位點(diǎn)，3，端引物在終止密碼子之后有一個(gè)XbaI位點(diǎn)。用Phusion聚合酶(FinnZymes)在制造商說(shuō)明的條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)。由此產(chǎn)生的特異性PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上純化，然后用GeneCleanTurbo試劑盒(Q-biogene)根據(jù)制造商說(shuō)明書從凝膠分離。隨后用BamHI和Xbal限制性內(nèi)切酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)消化純化的片段。表達(dá)載體(質(zhì)粒pGTPcl03a)也在相同的條件下用BamHI和Xbal消化。將凝膠純化的片段定量并用T4DNA連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)與消化的pGTPcl03a載體連接，該步驟設(shè)計(jì)(通過(guò)所用的PCR引物)將載體編碼的GST標(biāo)簽與克隆的HCT/HQT蛋白質(zhì)序列置于同一讀碼框。然后根據(jù)制造商的方法用各連接混合物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞(英杰公司)。用與克隆該ORF所用引物相同的引物進(jìn)行PCR和使用酶消化來(lái)篩選具有適當(dāng)插入序列的菌落。然后將所選的質(zhì)粒純化，并對(duì)存在的HCT和HQT插入序列測(cè)序(從而確定在PCR步驟中沒(méi)有錯(cuò)誤)。含有CcHCT序列的pGTPcl03a質(zhì)粒命名為pGTPcl03a_HCT，含有CcHQT序列的pGTPcl03a質(zhì)粒命名為pGTPcl03a_HQT。最后，用pGTPcl03a_HCT或pGTPcl03a_HQT轉(zhuǎn)化表達(dá)的感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，從而過(guò)表達(dá)蛋白質(zhì)。為了過(guò)表達(dá)蛋白質(zhì)，含有CcHCT或CcHQT的各重組B121(DE3)細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)液在37。C、10ml含50jig/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜。然后將各預(yù)培養(yǎng)液接種到兩個(gè)較大培養(yǎng)瓶中(200ml含50照/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基)，生長(zhǎng)細(xì)胞直至OD600達(dá)到1。然后通過(guò)加入0.2mM的IPTG來(lái)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，隨后培養(yǎng)物在37'C再生長(zhǎng)3小時(shí)。在此誘導(dǎo)處理后，將細(xì)胞沉淀，然后重懸于25ml裂解緩沖液中(20mMNaP04pH7.3、150mMNaCI、1%TritonXIOO、2mMEDTA、0.1%卩-巰基乙醇、lx蛋白酶抑制劑混合物)。用超聲處理(Vibracel72.434)在冰上裂解10秒鐘3個(gè)循環(huán)。將裂解的細(xì)胞離心(10，000g，30分鐘)，上清作為GST-瓊脂糖4B介質(zhì)(阿瑪西亞(Amersham))的樣品緣行2小時(shí)。然后將混合物轉(zhuǎn)移到小的層析柱中，用5ml洗滌緩沖液(420mMNaP04pH7.3、150mMNaCL、1x蛋白酶抑制劑混合物)洗3次。使用0.5ml的洗脫緩沖液(50mMTrisHC1pH8、10mM還原型谷胱甘肽、10%甘油、lx蛋白酶抑制劑混合物)的4個(gè)不同級(jí)分洗脫出GST-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)和各級(jí)分純化以后，在5-18%SDS-PAGE梯度凝膠上分析，并用特異性抗GST標(biāo)簽的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(圖13和14)。圖13A的結(jié)果顯示HCT微弱地過(guò)表達(dá)，而且該蛋白質(zhì)可以通過(guò)GST-標(biāo)簽層析來(lái)純化。純化的蛋白質(zhì)制品(洗脫出的4個(gè)級(jí)分)在較高分子量范圍包含兩個(gè)條帶(72.2和70kDa)。72.2kDa的蛋白質(zhì)具有與預(yù)期的GST-HCT融合蛋白質(zhì)最接近的大小。70kDa的蛋白質(zhì)是未知的。低分子量物質(zhì)(約28kDa)相應(yīng)于單獨(dú)的GST標(biāo)簽。圖13B中的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果證明72.2kDa的蛋白質(zhì)與抗GST標(biāo)簽的抗體反應(yīng)，說(shuō)明其為預(yù)期的GST-HCT融合蛋白質(zhì)。同樣，28kDa的條帶與抗GST抗體強(qiáng)烈反應(yīng)，證實(shí)其為GST蛋白質(zhì)。圖14A中的結(jié)果顯示HQT微弱地過(guò)表達(dá)，而且該蛋白質(zhì)可以通過(guò)GST-標(biāo)簽層析來(lái)純化。純化的蛋白質(zhì)制品(洗脫出的前兩個(gè)級(jí)分)在較高分子量范圍包含兩個(gè)條帶(73.1和70kDa)。73.1kDa的蛋白質(zhì)具有與預(yù)期的GST-HQT融合蛋白質(zhì)最接近的大小。70kDa的蛋白質(zhì)是未知的。低分子量物質(zhì)(約28kDa)相應(yīng)于單獨(dú)的GST標(biāo)簽。圖14B中的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果證明73.1kDa的蛋白質(zhì)與抗GST標(biāo)簽的抗體反應(yīng)，說(shuō)明其為預(yù)期的GST-HQT融合蛋白質(zhì)。同樣，28kDa的條帶與抗GST抗體強(qiáng)烈反應(yīng)，證實(shí)其為GST蛋白質(zhì)。表7.將g^CT和Cc^2r亞克隆進(jìn)入質(zhì)粒pGTPcl03a中的特異性引物表?；蚧蛱禺愋砸镆镄蛄行蛄凶R(shí)別號(hào)178-HCT-S5，TTAATTAATTCGCGGATCCATGAAAATCGAGGTGAAGGA3"87178-HCT-R5，TATATATACTAGTCTAGATCAAATGTCATACAAGAAACTCTGGA3'88c卿r178-HQT-S5，TTTAAATTTCGCGGATCCATGAAGATAACCGTGAAGGAA3'89178-HQT-R5，TATATATACTAGTCTAGATCAGAAATCGTACAGGAACCT3'90實(shí)施例12用定量RT-PCR分析HOT、HCT、C3H、CCoAOMT-l、CCoAOMT-Ll、和CCoAOMT-L2基因的表達(dá)為了精確地測(cè)量各基因的表達(dá),使用基因特異性TaqMan51物/探針(表5)測(cè)定阿拉比卡變種(arabicavariety)阿拉比卡咖啡T2308和羅巴斯特種變種卡尼福拉咖啡BP409的幾種組織中的好gr、好CT、C好、CC"OA/T-/、cc^4c^/r-ij和ca^40MM2基因的轉(zhuǎn)錄水平。通過(guò)方法i按上述實(shí)施例2中的描述，用從4個(gè)不同發(fā)育期的阿拉比卡和羅巴斯特種咖啡的根、莖、葉、花、和從顆粒和果皮組織中分離的RNA來(lái)制備這些實(shí)驗(yàn)中不同的cDNA。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖8中顯示。編碼HCT和HQT的基因。以HQT和HCT基因設(shè)計(jì)TaqMan探針和引物(見表5)，然后使用這些測(cè)量幾個(gè)不同阿拉比卡和羅巴斯特種咖啡組織中各基因的轉(zhuǎn)錄水平(見實(shí)施例2)。羅巴斯特種的HQT表達(dá)譜(圖8)顯示該基因在少綠色期的顆粒中以相對(duì)高的水平表達(dá)(RQ0.71),而在所有其它檢測(cè)的組織中的表達(dá)水平低一些。值得注意的是相對(duì)于果皮發(fā)育后期，69少綠色果皮樣品的HQT水平也有輕微提高。先前發(fā)明者已經(jīng)證明該羅巴斯特種綠色顆粒樣品沒(méi)有胚乳特異性基因表達(dá)(臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/696,445)。通過(guò)后者可得出HQT基因可能在顆粒和果皮發(fā)育早期有高表達(dá)的結(jié)論，并且該轉(zhuǎn)錄水平在伴隨胚乳發(fā)育起始時(shí)的兩種組織中相對(duì)較低。在其它羅巴斯特種組織中的HQT表達(dá)水平說(shuō)明該基因通常在多種咖啡組織中以持續(xù)低的水平表達(dá)，提示其可能具有某些類型的"看家基因"的功能。當(dāng)檢測(cè)阿拉比卡中HQT的水平時(shí)，發(fā)現(xiàn)與羅巴斯特種在根、莖、和嫩葉、和多數(shù)顆粒和果皮組織中具有相對(duì)相似的水平。這與其可能是重要的看家基因的觀點(diǎn)是一致的。在阿拉比卡少綠色顆粒和果皮樣品中HQT水平較低，這與當(dāng)誘導(dǎo)胚乳特異性基因表達(dá)時(shí)，由于這些阿拉比卡少綠色顆粒中表達(dá)胚乳特異性基因，因此HQT降低的觀點(diǎn)一致(臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/696,445)。最后，應(yīng)該注意在阿拉比卡和羅巴斯特種的花中檢測(cè)到HQT表達(dá)也有很大的差異。該差異可能由于這兩種花樣品的精確發(fā)育期不同，在兩種花樣品之間幾種基因的表達(dá)顯著可變。羅巴斯特種的HCT表達(dá)語(yǔ)表明該基因在大綠色期(RQ0.33)和黃色期在果皮中相對(duì)高表達(dá)，在少綠色期(RQ0.09)和紅色期在果皮中表達(dá)水平較低。在羅巴斯特種的根和莖中轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)較高，而在葉和花中水平較低。在所研究的全部期的顆粒中也檢測(cè)到很低的水平。在阿拉比卡中具有不同模式的表達(dá)，在果皮中沒(méi)有檢測(cè)到HCT轉(zhuǎn)錄本，僅在少綠色期檢測(cè)到低水平。另外，在阿拉比卡的莖組織中檢測(cè)不到HCT轉(zhuǎn)錄本。相反，在阿拉比卡紅色期的葉和顆粒中檢測(cè)到比羅巴斯特種稍高水平的HCT。在有限數(shù)量的阿拉比卡組織樣品中檢測(cè)到HCT的表達(dá)，排除了由羅巴斯特種序列設(shè)計(jì)的HCTTaqman探針組不識(shí)別阿拉比卡變種的可能性。在阿拉比卡和羅巴斯特種的花樣品中HCT水平相似。相對(duì)于羅巴斯特種顆粒，在阿拉比卡顆粒中較高的HCT的表達(dá)表明在阿拉比卡和羅巴斯特種中綠原酸谞的差異部分是由于在成熟咖啡粒中HCT表達(dá)水平的不同。同樣，考慮到綠原酸可能涉及病原抗性(Shadle等人(2003);Niggeweg等人(2004))，在羅巴斯特種的根和莖中HCT的高表達(dá)70可能顯著提高羅巴斯特種相對(duì)于阿拉比卡咖啡的病原抗性。值得注意的是在羅巴斯特種BP-409葉樣品中HCT表達(dá)相對(duì)較低。然而，考慮到該葉樣品是來(lái)自正在展開的嫩葉，可能在成熟葉中HCT的表達(dá)要比嫩葉中顯著增高，這可能是由于在葉展開期間CGA合成木質(zhì)素和其它結(jié)構(gòu)型元件的可選擇的用途。在嫩葉中HCT轉(zhuǎn)錄水平比預(yù)期低的解釋進(jìn)一步支持了較高的HCT表達(dá)水平與較高的病原或疾病抗性相關(guān)這一論點(diǎn)，而這是成熟葉的重要特征。編碼C3H的基因。以C3H基因設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針(見表5)。該探針組用于檢測(cè)在實(shí)施例2種記錄的幾種不同阿拉比卡和羅巴斯特種咖啡組織中C3H的轉(zhuǎn)錄水平。圖8中的數(shù)據(jù)表明在所有檢測(cè)的羅巴斯特種組織中都能檢測(cè)到C3H轉(zhuǎn)錄本。在羅巴斯特種少綠色期顆粒樣品中檢測(cè)到相對(duì)高水平的C3H轉(zhuǎn)錄本，在果皮(在大綠色和黃色期)中也檢測(cè)到相對(duì)高水平的C3H轉(zhuǎn)錄本。在羅巴斯特種的莖、葉和花樣品中C3H轉(zhuǎn)錄本的水平較低。有趣的是，在羅巴斯特種的根樣品中沒(méi)有檢測(cè)到C3H轉(zhuǎn)錄本。在阿拉比卡中，除在少綠色期以外，顆粒中的C3H轉(zhuǎn)錄本水平與羅巴斯特種中的相似。認(rèn)為后者與上述阿拉比卡樣品的發(fā)育期較晚有關(guān)。有趣的是，在阿拉比卡的少綠色期果皮樣品中沒(méi)有檢測(cè)到C3H轉(zhuǎn)錄本，而在隨后的發(fā)育期直到紅色期其水平持續(xù)升高。這與羅巴斯特種樣品不同，在羅巴斯特種中C3H在發(fā)育早期表達(dá)水平較高，隨后在成熟期降低。編碼CCoAOMT-l的基因。以CCoAOMTl基因設(shè)計(jì)特異性TaqMan探針和兩個(gè)引物(見表5)。圖8中顯示該基因的定量RT-PCR數(shù)據(jù)。在羅巴斯特種顆粒中，在少綠色期CCoAOMT-l轉(zhuǎn)錄水平很低(RQ0.05)，而在大綠色期(RQ0.31)和黃色顆粒期(RQ0.76)較高，隨后在成熟顆粒中下降到很低的水平(RQ0.09)。在果皮中，其水平在少綠色果皮中較低(RQ0.15),在大綠色(RQ0.56)和黃色期(RQ0.65)稍微升高，隨后在紅色期又降為很低的水平(RQ0.06)。在羅巴斯特種中，在根(RQ1.09)和莖(RQ1.5)中CCoAOMT-l轉(zhuǎn)錄本的水平相對(duì)較高，在花中中等高(RQ0.58),在葉中很低(RQ0.06)。與BP409羅巴斯特種樣品相比較，在阿拉比卡T2308中，葉的CCoAOMT-l在少綠色期(RQ0.56)、和大綠色顆粒期(RQ1.21)和紅色顆粒期(RQ1.43)相對(duì)較高。在黃色顆粒期CCoAOMT-l水平意想不到地下降，這需要在其它阿拉比卡樣品中驗(yàn)證。在少綠色期、大綠色期、黃色期阿拉比卡果皮樣品中CCoAOMT-l轉(zhuǎn)錄本的水平相對(duì)較低。編碼CCoAOMT-Ll的基因。以CCoAOMT-Ll基因i殳計(jì)特異性TaqMan探針和兩個(gè)引物(見表5)。得到的定量RT-PCR結(jié)果表明CCoAOMT-Ll基因轉(zhuǎn)錄本的水平接近或低于所有檢測(cè)的羅巴斯特種組織中的水平。除花樣品以外，所有阿拉比卡樣品都獲得相對(duì)相似的結(jié)果。在此情況下，清楚地檢測(cè)到CCoAOMT-Ll轉(zhuǎn)錄本(RQ0.14),即，該基因的轉(zhuǎn)錄水平比在阿拉比卡少綠色顆粒期檢測(cè)到的(RQ0.018)高7.8倍。在阿拉比卡花樣品中這些轉(zhuǎn)錄本的存在表明該基因在花的一個(gè)或多個(gè)部分特異性表達(dá)。此外，在羅巴斯特種花中缺失CCoAOMT-Ll轉(zhuǎn)錄本表明阿拉比卡和羅巴斯特種的花在不同的成熟期，因此CCoAOMT-Ll的表達(dá)可能在花發(fā)育過(guò)程中具有階段特異性。許多其他咖啡基因顯示在同樣阿拉比卡和羅巴斯特種花樣品中廣泛的差異表達(dá),再次表明這些樣品處于不同的成熟期，這也支持了上述論點(diǎn)。編碼CCoAOMT-L2的基因。以CCoAOMT-L2基因設(shè)計(jì)特異性T叫Man探針和兩個(gè)引物(見表5)。獲得的該基因的定量RT-PCR結(jié)果表明，除在羅巴斯特種的花樣品以外，使用此處所述實(shí)驗(yàn)條件在任意羅巴斯特種或阿拉比卡組織樣品中都檢測(cè)不到CCoAOMT-L2的表達(dá)。值得注意的是，對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示rpl39引物/探針組和CCoAOMT-L2引物/探針組當(dāng)對(duì)它們各自質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)試時(shí)的擴(kuò)增效率相似。因此，在羅巴斯特種或阿拉比卡中檢測(cè)不到CCoAOMT-L2基因的表達(dá)可能不是由于CCoAOMT-L2引物/探針組的特異性問(wèn)題。實(shí)施例13重組咖啡HCT的功能性活性沒(méi)有檢測(cè)到來(lái)自大腸桿菌中產(chǎn)生的重組GST-標(biāo)簽HCT和GST-標(biāo)簽HQT蛋白質(zhì)的活性。為了檢測(cè)GST標(biāo)簽是否防礙了這些蛋白質(zhì)的活性，通過(guò)酶切從各蛋白質(zhì)上除去GST標(biāo)簽。然后再分析重組HCT和HQT蛋白質(zhì)(無(wú)標(biāo)簽)的活性。AcTEV蛋白酶消化將按實(shí)施例11中所描述的產(chǎn)生和純化的重組HCT-GST或HQT-GST重組蛋白質(zhì)根據(jù)供應(yīng)商說(shuō)明書(英杰公司)用AcTEV消化將140nl重組酶用7.5nlTEV緩沖液(20x緩沖液，英杰公司)、1.5jil的0.1mMDTT和2fil的AcTEV蛋白酶(20單位)在30°C消化2小時(shí)。酶測(cè)定使用修改的Mggeweg等人，2004和Hoffmann等人，2003的方法。用逆反應(yīng)(切割5-CQA形成咖啡酰-輔酶A和奎尼酸)在40。C測(cè)定酶活性。反應(yīng)混合物(總體積200fil)為100mMNa-Pi緩沖液pH6.5、lmMDTT、5mMCGA(5畫CQA-希格瑪公司)、3.3mM輔酶A、和30jiLAcTEV消化的GST-HCT或GST-HQT重組酶。通過(guò)加入底物輔酶A來(lái)起始反應(yīng)。在各時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)加入170nl終止緩沖液(0.1。/。曱酸、5%乙腈)終止30jd的反應(yīng)混合物。隨后用0.2nm濾器過(guò)濾該物質(zhì)，然后上樣于HPLC柱。HPLC方法用HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物，使用Waters反相C18柱(4pm，4.6x250mm)和(8-50。/o)梯度乙腈溶劑A為91%的milliQ超純H20、8%CH3CN、和1%曱酸；溶劑B為49%milliQ超純H20、50%CH3CN、和1%甲酸，溶劑用30%氦噴霧。梯度如下0分鐘，98%A-2%B;5分鐘，92%A-8%B;25分鐘，50%A-50%B;30分鐘，30%A-70%B;35分鐘,30%A-70%B;然后從37-45分鐘，98%A-2%B。在325nm檢測(cè)洗脫的化合物。通過(guò)洗脫時(shí)間和紫外吸光i普來(lái)表征化合物，并且在可實(shí)施時(shí)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)物來(lái)證實(shí)其同一性。結(jié)果用AcTEV蛋白質(zhì)處理GST-標(biāo)簽HCT和GST-標(biāo)簽HQT，通過(guò)SDSPAGE凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色來(lái)顯示，從各GST-標(biāo)簽"前體"蛋白質(zhì)產(chǎn)生具有全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的預(yù)期分子量的較小的多肽。這證明AvTEV蛋白酶成功地從GST-HCT和GST-HQT蛋白質(zhì)釋放GST-標(biāo)簽，并且因此產(chǎn)生正73常的全長(zhǎng)HCT和HQT多肽。圖20顯示HCT/HQT活性的對(duì)照反應(yīng)(切割5-CQA形成咖啡酰-輔酶A和奎尼酸)。該反應(yīng)包含所有反應(yīng)物，但是不加酶。圖20中的結(jié)果證明在所應(yīng)用的條件下，綠原酸(5-CQA)是穩(wěn)定的；CGA峰在T=4小時(shí)僅比T=0時(shí)的峰稍低，而只在12.1分鐘出現(xiàn)很小的峰。相反，圖21顯示在AvTEV處理分GST-HCT蛋白質(zhì)的反應(yīng)中CGA峰顯著降低(從T-O的約0.035到T=4小時(shí)的約0.02)。CGA峰的減少伴隨幾個(gè)新峰的出現(xiàn)。新的峰分別在約8分鐘、17.1分鐘和18.3分鐘，除此之外CGA峰的肩峰顯著發(fā)展。因?yàn)樵谶@些洗脫條件下，咖啡酸的洗脫峰與5-CQA峰特別接近，加入重組咖啡HCT多肽引起咖啡酸的累積。雖然該反應(yīng)的預(yù)期產(chǎn)物是咖啡酰-輔酶A，但是該分子在所用緩沖液中可能不穩(wěn)定并迅速降解，形成可檢測(cè)到的咖啡酸。與此論點(diǎn)一致，可能在17.1分鐘和18.3分鐘的峰之一實(shí)際上是咖啡酰-輔酶A。參考文獻(xiàn)AltschulS.F"MaddenT丄.，SchafferA.A.，ZhangJ.，ZhangZ.，MillerW"LipmanD.J.(1997)GappedBLASTandPSI畫BLAST:a雨generationofproteindatabasesearchprograms.NucleicAcidsRes.25:3389-3402.BenAmorM.andMcCarthyJ.(2003)Modulationofcoffeeflavourprecursorlevelsingreencoffeegrains.EuropeanPatentEPC/03394056,0.CliffordM.N.(1985)Chlorogenicacids,inCoffee1.Chemistry,EdbyClarkeRJandMacraeR.ElsevierAppliedScience,London,pp153-202.CliffordM.N.，WalkerR(1987)Chlorogenicacids-confoundersofcoffee士serumcholesterolrelationships.FoodChem24:77-80.CliffordM.N.(1998)Thenatureofchlorogenicacids-aretheyadvantageouscompoundsincoffee,inDix-sept"meColloqueScientifiqueInternationalsurleCaf6.ASIC，Paris,pp79-91.CliffordM.N.(1999)Chlorogenicacidsandothercinnamates—nature,occurenceanddietaryburden.JSciFoodAgric79:362-372.CliffordM.N.(2000)Chlorogenicacidsandothercinnamates-nature,occurrence,dietaryburden,absorptionandmetabolismJSciFoodAgric80:1033-1043.CrouzillatD.，LerceteauE.，PetiardV"MoreraJ.，RodriguezH.，WalkerD.，PhilipsW.R.R,SchnellJ.，OseiJ.andFritzP.(1996).TheobromacacaoL.:ageneticlinkagemapandquantitativetraitlocianalysis.TheorApplGenet,93:205-214.FerrerJL,ZubietaC，DixonRA,NoelJP(2005)CrystalstructuresofalfalfacaffeoylcoenzymeA3-O-methyltraiisferase.PlantPhysiol137:1009-1017.GangD.，WangJ.，DudarevaN.，HeeNamK，SimonJ.，LewinsohnE.,PicherskyE(2001)AnInvestigationoftheStorageandBiosynthesisofPhenylpropenesinSweetBasilPlantphysiol.125:539-555,GraceS.C.，LoganB.A.(2000)EnergydissipationandradicalscavengingbytheplantphenylpropanoidpathwayPhil,Trans.R.Soc.Lond.B.355:1499-1510.HoffmannL.，MauryS"MartzF"GeoffroyP"LegrandM..(2003)Purification,Cloning,andPropertiesofanAcyltransferaseControllingShikimateandQuinateEsterIntermediatesinPhenylpropanoidMetabolismJ.Bio.Chem.278(1):95-103.HoffmannL.,BesseauS.，GeoffroyP,RitzenthalerC.，MeyerD.LapierreC，PolletB.LegrandM(2004)SilencingofHydroxycinnamoyl畫CoenzymeAShikimate/QuinateHydroxycinnamoyltransferaseAffectsPhenylpropanoidBiosynthesisPlantCell16:1446-1465.HollmanP.C.H.(2001)Evidenceforhealthbenefitsofplantphenols:localorsystemiceffectsJ.Sci.FoodAgric.81:842-852.InoueK，SewaltVJ，MurrayGB，MW，SturzerC,DixonRA(1998)Developmentalexpressionandsubstratespecificitiesofalfalfacaffeicacid3-O-methyltransferaseandcaffeoylcoenzymeA3-O-methyltransferaseinrelationtolignification.PlantPhysiol117:761-770.KyC.-L.，LouarnJ"DussertS"GuyotB.，HamonS.，NoirotM.(2001)Cafeine，trigonelline,chlorogenicacidsandsucrosediversityinwild阿拉t匕卡咖叫一L.andC.canephoraP.accessionsFoodChemistry75:223-230.LeeC.Y"JaworskiA.(1987)PhenoliccompoundsinwhitegrapesgrowninNewYork.Am.Enol.&Viticul.38:277-281.LeloupV"LouvrierA.，LiardonR.(1995)Degradationmecanismsofchlorogenicacidsduringroasting.Compte-rendusduSeizi色meColloquedel,ASIC(AssociationScientifiqueInternationalesurleCaf6)ASICKyotopp192-198.MaherE.A，，BateN.J.，NiW"ElkindY"DixonR.A.，LambC.J.(1994)Increaseddiseasesusceptibilityoftransgenictobaccoplantswithsuppressedlevelsofpreformedphenylpropanoidproducts.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:7802-7806.MarracciniP"DeshayesA.，P6tiardV.andRogersW.J.1999.MolecularcloningofthecompleteUSseedstorageproteingeneof阿拉比卡咖啡andpromoteranalysisinthetransgenictobaccoplants.PlantPhysiol.Biochem.37:273-282.Maury,S"Geoffroy，P"Legrand，M.(1999)TobaccoO-methyltransferasesinvolvedinphenylpropanoidmetabolism.Thedifferentcaffeoyl-coenzymeA/5-hydroxyferuloyl-coenzymeA3/5-O-methyltransferaseandcaffeicacid/5-hydroxyferulicacid3/5-O-methyltransferaseclasseshavedistinctsubstratespeci打citiesandexpressionpatterns.PlantPhysiol.121:215-224.MitchellH.J.，HallS.A.,StratfordR.，HallJ丄.，BarberM.S.(1999).Differentialinductionofcinnamylalcoholdehydrogenaseduringdefensivelignificationinwheat(TriticumaestivumL):characterisationofthemajorinducibleform.Planta208:31-37,MontavonP"DuruzE.，RumoG"PratzG.(2003a)EvolutionofGreenCoffeeProteinProfileswithMaturationandRelationshiptoCoffeeCupQualityJ.Agric.FoodChem.51:2328-2334.MontavonP"MauronA.F.DuruzE.(2003b)ChangesinGreenCoffeeProteinProfilesduringRoastingFoodChem.51:2335-2343.NairR.，XiaQ.，KarthaC.,KuryloE.，HirjiR.，DatlaR.，SelvarajG.(2002)ArabidopsisCYP98A3MediatingAromatic3-Hydroxylation.DevelopmentalRegulationoftheGene，andExpressioninYeastPlantphysiol.130:210-220.NatellaF"NardiniM.，GiannettiI"DatilloC"ScacciniC.(2002)CoffeeDrinkingInfluencesPlasmaAntioxidantCapacityinHumansJ.Agric.FoodChem.50:6211-6216.NiggewegR.，MichaelA"MartinC.(2004)EngineeringplantswithincreasedlevelsoftheantioxydantchlorogenicacidNatureBiotech.22(6):746-54.OhnishiM.，MorishitaH.，IwahasiH.,TodaS.，ShiratakiY"KimuraM.,KidoR.(1994)Inhibitoryeffectsofchlorogenicacidsonlinoleicacidperoxidationandhaemolysis.Phytochemistry36:579-584.OlthofM.R.，HollmanP.C.H.，KatanM.B.(2001)Chlorogenicacidandcaffeicacidareabsorbedinhumans.J.Nutr.131:66-71.ParvathiK，ChenF,GuoDJ，BlountJW，DixonRA(2001)SubstratepreferencesofO-methyltransferasesinalfalfasuggestnewpathwaysfor3-O-methylationofmonolignols.PlantJournal25:193-202.Rice-EvansC.A.，MillerM.J.，PagangaG.(1996)Structure曙antioxidantactivityrelationshipsofflavonoidsandphenolicacids.FreeRad.Biol.Med.20:933-956,RogersJ"MichauxS,，BastinM.，BucheliP.(1999)Changestothecontentofsugars,sugaralcohols,myo-inositol，carboxylicacidsandinorganicanionsindevelopinggrainsfromdifferentvarietiesofRobusta(Coffeacanephora)andArabica(C.arabica)coffeesPlantScience.149:115-123.SchochG"GoepfertS.，MorantM.，HehnA.，MeyerD.，UllmannP"Werck-RdchhartD.(2001)CYP98A3fromArabidopsisthalianaIsa3-HydroxylaseofPhenolicEsters,aMissingLinkinthePhenylpropanoidPathway.J.Bio.Chem.266(39):36566-36574.ShadleG.，WesleyV"KorthK.，ChenF.，LambC.，DixonR.(2003)Phenylpropanoidcompoundsanddiseaseresistanceintransgenictobaccowithalteredexpressionofl畫phenylalanineammonia-lyasePhytochemistry64:153-161.ShibataH.，SakamotoY"OkaM.，KonoY.(1999)Naturalantioxidant,chlorogenicacid,protectsagainstDNAbreakagecausedbymonochloramine.Biosci.Biotechnol.Biochem.63:1295-1297.TamagnoneT，MeridaA.，StaceyN.，PlaskittK.，ParrA.，ChangC.F"LynnD.，DowM.，RobertsK.，MartinC.(1998)InhibitionofPhenolicAcidMetabolismResultsinPrecociousCellDeathandAlteredCellMorphologyinLeavesofTransgenicTobaccoPlantsPlantCell10:1801-1816.Voilley,A.，Sauvageot,F"Durand,D.(1977).InfluencesurI'amertumed'uncaf6boissondequelquesparam6tresd'extraction.Compte醒RendusduHuiti6meColloquedel'ASIC(AssociationScientifiqueInternationalsurleCaK)，ASICpp192-198251—259.ZhongR，IIIW，NegrelJ，YeZH(1998)Dualmethylationpathwaysinligninbiosynthesis.PlantCell1998Dec;10(12):2033-46.權(quán)利要求1.從咖啡分離的核酸分子，其具有類苯基丙烷途徑酶的編碼序列，所述酶選自羥基肉桂酰-輔酶A莽草酸酯/奎尼酸酯羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶、羥基肉桂酰-輔酶A奎尼酸酯羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶、(對(duì))-香豆酰3’羥化酶和咖啡酰-輔酶A3-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶。2.權(quán)利要求1的核酸分子，其中該編碼序列編碼羥基肉桂酰-輔酶A莽草酸酯/奎尼酸酯羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶。3.權(quán)利要求2的核酸分子，其中羥基肉桂酰-輔酶A莽草酸酯/奎尼酸酯羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶具有與SEQIDNO:9或SEQIDNO:IO的同一性大于86.9%的氨基#列。4.權(quán)利要求3的核酸分子，其中羥基肉桂酰-輔酶A莽草酸酯/奎尼酸酯羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶具有包含SEQIDNO:9或SEQIDNO:IO的氨基^列。5.權(quán)利要求2的核酸分子，其中該編碼序列與SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的同一性大于78.5%。6.權(quán)利要求5的核酸分子，其中該編碼序列包含SEQIDNO:l或SEQIDNO:2。7.權(quán)利要求1的核酸分子，其中該編碼序列編碼羥基肉桂酰-輔酶A查尼酸酯羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶。8.權(quán)利要求7的核酸分子，其中羥基肉桂酰-輔酶A奎尼酸酯羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶具有的氨基酸序列與SEQIDNO:ll或SEQIDNO:12的同一性大于78.1%。9.權(quán)利要求8的核酸分子，其中羥基肉桂酰-輔酶A奎尼酸酯羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶具有包含SEQIDNO:ll或SEQIDNO:12的氨基酸序列。10.權(quán)利要求7的核酸分子，其中該編碼序列與SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的同一性大于72.1%。11.權(quán)利要求10的核酸分子，其中該編碼序列包含SEQIDNO:3或SEQIDNO:4。12.權(quán)利要求1的核酸分子，其中該編碼序列編碼(對(duì))-香豆酰3，羥化酶。13.權(quán)利要求12的核酸分子，其中(對(duì))-香豆酰3'羥化酶具有與SEQIDNO:13的同一性大于82.9%的氨基,列。14.權(quán)利要求13的核酸分子，其中(對(duì))-香豆酰3，羥化酶具有包含SEQIDNO:13的氨基酸序列。15.斥又利要求12的核酸分子，其中該編碼序列與SEQIDNO:5的同一性大于69.4%。16.權(quán)利要求15的核酸分子，其中該編碼序列包含SEQIDNO:5。17.權(quán)利要求1的核酸分子，其中該編碼序列編碼咖啡酰-輔酶A3-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶。18.權(quán)利要求17的核酸分子，其中咖啡酰-輔酶A3-氧位-曱基轉(zhuǎn)移酶具有與SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:16的同一性大于86.3%的氨基#列。19.權(quán)利要求18的核酸分子，其中咖啡酰-輔酶A3-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶具有包含SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:16的氨基紗列。20.權(quán)利要求19的核酸分子，其中該編碼序列包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDNO:8。21.權(quán)利要求1的核酸分子，其中該編碼序列是基因的開放讀碼框。22.由權(quán)利要求21的基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA分子。23.由權(quán)利要求22的mRNA分子通過(guò)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA分子。24.長(zhǎng)度在8到100堿基之間的寡核苷酸，其與權(quán)利要求1的核酸分子的片段互補(bǔ)。25.載體，其包含權(quán)利要求l的核酸分子的編碼序列。26.權(quán)利要求25的載體，其為表達(dá)載體，選自質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、桿狀病毒、桿粒、細(xì)菌、酵母和病毒載體組成的組。27.權(quán)利要求25的載體，其中核酸分子的編碼序列被有效連接于組成型啟動(dòng)子。28.權(quán)利要求25的載體，其中核酸分子的編碼序列被有效連接于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。29.權(quán)利要求25的載體，其中核酸分子的編碼序列被有效連接于組織特異型啟動(dòng)子。30.權(quán)利要求29的載體，其中組織特異型啟動(dòng)子是種子特異型啟動(dòng)子。31.權(quán)利要求30的載體，其中種子特異型啟動(dòng)子是咖啡種子特異型啟動(dòng)子。32.用權(quán)利要求25的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。33.權(quán)利要求32的宿主細(xì)胞，其選自植物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞組成的組。34.權(quán)利要求33的宿主細(xì)胞，其為植物細(xì)胞，選自咖啡、煙草、擬南芥、玉米、小麥、稻、大豆、大麥、黑麥、燕麥、高粱、苜蓿、三葉草、油菜、紅花、向日葵、花生、可可、特梅提諾、馬鈴薯、胡椒、茄子、甜菜、胡蘿卜、黃瓜、萵苣、豌豆、紫菀、秋海棠、菊、翠雀、百日草和草碎草組成的組。35.從權(quán)利要求34的植物細(xì)胞產(chǎn)生的可育植物。36.調(diào)控咖啡豆的香p木或香氣的方法，其包含調(diào)控咖啡種子中一種或多種類苯基丙烷途徑酶的產(chǎn)生或活性，其中所述類苯基丙烷途徑酶選自羥基肉桂酰-輔酶A莽草酸酯/套尼酸酯羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶、羥基肉桂酰-輔酶A奎尼酸酯羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶、(對(duì))-香豆酰3，羥化酶和咖啡酰-輔酶A3-氧位-曱基轉(zhuǎn)移酶。37.權(quán)利要求36的方法，其包括增加一種或多種類苯基丙烷途徑酶的產(chǎn)生或活性。38.權(quán)利要求37的方法，其包括在咖啡種子中增加一種或多種內(nèi)源類苯基丙烷途徑酶基因的表達(dá)。39.權(quán)利要求37的方法，其包括向植物中引入編碼類苯基丙烷途徑酶的轉(zhuǎn)基因。40.權(quán)利要求36的方法，其包括減少一種或多種類苯基丙烷途徑酶的產(chǎn)生或活性。41.權(quán)利要求40的方法，其包括向咖啡中引入核酸分子從而抑制編碼一種或多種類苯基丙烷途徑酶的基因的表達(dá)。全文摘要本發(fā)明公開了在咖啡植物中涉及綠原酸的生物合成途徑的多核苷酸和多肽。還公開了使用這些多核苷酸和多肽用于制備咖啡豆的香味、香氣和其它特征的方法，及其用于保護(hù)咖啡植物對(duì)抗疾病或氧化脅迫的方法。文檔編號(hào)C07K14/415GK101326194SQ200680045889公開日2008年12月17日申請(qǐng)日期2006年10月10日優(yōu)先權(quán)日2005年10月7日發(fā)明者G·舍米納德,J·G·麥卡錫,M·勒佩萊,S·D·坦克斯雷,V·帕蒂爾,林晨煒申請(qǐng)人:康乃爾大學(xué);雀巢技術(shù)公司