專利名稱：桔?；钚圆课坏闹苽?、應(yīng)用及質(zhì)量控制檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域和色譜檢測(cè)方法，具體涉及桔?；钚圆课坏闹苽浼靶禄衔?的提取分離方法及化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定；桔梗活性部位在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用；高效液相色譜法 測(cè)定桔梗提取物及活性部位中的單體皂苷含量的方法。
背景技術(shù)：
桔梗Platycodon grandif lorum(Jacq. )A. DC為桔?？浦参锒嗄晟荼局参?，其藥 用部位為根，為我國(guó)常用的四十種中藥之一，廣泛分布于我國(guó)，朝鮮半島和日本，桔梗性味 苦、辛、平，歸肺經(jīng)，有開(kāi)宣肺氣，祛痰排膿之功效。常用于外感咳嗽、咳痰不清、咽喉腫痛、胸 悶腹脹、痢疾腹痛、血淤水腫、癃閉等癥，為常用中藥。國(guó)內(nèi)外研究表明，桔梗中有效成分為 桔梗皂苷，桔梗具有抗炎、祛痰、保肝、降血糖、抑制脂肪吸收、抗氧化、抗菌等廣泛的藥理作 用。桔梗作為一種藥食兩用的植物，無(wú)毒副作用，因此其具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。目前國(guó)內(nèi)外 對(duì)桔?？傇碥赵诳鼓[瘤方面的研究為一片空白。目前，對(duì)桔梗的質(zhì)量控制多以桔梗皂苷為研究指標(biāo)。2005版《中國(guó)藥典》采用重量 法測(cè)定桔梗中總皂苷的含量，規(guī)定藥材中總皂苷含量不得低于6%，該方法操作繁瑣，測(cè)量 誤差較大，重現(xiàn)性差。目前國(guó)內(nèi)對(duì)桔梗單體皂苷的含量測(cè)定，多以桔梗皂苷D為指標(biāo)成分。 桔梗中皂苷成分種類較多，同一樣品中各單體成分的含量差異較大。采用單體皂苷對(duì)桔梗 皂苷進(jìn)行質(zhì)量分析，作為評(píng)價(jià)桔梗質(zhì)量或進(jìn)行良種選育的指標(biāo)，缺乏整體性和科學(xué)性。同 時(shí)，國(guó)內(nèi)外在對(duì)桔梗皂苷D的含量測(cè)定中，桔梗皂苷D與桔梗皂苷D2未完全分離，導(dǎo)致其含 量測(cè)定的不準(zhǔn)確(朱丹妮，郅慧，高山林.HPLC-E1SD法測(cè)定桔梗中桔梗皂苷D的含量.植 物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2001，10(4) 11-13.張振凌，楊海玲，張紅偉等.炮制對(duì)桔梗不同飲片 中桔梗皂苷D含量的影響.中成藥，2008，30 (4) =554-556.郭麗，肖永慶，張村等.桔梗藥 材中桔梗皂苷D的定性定量方法研究.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30 (3) =200-209.黃櫻， 史春蕾，劉墨祥等.HPLC-ELSD法測(cè)定桔梗飲片中8種桔梗皂苷的含量.揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(自 然科學(xué)版)，2008，11 (4) :41-43·)。本發(fā)明通過(guò)對(duì)桔?？傇碥盏南到y(tǒng)研究，藥理篩選發(fā)現(xiàn)桔?？傇碥諏?duì)多種癌細(xì)胞具 有顯著的抑制作用，在此基礎(chǔ)上，又對(duì)桔梗總皂苷中單體成分進(jìn)行了研究，分離得到了桔梗 皂苷D、遠(yuǎn)志皂苷D2、桔梗皂苷D3、去芹菜糖桔梗皂苷D3、桔梗皂苷D2、去芹菜糖桔梗皂苷D2、 去芹菜糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E及兩種新的三萜皂苷，并利用分離得到的八種單體皂苷建 立定量分析方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供安全有效毒副作用低的抗腫瘤效果顯著的中藥活性部 位，并提供一種制備方法。本發(fā)明目的之二是提供一種具有抗腫瘤活性的藥物，以桔梗提取物和可藥用輔料 組成。
本發(fā)明目的之三是對(duì)桔?；钚圆课恢袉误w成分進(jìn)行研究，以期尋找抗腫瘤活性強(qiáng) 的單體皂苷。本發(fā)明目的之四是提供兩種新的桔梗皂苷化合物(化合物A，化合物B)。 化合物A化合物B本發(fā)明的目的之五是提供制備這兩種化合物(化合物A，化合物B)的方法。本發(fā)明的目的之六是提供三種全面的準(zhǔn)確的控制桔梗提取物及活性部位的質(zhì)量 控制檢測(cè)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案依此包含如下方法步驟1、桔?；钚圆课坏闹苽?1)、將桔梗生藥粉碎后，用3-5倍水或含水有機(jī)溶劑回流或超聲提取；每次回流 提取時(shí)間為1-3小時(shí)，超聲提取時(shí)間為0. 5-2小時(shí)，提取液減壓濃縮得浸膏；提取中所用含水有機(jī)溶劑是指含不同量的水的甲醇、乙醇、異丙醇等。(2)、將步驟(1)中所得浸膏用去離子水將浸膏溶解，采用3-10倍有機(jī)溶劑萃??； 棄去有機(jī)溶劑層，將水層減壓濃縮，除去有機(jī)溶劑。所用有機(jī)溶劑指乙酸甲酯、乙酸乙酯、石油醚、汽油等。(3)、將步驟(2)所得水溶液通過(guò)大孔樹(shù)脂，用去離子水洗脫至流出液無(wú)色，采用 不同濃度乙醇梯度洗脫，收集50-95%乙醇洗脫液，減壓濃縮，完全去除乙醇和水，得桔梗提 取物。不同濃度乙醇指50-95%的乙醇；大孔樹(shù)脂指AB-8或D-101型樹(shù)脂。所得桔梗活性部位中可測(cè)總皂苷成分應(yīng)大于50%所得桔?；钚圆课恢袘?yīng)含有如下成分桔梗皂苷D、遠(yuǎn)志皂苷D2、去芹菜糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、去芹菜糖 桔梗皂苷D3、桔梗皂苷D2、去芹菜糖桔梗皂苷D2。2、本發(fā)明中皂苷單體化合物的提取分離步驟和方法如下取步驟1中所得桔梗提取物213g，按附圖1所示進(jìn)行柱色譜層析分離，用氯仿-甲 醇梯度洗脫，TLC檢測(cè)，將相同餾分合并，得八份餾分Frl-FrS。Fr7(氯仿-甲醇，2 1) 濃縮至干，得浸膏(30g)，浸膏經(jīng)中壓柱色譜，采用氯仿甲醇梯度洗脫，氯仿-甲醇(5 1) 部分經(jīng)制備HPLC得化合物A (IOmg)，B (7. 5mg)，氯仿-甲醇(2 1)部分經(jīng)制備HPLC得化合物1(351^)，2(211^)，氯仿-甲醇(1 1)部分，其中24-28部分經(jīng)制備HPLC得化合物 3(18mg)，4(24mg)，5(17.8m)，6(101mg)。Fr8(氯仿-甲醇，0 1，8g)溶于甲醇后，溶液中 加入石油醚-丙酮(1 1)，白色沉淀析出，過(guò)濾得沉淀，經(jīng)制備HPLC得化合物7(43mg)， 8 (40mg)。對(duì)于色譜分離過(guò)程中使用的不同填料，采取的不同條件，具體為(1)大孔樹(shù)脂 層析采用常壓玻璃柱，以AB-8或DlOl大孔樹(shù)脂為填料，柱床所用大孔樹(shù)脂質(zhì)量為樣品 的5-100倍，采用不同濃度乙醇梯度洗脫，收集洗脫液，直到流出液中不含樣品為止，每次 增加20%的比例進(jìn)行下一步洗脫，洗脫液減壓濃縮至干；(2)硅膠柱層析采用常壓玻璃 柱，以100-400目正相硅膠為填料，柱床所用硅膠量于樣品比為5-100倍，采用氯仿-甲醇 (100 1-0 1)不同體積比的梯度洗脫，收集洗脫液，直到流出液中不含樣品為止，增大極 性，進(jìn)行下一步洗脫，洗脫液減壓濃縮至干；(3)中壓柱色譜采用常壓玻璃柱，以300-400 目硅膠為填料，柱床所用硅膠量于樣品比為5-50倍，采用氯仿-甲醇(100 1-0 1) 不同體積比的梯度洗脫，收集洗脫液，直到流出液中不含樣品為止，增大極性，進(jìn)行下一 步洗脫，洗脫液減壓濃縮至干；(4)高效液相制備色譜采用不銹鋼制備柱，填料為C18或 C30反相硅膠，檢測(cè)波長(zhǎng)為200-210nm，采用不同比例甲醇水為流動(dòng)相，甲醇水的比例為 10 90-70 30，按色譜峰進(jìn)行收集。所得兩個(gè)新化合物結(jié)構(gòu)鑒別如下化合物A白色粉末，[α] ° +0.007° (c = 0. 63，MeOH)。ESI-MS給出分子離子峰m/ ζ827[Μ-ΗΓ，碎片峰 m/z 665 [Μ-162-ΗΓ，m/z 503 [Μ-162-162-ΗΓ 表示該化合物結(jié)構(gòu)中含 有兩個(gè)六碳糖。HR-ESI-MS :m/z 827. 4432 ([Μ-ΗΓ，Calcd for C42H67O16 :827· 4424)，結(jié)合 1H-NMR 和 13C-NMR 推斷該化合物的分子式為 C42H68O16。IR(KBr) :3380cm"1 (-0H)，1677cm"1 (-C =0)，1648cm-1 (C = C)。1H-WlUeOOMHz, pyridine-d5)顯示兩個(gè)糖端基氫信號(hào) δ 5. 03 (d, J = 7. 8Hz)和 δ 5. 08 (d，J = 7. 8Hz)，七組甲基氫信號(hào) δ 1. 00 (3Η，s)，1. 17 (3H，s)，1. 21 (3H，s)，1. 26 (3H， s)，1. 31 (3H, s)，1. 34 (3H, s)，1. 35 (3H, s)及一個(gè)雙鍵S信號(hào) δ 5. 57 (br. s.)。13C-NMR 顯示 該化合物中有42個(gè)碳原子信號(hào)，其中12個(gè)碳原子為糖基中碳原子。結(jié)合DEPT譜，化合物 中甲基的化學(xué)位移分別為δ 16. 2，17. 3，18. 1，18. 4，26. 9，28. 8，30. 1 ；兩個(gè)不飽和碳原子 δ 123. 2和142. 6，兩個(gè)糖的端基碳原子δ 106. 5和108. 1，一個(gè)羰基碳原子δ 179. 6，以上 信息顯示該化合物為齊墩果酸型三萜皂苷類化合物。結(jié)合HMQC譜對(duì)苷元中碳、氫原子的化 學(xué)位移進(jìn)行了歸屬(表1)。HMBC譜圖，Η3-29( δ 1. 21)禾口Η3_30( δ 1. 35)分別與 C_18( δ 55. 6)，C_19( δ 34. 6)， C-21 ( 5 79. 0), C-22( 5 44. 9)有遠(yuǎn)程相關(guān)；H-22 α ( δ 2· 42)和 Η-22 β ( δ 1· 26)與 C-21( δ 79. 0)相關(guān)。Η_22α ( δ 2. 42)與 C_16( δ 83. 4)相關(guān)，Η_15( δ 1. 70,2. 25)分別與 C-16 ( δ 83. 4)和 C-26 ( δ 26. 9)相關(guān)；Η3_23 ( δ 1. 17)和 Η3_24 ( δ 1. 31)分別與 C-3 ( δ 81. 4) 遠(yuǎn)程相關(guān)，可推斷，δ 81. 4位于C-3位。NOESY譜圖顯示，H_16( δ 4. 34)與Η_26 ( δ 1. 00)有NOE增益，可判斷化合物中16 位為 α 構(gòu)型，Η_21( δ 3. 42)與 Η_18(δ0·94) ；Η-21( δ 3. 42)與 Η-22 β (δ 1. 26)有 NOE 增 益，表明C-21構(gòu)型為β構(gòu)型，該部分構(gòu)型與化合物prosapogenin—致。以上數(shù)據(jù)表明化 合物 A^J 2β ,3β ,16α ,21β -tetrahydroxyolean-12-ene-28-oic acid 化合物。
化合物A酸水解，所含糖TLC檢測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照鑒定為葡萄糖，測(cè)定水解單糖的旋 光值([a]u +1.16°, c = 0.21，H2O)，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照鑒定為D型葡萄糖。1H-NMR譜中糖的兩 個(gè)端基氫偶合常數(shù)為7. 8Hz，因此化合物中糖的構(gòu)型為β型。結(jié)合TOCSY譜，對(duì)單糖中各 個(gè)碳原子的化學(xué)位移進(jìn)行了歸屬(表1)。HMBC譜顯示，H-I' ( δ 5. 03)和H-I “ ( δ 5. 08) 分別與C-3(S81.4)及C-16(S83. 3)有相關(guān)，表明化合物中糖分別連在C_3位和C-16位。 同時(shí)，NOESY 譜圖中，H-I' ( δ 5. 03)與 Η-3( δ 4. 13) ;Η-1" ( δ 5· 08)與 H-16 ( δ 4· 34)有 NOE增益近一步證明化合物中糖分別位于C-3位和C-16位。根據(jù)以上數(shù)據(jù)綜合解析，該化合物A的結(jié)構(gòu)確定為3-0- β -D-glucopyranosyl-16 -0- β -D-glucopyranosyl-2 β,3β,16α,21β -tetrahydroxyolean-12-en-28-oic acid, 為一個(gè)新化合物?；衔顱白色粉末，-0.002° (c = 0. 43，MeOH)。ESI-MS給出分子離子峰m/z 797[M-H]_，二級(jí)質(zhì)譜碎片 m/z 635 [Μ_162_Η]_ 及 m/z 503 [Μ_162-132_Η]_ 表明化合物中存 在一個(gè)六碳糖和一個(gè)五碳糖。根據(jù) HR-ESI-MS m/z :797· 4321 [Μ-ΗΓ(Calcd for C41H65O15 797. 4318)和1H-NMR和13C-NMR綜合解析推斷該化合物的分子式為C41H66015。化合物酸水解 后，所得單糖經(jīng)TLC檢測(cè)并與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，鑒定為葡萄糖與木糖；采用制備TLC純化水解液 中兩個(gè)單糖，測(cè)定單糖旋光值并與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，兩個(gè)糖分別為D-葡萄糖([α]= +1.16°,C = 0. 21, H2O)與D-木糖([ B0+0.25°, C = 0. 12, H2O) ；1H-NMR譜中糖的兩個(gè)端基氫偶合常數(shù)為 7. 5Hz，表明化合物中D-葡萄糖與D-木糖的為β構(gòu)型。結(jié)合HMQC和HMBC譜解析，化合物的1H-WR和13C-WR得以歸屬(表1)。與化合 物A的1H-NMR和13C-NMR的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，化合物B具有與化合物A相同的苷元。綜合TOSCY 和HMQC譜解析，糖殘基的1H-NMR和13C-NMR得以歸屬(表1)。HMBC譜顯示δ 4. 86 (H_l ‘， Glucose)及 δ5. 0KH-1 “，Xylose)分別與 5 81.5(C-3)和 δ83. 4(C_16)遠(yuǎn)程相關(guān)，表明 葡萄糖和木糖分別連在苷元的C-3位與C-16位。綜上所述，該化合物的結(jié)構(gòu)推斷3-0- β -D-glucopyranosyl-16-0- β -D-xylopyra nosyl-2^ ,3 β ,16 α , 21 β -tetrahydroxyolean-12-en-28-oic acid，化合物 B 為一個(gè)新化 合物?；衔?-8，通過(guò)MS，IR, NMR與文獻(xiàn)報(bào)道比對(duì)，其結(jié)構(gòu)分別為桔梗皂苷D、遠(yuǎn)志皂
苷D2、桔梗皂苷D3、去芹菜糖桔梗皂苷D3、桔梗皂苷D2、去芹菜糖桔梗皂苷D2、去芹菜糖桔梗 皂苷E、桔梗皂苷E。表1化合物A和B的1H-和13C-WR數(shù)據(jù)
8 3、本發(fā)明桔?；钚圆课粚?duì)不同的癌細(xì)胞具有很好的抑制活性。4、桔梗皂苷的質(zhì)量控制方法之一，所述方法應(yīng)包括如下步驟(1)、色譜條件 色譜柱為 Zorbax SB-Phenyl (4. 6 X 150mm, 5 μ m)，柱溫為 20-350C ；流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫，乙腈變化梯度如下0 15min，10% 20% ； 15 30min, 20% 23%;30 45min，23% 23%;45 60min，23% 60%;60 65min，60% 100% ；流速為lmL/min。理論塔板數(shù)按桔梗皂苷D計(jì)算應(yīng)不低于6000。(2)、檢測(cè)器檢測(cè)器為蒸發(fā)光檢測(cè)器，霧化溫度為30_50°C，漂移管溫度為 40-120°C ；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)200-210nm。
(3)、供試品溶液制備取干燥桔梗藥材粉末，粉碎，過(guò)四十目篩，稱定適量藥材粉 末1. OOg,置三角瓶中，加入50倍量的50-70%甲醇，超聲提取半小時(shí)，過(guò)濾，反復(fù)3次，合并 三次濾液，減壓濃縮蒸干，殘留物用50%甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至IOml容量瓶中，加50%甲醇至 刻度，搖勻，微孔濾膜(0. 45 μ m)過(guò)濾后即得。(4)、精密吸取供試品溶液20μ 1，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。5、桔梗皂苷的質(zhì)量控制方法之二，所述方法應(yīng)包括如下步驟(1)、色譜柱為 Develosil RPAQUEOUS C30 (4. 6 X 250mm，5 μ m)柱，柱溫為 20_35°C， 流動(dòng)相為乙腈_水，梯度洗脫，乙腈變化梯度如下流動(dòng)相為乙腈_水，梯度洗脫，乙腈變化 梯度如下0 15min，5% 20%;15 25min，20% 25%;25 40min，25% 30%;40 60min，30% 40% ；60 65min，30% 100% ；流速為 lmL/min。(2)、檢測(cè)器及樣品的制備同方法4。6、桔梗皂苷的質(zhì)量控制方法之三，所述方法應(yīng)包括如下步驟(1)、色譜柱為 Zorbax XDB-C18 (4. 6 X 150mm, 5 μ m)柱，柱溫為 20_35°C，流動(dòng)相為 乙腈-水，梯度洗脫，乙腈變化梯度如下流動(dòng)相為乙腈-7K，梯度洗脫，乙腈變化梯度如下 0 15min，5% 20% ；15 30min，22% 26% ；30 40min，26% 22% ；40 60min， 22% 28% ；流速為 lmL/min。(2)、檢測(cè)器及樣品的制備同方法4。本發(fā)明經(jīng)分析方法驗(yàn)證，其精密度、重現(xiàn)性、回收率和穩(wěn)定性符合中國(guó)藥典2005 版一部附錄《中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》的要求。有益效果本發(fā)明采用高效液相色譜發(fā)測(cè)定桔梗中八種皂苷的含量，重現(xiàn)性好，能 夠全面的評(píng)價(jià)桔梗及其制品的質(zhì)量。


圖1 桔梗單體皂苷的制備流程圖2 化合物A的HR-ESI-MS譜3 化合物A的1H-WR譜；圖4 化合物A的13C-NMR譜；圖5 化合物A的HMBC譜；
圖6 化合物A的HMQC譜；圖7 化合物A的NOESY譜；圖8 化合物A的TOCSY譜；圖9 化合物A的IR圖譜；圖10 化合物B的HR-ESI-MS譜圖；圖11 化合物B的1H-WR譜；圖12 化合物B的13C-NMR譜；圖13 化合物B的HMBC譜；圖14 化合物B的HMQC譜；圖15 化合物B的TOCSY譜；圖16 混合對(duì)照品溶液色譜圖(峰序號(hào)1_去芹菜糖桔梗皂苷E ;2_桔梗皂苷E ；3-去芹菜糖桔梗皂苷D3 ；4-桔梗皂苷D3 ；5-去芹菜糖桔梗皂苷D2 ；6-桔梗皂苷D2 ；7-桔梗 皂苷D ;8_遠(yuǎn)志皂苷㈨；圖17 桔梗樣品色譜圖(ELSD)；圖18 桔梗樣品色譜圖(UV)。
具體實(shí)施例方式下面所實(shí)施例有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本 發(fā)明。實(shí)施例一桔?；钚圆课坏奶崛》蛛x取桔?？浦参锝酃?Platycodongrandiflorum(Jacq. ) A. DC)的根(4.0kg)為原 料，用5倍量95%乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，減壓回收溶劑，得浸膏900g，將浸膏用水 溶解后，置于分液漏斗中，用約5L乙酸乙酯萃取，取下層水層，減壓濃縮去除水溶液中少量 乙酸乙酯，將水溶液通過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂柱(3kg)，用去離子水洗脫至流出液無(wú)色，而后采用 95%乙醇洗脫。95%醇洗脫部分濃縮至干，即得桔?；钚圆课?213g)。實(shí)施例二 單體桔梗皂苷分離純化取實(shí)施例一中所得桔梗提取物213g，按附圖1所示進(jìn)行柱色譜層析分離，用氯 仿-甲醇不同比例(100 1-0 1)梯度洗脫，TLC檢測(cè)，將相同餾分合并，得八份餾分 Frl-FrS0 Fr7(氯仿-甲醇，2 1)濃縮至干，得浸膏(30g)，浸膏經(jīng)中壓柱色譜，采用氯 仿甲醇梯度洗脫，氯仿-甲醇(5 1)部分經(jīng)制備HPLC {檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，C30 (Develosil rpaqueous Packed Φ 20 X 100mm, Nomura Chemistry Ltd. , Japan)}得化合物 A (IOmg), B(7.5mg)，氯仿-甲醇(2 1)部分經(jīng)制備HPLC得化合物l(35mg)，2(21mg)，氯仿-甲 醇(1 1)部分，其中24-28流分經(jīng)制備HPLC得化合物3 (18mg)，4 (24mg)，5 (17. 8m)， 6 (IOlmg)。FrS (氯仿-甲醇，0 l，8g)溶于甲醇后，溶液中加入石油醚-丙酮(1 1)，白 色沉淀析出，過(guò)濾得沉淀，經(jīng)制備HPLC得化合物7 (43mg)，8 (40mg)?；衔?-8，通過(guò)MS，IR, NMR與文獻(xiàn)報(bào)道比對(duì)，其結(jié)構(gòu)分別為桔梗皂苷D、遠(yuǎn)志皂 苷D2、桔梗皂苷D3、去芹菜糖桔梗皂苷D3、桔梗皂苷D2、去芹菜糖桔梗皂苷D2、去芹菜糖桔梗 皂苷 E、桔梗皂苷 E?；衔?A 為 3-0-β -D-glucopyranosyl-16-Ο-β -D-glucopyranosyl -2 β ,3 β ,16 α ,21 β -tetrahydroxyolean-12-en-28-oic acid,C42H68O16,白 fe 無(wú)定形粉末，化合物A為新化合物；化合物B為3-0- β -D-glucopyranosyl-16-0- β -D-xyl opyranosyl-2 β,3β,16α,21β -tetra hydroxyolean-12-en-28-oic acid.,其分子式為 C41H66O15,白色無(wú)定形粉末，化合物B為新化合物。實(shí)施例三桔梗總皂苷抗腫瘤活性篩選取樣品液給小鼠體內(nèi)腹腔注射，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，連續(xù)給藥7天后，分別無(wú)菌取 脾，制備脾細(xì)胞懸液，作MTT法淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，記錄OD值。(1)、小鼠脾細(xì)胞懸液的制備將小鼠拉頸處死，用75%乙醇浸泡1-2分鐘，在超 凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌取脾，置盛有Hank’ s液的平皿中于鋼網(wǎng)上剪碎用針芯輕輕研磨，即成單細(xì)胞懸 液，離心10分鐘，棄上清液后洗兩次，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞沉淀用c-RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液 調(diào)至107/ml濃度。(2)、MTT法淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)試驗(yàn)新鮮分離的107/ml小鼠脾細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μ 1，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入刺激劑(ConA)IOOy 1/孔，每個(gè)樣 品設(shè)三個(gè)平行孔并設(shè)對(duì)照孔(僅加c-1640)，每孔總體積200ul，然后將培養(yǎng)板置于37°C的 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。取出培養(yǎng)板，每孔吸棄上清液100 μ 1，各孔加5mg/ml MTT 10ul，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，取出培養(yǎng)板，各孔加10% SDS裂解液100 μ 1，放培養(yǎng)箱中過(guò)夜，于 570nm處比色測(cè)定OD值。抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)率=(1-實(shí)孔測(cè)定值/對(duì)照孔測(cè)定值)X 100%結(jié)果表明桔?？傇碥諏?duì)不同的癌細(xì)胞具有很好的抑制活性。結(jié)果如下(表2)表2桔?？傇碥諏?duì)不同的癌細(xì)胞抑制活性 實(shí)施例四質(zhì)量控制方法的建立1、實(shí)驗(yàn)材料與方法(1)、儀器與試藥 液相色譜儀美國(guó)Waters公司高效液相色譜儀(WaterSTM600Delta四元泵； ffaters 600Controller 系統(tǒng)控制器；Waters 2996DAD 檢測(cè)器；Waters 2420ELSD 檢測(cè)器； Waters Empower色譜工作站)。其它儀器KQ_100E型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限 公司)；V3003旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海振捷)；分析天平(梅特勒，AB135-S)；超純水儀。試劑甲醇(分析純)北京化工廠；水為超純水；乙腈(色譜純)B&J ACS, SK Chemicals。對(duì)照品分別為桔梗皂苷D、桔梗皂苷E、去芹菜糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷D2、去芹菜 糖桔梗皂苷D2、桔梗皂苷D3、去芹菜糖桔梗皂苷D3、遠(yuǎn)志皂苷D2,以上對(duì)照品均從桔梗藥材中 分離得到，其結(jié)構(gòu)經(jīng)光譜確證；HPLC分析，面積歸一化法計(jì)算，各對(duì)照品純度在98%以上。(2)、色譜條件色譜柱為Zorbax SB-Phenyl (4. 6 X 150mm, 5 μ m)，柱溫為 25°C ；檢測(cè)器為 ELSD,霧 化溫度為30. 0°C，漂移管溫度為60. 0°C，載氣壓力為30psi，增益值設(shè)置為20 ；流動(dòng)相為乙 腈_水，梯度洗脫，乙腈變化梯度如下0 15min，10% 20% ； 15 30min，20% 23% ； 30 45min，23 % 23 % ；45 60min，23 % 60 % ;60 65min，60 % 100 % ；流速為 ImL/
min。(4)、對(duì)照品溶液的配制將各對(duì)照品放置在真空干燥器中，干燥24小時(shí)，分別精密稱定各對(duì)照品適量，定 容至IOml容量瓶中，配制成含各對(duì)照品各400 μ g/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)液。精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)液 25，50，150，250，500，750，1000，1500，1750, 2000 μ 1，分別置于 2ml 容量瓶中，加甲醇稀釋 至刻度。配制成十個(gè)不同濃度梯度的對(duì)照品溶液。
(5)、供試品溶液的制備取干燥桔梗藥材粉末，稱定適量(精確至0. Olg)，置三角瓶中，加入50倍量的 70 %甲醇，超聲提取半小時(shí)，過(guò)濾，反復(fù)3次，合并三次濾液，減壓濃縮蒸干，殘留物用50 % 甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至IOml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.45μπι)過(guò)濾后 即得。2、方法學(xué)考察(1)、線性關(guān)系各濃度對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣10μ 1，進(jìn)樣兩次，選取其中八個(gè)濃度，以其峰面積為 縱坐標(biāo)(y)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(χ)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性方程，相關(guān)系數(shù)R2及線性范圍 見(jiàn)表2 表2桔梗中單體皂苷線性方程 (2)、精密度取同一濃度供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣六次，測(cè)定各化合物峰面積，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏 差，測(cè)定其日內(nèi)精密度；將供試品溶液放置于4°C冰箱中冷藏保存，分別在第1，2，3，4，5，6 天進(jìn)樣，測(cè)定其日間精密度，結(jié)果見(jiàn)表3 表3精密度測(cè)定結(jié)果(η = 6) (3)、重復(fù)性稱取同一藥材粉末六份各1. 00g，按供試品溶液制備方法，平行制備六份。精密吸取上述供試品溶液20 μ 1，進(jìn)樣，計(jì)算各待測(cè)成分在藥材中的平均含量 (μ g/g)及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表4 表4重復(fù)性測(cè)定結(jié)果(η = 6)
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(4)、回收率
精密稱定三份已知含量的藥材粉末0. 50g，分別放入錐形瓶中，分別按高、中、低比 例將各單體對(duì)照品溶液加入錐形瓶中，樣品中單體皂苷含量、各待測(cè)組分加入的量、供試品 中測(cè)定的結(jié)果(檢測(cè)量)、回收率(％)及RSD值(％)見(jiàn)表5:
表5回收率測(cè)定結(jié)果 3、樣品含量測(cè)定取干燥桔梗藥材粉末，稱定適量(精確至0. Olg)，置三角瓶中，加入50倍量的 70 %甲醇，超聲提取半小時(shí)，過(guò)濾，反復(fù)三次，合并三次濾液，減壓濃縮蒸干，殘留物用50 % 甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至IOml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.45μπι)過(guò)濾后 即得。精密量取20 μ 1供試品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。實(shí)施例五質(zhì)量控制方法的建立采用紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm，色譜條件，樣品溶液制備，測(cè)定方法同實(shí)施例四，樣品紫外色譜圖見(jiàn)附圖18。實(shí)施例六質(zhì)量控制方法的建立采用Develosil RPAQUEOUS C30 (4. 6 X 250mm，5 μ m)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水， 梯度洗脫，乙腈變化梯度如下0 15min，5% 20% ；15 25min，20 % 25 % ；25 40min，25% 30%;40 60min，30% 40%;60 65min，30% 100%;流速為 lmL/min。 樣品測(cè)定方法同實(shí)施例四。實(shí)施例七質(zhì)量控制方法的建立采用Zorbax XDB-C18 (4. 6 X 250mm, 5 μ m)色譜柱，動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫，乙 腈變化梯度如下0 15min，5% 20% ； 15 30min，22% 26% ；30 40min，26% 22% ；40 60min,22%~ 28% ；流速為lmL/min。樣品測(cè)定方法同實(shí)施例四。
權(quán)利要求
一種具有抗腫瘤活性的桔梗活性部位的制備方法，其特征在于該方法和步驟如下取干燥的中藥桔梗藥材，粉碎，加入0 95％乙醇或甲醇回流或超聲提取三次，過(guò)濾，合并三次濾液，減壓濃縮回收溶劑，用去離子水稀釋溶解，乙酸乙酯萃取，水層減壓濃縮除去殘留乙酸乙酯，將所得濃縮液用去離子水稀釋，經(jīng)大孔樹(shù)脂，依次用水，50％ 95％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液濃縮即得。
2.一種從權(quán)利要求1所述的活性部位中分離得到的兩個(gè)新皂苷，其結(jié)構(gòu)式及特征如下 化合物 A 為 3-0- β -D-glucopyranosyl-16-0- β -D-glucopyranosyl-2 β，3 β，16 α，2 1 β -tetrahydroxyolean-12-en-28-oic acid,其分子式為 C42H68O16,白色無(wú)定形粉末，化合 物 A 為新化合物；化合物 B 為 3-0- β -D-glucopyranosyl-16-0- β -D-xylopyranosyl-2 β， 3 β ，16 α ，21 β -tetrahydroxyolean-12-en-28-oic acid. ，C41H66O15, Sfe^c^ 形粉末，化合物B為新化合物。
3.權(quán)力要求1所述的桔?；钚圆课?，其特征在其應(yīng)含有桔梗皂苷D、去芹菜糖桔梗皂苷 E、桔梗皂苷E、遠(yuǎn)志皂苷D2、桔梗皂苷D3、去芹菜糖桔梗皂苷D3、桔梗皂苷D2、去芹菜糖桔梗 皂苷D2。
4.權(quán)利要求2所述的兩個(gè)新的單體皂苷制備方法，包括以下步驟干燥桔梗藥材粉末，用0-95 %乙醇回流提取，提取液減壓濃縮，回收溶劑得浸膏，用去 離子水溶解，乙酸乙酯萃取，水層經(jīng)AB-8或D-101大孔樹(shù)脂，依次用去離子水，50-95%乙醇 洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮得浸膏，浸膏經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜層析，中壓柱層析，最后經(jīng) 制備高效液相純化，得新化合物A和B。
5.權(quán)利要求1所述的桔?；钚圆课辉谥苽淠[瘤治療藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的桔?；钚圆课辉谥苽漭o助治療腫瘤的保健品中的應(yīng)用。
7.一種桔梗、桔梗提取物及活性部位的質(zhì)量控制檢測(cè)方法，其特征在于采用高效液相 測(cè)定桔梗中桔梗皂苷D、去芹菜糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、遠(yuǎn)志皂苷D2、桔梗皂苷D3、去芹菜 糖桔梗皂苷D3、桔梗皂苷D2、去芹菜糖桔梗皂苷D2的含量的方法。
8.權(quán)利要求7所述的質(zhì)量控制檢測(cè)方法，其特征在于采用蒸發(fā)光檢測(cè)器或紫外檢測(cè)器為檢測(cè)器。
9.權(quán)利要求7所述的質(zhì)量控制檢測(cè)方法，其特征在于以桔梗皂苷D、去芹菜糖桔梗皂苷 E、桔梗皂苷E、遠(yuǎn)志皂苷D2、桔梗皂苷D3、去芹菜糖桔梗皂苷D3、桔梗皂苷D2、去芹菜糖桔梗 皂苷D2為檢測(cè)對(duì)象。
10.權(quán)利要求7所述的桔梗皂苷的質(zhì)量控制檢驗(yàn)方法之一，其特征在于由以下步驟組成(1)、色譜條件色譜柱為 Zorbax SB-Phenyl (4. 6 X 150mm，5 μ m)，柱溫為 20-35 °C ； 流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫，乙腈變化梯度如下0 15min，10% 20% ； 15 30min， 20% 23%;30 45min，23% 23%;45 60min，23% 60%;60 65min，60% 100%; 流速為lmL/min。理論塔板數(shù)按桔梗皂苷D計(jì)算應(yīng)不低于6000。(2)、檢測(cè)器檢測(cè)器為蒸發(fā)光檢測(cè)器，霧化溫度為30-50°C，漂移管溫度為40-120°C； 紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)200-210nm。(3)、供試品溶液制備取干燥桔梗藥材粉末，粉碎，過(guò)四十目篩，稱定適量藥材粉末 1. 00g，置三角瓶中，加入50倍量的50-70%甲醇，超聲提取半小時(shí)，過(guò)濾，反復(fù)3次，合并三 次濾液，減壓濃縮蒸干，殘留物用50%甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至IOml容量瓶中，加50%甲醇至刻 度，搖勻，微孔濾膜(0. 45 μ m)過(guò)濾后即得。(4)、測(cè)定精密吸取供試品溶液20μ1，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
11.權(quán)利要求7所述的桔梗皂苷的質(zhì)量控制檢驗(yàn)方法之二，其特征在于由以下步驟組成(1)、色譜柱為Develosil RPAQUEOUS C30 (4. 6 X 250mm，5 μ m)柱，柱溫為 20-35°C，流 動(dòng)相為乙腈_水，梯度洗脫，乙腈變化梯度如下流動(dòng)相為乙腈_水，梯度洗脫，乙腈變化梯 度如下0 15min，5% 20% ；15 25min，20% 25% ；25 40min，25% 30% ；40 60min，30% 40% ；60 65min，30% 100% ；流速為 lmL/min。(2)、檢測(cè)器檢測(cè)器為蒸發(fā)光檢測(cè)器，霧化溫度為30-50°C，漂移管溫度為40-120°C； 紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)200-210nm。(3)、供試品溶液制備取干燥桔梗藥材粉末，粉碎，過(guò)四十目篩，稱定適量藥材粉末 1. 00g，置三角瓶中，加入50倍量的50-70%甲醇，超聲提取半小時(shí)，過(guò)濾，反復(fù)3次，合并三 次濾液，減壓濃縮蒸干，殘留物用50%甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至IOml容量瓶中，加50%甲醇至刻 度，搖勻，微孔濾膜(0. 45 μ m)過(guò)濾后即得。(4)、測(cè)定精密吸取供試品溶液20μ1，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
12.權(quán)利要求7所述的桔梗皂苷的質(zhì)量控制檢驗(yàn)方法之三，其特征在于由以下步驟組成(1)、色譜柱為Zorbax XDB-C18 (4. 6 X 150mm, 5 μ m)柱，柱溫為 20-35 °C，流動(dòng)相為乙 腈-7K，梯度洗脫，乙腈變化梯度如下流動(dòng)相為乙腈_水，梯度洗脫，乙腈變化梯度如下 0 15min，5% 20% ；15 30min，22% 26% ；30 40min，26% 22% ；40 60min， 22% 28% ；流速為 lmL/min。(2)、檢測(cè)器檢測(cè)器為蒸發(fā)光檢測(cè)器，霧化溫度為30-50°C，漂移管溫度為40-120°C； 紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)200-210nm。(3)、供試品溶液制備取干燥桔梗藥材粉末，粉碎，過(guò)四十目篩，稱定適量藥材粉末( 1. 00g，置三角瓶中，加入50倍量的50-70%甲醇，超聲提取半小時(shí)，過(guò)濾，反復(fù)3次，合并三 次濾液，減壓濃縮蒸干，殘留物用50%甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至IOml容量瓶中，加50%甲醇至刻 度，搖勻，微孔濾膜(0. 45 μ m)過(guò)濾后即得。(4)、測(cè)定精密吸取供試品溶液20μ 1，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
全文摘要
本發(fā)明提供了桔梗活性部位的一種制備方法和新用途，具體提供其在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明同時(shí)涉及通過(guò)植物化學(xué)分離手段從桔?；钚圆课恢蟹蛛x出兩個(gè)新三萜皂苷類化合物(化合物A和B)及其制備方法；本發(fā)明還提供了以桔梗皂苷D、遠(yuǎn)志皂苷D2、桔梗皂苷D3、去芹菜糖桔梗皂苷D3、桔梗皂苷D2、去芹菜糖桔梗皂苷D2、去芹菜糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E對(duì)桔梗質(zhì)量控制的檢測(cè)方法，該方法重現(xiàn)性好，能較全面的評(píng)價(jià)桔梗、桔梗提取物及其活性部位的質(zhì)量。
文檔編號(hào)C07J63/00GK101904890SQ200910143698
公開(kāi)日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2009年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月2日
發(fā)明者許旭東, 郭文杰, 魏建和 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所