專利名稱：一種水蛭素的雙水相-反膠束提取法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥制劑技術(shù)領(lǐng)域，涉及
材料的水蛭素提取技術(shù)。
種水蛭素的提取技術(shù)，特別是以菲牛蛭為原
背景技術(shù)：
調(diào)查數(shù)據(jù)表明，當(dāng)今危害人類健康的主要疾病是心腦血管疾病。心腦血管疾病發(fā) 生的主要原因是體內(nèi)形成的血栓，而凝血酶是導(dǎo)致血栓形成的主要因素。水蛭素能與凝血 酶特異性結(jié)合使之喪失凝血活力。臨床試驗表明，水蛭蛭素既能使血栓融化從而消除或緩 解病情，也能防止血栓形成，具有極好的預(yù)防和治療血栓性心腦血管疾病的效果?，F(xiàn)存的水 蛭素類藥物劑型主要為注射劑和口服片劑。目前，水蛭素主要以菲牛蛭、歐洲醫(yī)用水蛭、印 度水蛭、亞馬遜巨型水蛭等為原材料提取。 目前，國內(nèi)外提取水蛭素的方法有多種。例如1970年Markwardt采用的乙醇分 級沉淀、陽離子交換、凝膠過濾以及陰離子交換等步驟獲得水蛭素。中國專利〈申請?zhí)?>92107076〈發(fā)明名稱 > 醫(yī)用天然水蛭素的提取方法，是將水蛭搗碎成漿狀，加熱，用冰醋酸 調(diào)pH值，冷卻至室溫，用Na2C03溶液調(diào)pH值，離心收集濾液，沉淀用生理鹽水浸提2 3次， 離心收集液濾。合并全部液濾，透析，透析液用95%以上的乙醇沉淀，靜置，收集沉淀，低溫 干燥得到水蛭素。水蛭素可以用于生產(chǎn)口服片劑或口服液。這些工藝的不足之處是提取步 驟多，過程復(fù)雜，周期長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種水蛭素的雙水相_反膠束提取法，以菲牛蛭為原材料， 克服上述工藝的不足之處是提取步驟多，過程復(fù)雜，周期長的不足之處。 本發(fā)明包括原材料處理、水蛭素粗產(chǎn)品提取及水蛭素粗產(chǎn)品純化步驟，將原材料 處理后，加入生理鹽水?dāng)嚢瑁x心得水相和沉淀；取水相備用，沉淀用組織搗碎機(jī)搗成漿 狀，加生理鹽水?dāng)嚢?，離心得水相和沉淀；取水相備用，沉淀再用組織搗碎機(jī)搗成漿狀后， 用生理鹽水重復(fù)處理一次；離心，去沉淀取水相；合并3次的水相，加入硫酸鈉使?jié)舛葹?0. 05mol L—、加入聚乙二醇6000使質(zhì)量濃度為30 % ，攪拌，離心分離，取上相水溶液，加 入無水乙醇攪拌均勻，冷藏過夜，離心取沉淀稱重后溶解于生理鹽水中，用鹽酸溶液調(diào)至 pHl. 8 2. 0得酸性水蛭素提取液。另取正辛烷加入丁二酸_2-乙基己基酯磺酸鈉使?jié)舛?達(dá)到0. 05 0. 07mol L—、攪拌，得反膠束提取液。加入相當(dāng)于其體積二分之一的上述酸 性水蛭素提取液，攪拌，離心分離，取上相加入1. 5 2倍體積pH9. 3 9. 5的生理鹽水，攪 拌，離心取下相，加無水乙醇攪拌均勻，冷藏過夜，離心取沉淀得水蛭素。
所述的原材料處理是，將菲牛蛭鮮活個體放入80 90°C的熱水中2 3分鐘， 迅速撈出，放冷至室溫，瀝至半干；或?qū)⒂赺181:保存的菲牛蛭個體取出，放至室溫，瀝至半 干。將瀝至半干的菲牛蛭個體于組織搗碎機(jī)中以10000 12000r/min處理5 6分鐘使 之成漿狀。
所述的水蛭素粗產(chǎn)品提取是，將預(yù)處理過的漿狀原材料加入2 2. 5倍重量的生 理鹽水?dāng)嚢?. 5 3小時，離心取水相，沉淀用組織搗碎機(jī)10000 12000r/min處理2 3 分鐘搗成漿狀，按漿狀原材料的量加入1. 5 2倍生理鹽水，240 300r/min攪拌2 2. 5 小時，離心取水相，沉淀再用組織搗碎機(jī)10000 12000r/min處理2 3min搗成漿狀，按 漿狀原材料的量加入1 1. 5倍生理鹽水?dāng)嚢? 2. 5小時，離心去沉淀，取水相，合并3 次的水相，此即為水蛭素粗產(chǎn)品水溶液。 所述的水蛭素純化是在水蛭素粗產(chǎn)品水溶液中加入硫酸鈉使?jié)舛葹?0. 05mol L—、加入聚乙二醇6000使質(zhì)量濃度為30%，240 300r/min攪拌30分鐘，離心 分離形成上、下相，取上相水溶液，加入2. 8 3倍無水乙醇攪拌均勻，冷藏過夜，離心。取沉 淀稱重，溶解于4倍重量的生理鹽水中，用0. 05mol *L—1的HC1溶液調(diào)至pHl. 8，得酸性水蛭 素溶液。另取正辛烷加入丁二酸-2-乙基己基酯磺酸鈉使?jié)舛冗_(dá)到0. 05 0. 07mol L—、 攪拌，得反膠束提取液。加入相當(dāng)于其體積二分之一的酸性水蛭素溶液，攪拌，離心分離，取 上相加入1. 5 2倍體積pH9. 3 9. 5的生理鹽水，攪拌，離心取下相，加無水乙醇攪拌均 勻，冷藏過夜，離心取沉淀得水蛭素。 關(guān)鍵試劑優(yōu)選的使用濃度為丁二酸-2-乙基己基酯磺酸鈉濃度0. 06mol *L—、生 理鹽水pH9. 4。 與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的突出的優(yōu)點和顯著的進(jìn)步是于沒有層析的操作步 驟，所以提取過程簡單，生產(chǎn)周期縮短，提取液體積小，乙醇的使用量明顯減少，水蛭素的收率高。
具體實施方式

實施例l: 1)將菲牛蛭鮮活個體放入80 9(TC的熱水中2 3分鐘，迅速撈出，放冷至室溫，
瀝至半干；或?qū)⒂赺181:保存的菲牛蛭個體取出，放至室溫，瀝至半干。 2)取一定量將瀝至半干的菲牛蛭個體于組織搗碎機(jī)中以10000 12000r/min處
理5 6分鐘搗成漿狀。 3)取一定量漿狀物按重量加入2 2. 5倍的生理鹽水240 300r/min攪拌2. 5 3小時。 4) 4000 4500r/min離心10分鐘取水相，備用，沉淀用組織搗碎機(jī)10000 12000r/min處理2 3分鐘搗成槳狀。 5)按步驟3)槳狀物的重量加入1. 5 2倍生理鹽水240 300r/min攪拌2 2. 5小時。 6) 4000 4500r/min離心10分鐘取水相，備用，沉淀用組織搗碎機(jī)10000 12000r/min處理2 3分鐘搗成槳狀。 7)按步驟3)槳狀物的重量加入1 1. 5倍生理鹽水240 300r/min攪拌2 2. 5小時，4000 4500r/min離心10分鐘去沉淀，取水相備用。 8)合并3次的水相，加入硫酸鈉使?jié)舛葹?. 05mol L—、加聚乙二醇6000使質(zhì)量
濃度為30% ，240 300r/min攪拌30分鐘。9)4000 4500r/min離心20分鐘，分離上、下相。
10)取上相水溶液加入2. 8 3倍無水乙醇攪拌均勻，冷藏過夜，4000 4500r/ min離心IO分鐘取沉淀。 11)沉淀溶解于4倍重量的生理鹽水中，用0. 05mol L—1的HC1溶液調(diào)至pHl. 8， 得酸性水蛭素溶液。 12)正辛烷加入丁二酸_2-乙基己基酯磺酸鈉使?jié)舛冗_(dá)到0. 06mol L—、240 300r/min攪拌30分鐘，得反膠束提取液。 13)酸性水蛭素溶液加入2倍體積反膠束提取液，240 300r/min攪拌30分鐘。
14)4000 4500r/min離心30分鐘，取上相。 15)上相溶液加入1. 5 2倍體積pH9. 4的生理鹽水，240 300r/min攪拌30分鐘。 16) 4000 4500r/min離心30分鐘取下相，加2. 8 3倍無水乙醇混合均勻，冷藏 過夜。 17) 4000 4500r/min離心30分鐘取沉淀得水蛭素。
實施例2 : 根據(jù)實施例l，加入丁二酸_2-乙基己基酯磺酸鈉使?jié)舛冗_(dá)到0. 05mol L—、上相 溶液加入1. 5 2倍體積pH9. 5的生理鹽水，其余同實施例1。
實施例3: 根據(jù)實施例l，加入丁二酸_2-乙基己基酯磺酸鈉使?jié)舛冗_(dá)到0. 07mol L—、上相 溶液加入1. 5 2倍體積pH9. 3的生理鹽水，其余同實施例1。
權(quán)利要求
一種水蛭素的雙水相-反膠束提取法，其特征在于包括原材料處理、水蛭素粗產(chǎn)品提取及水蛭素粗產(chǎn)品純化步驟，將原材料處理后，加入生理鹽水?dāng)嚢?，離心得水相和沉淀；取水相備用，沉淀用組織搗碎機(jī)搗成漿狀，加生理鹽水?dāng)嚢?，離心得水相和沉淀；取水相備用，沉淀再用組織搗碎機(jī)搗成漿狀后，用生理鹽水重復(fù)處理一次；離心，去沉淀取水相；合并3次的水相，加入硫酸鈉使?jié)舛葹?.05mol·L-1，加入聚乙二醇6000使質(zhì)量濃度為30％，攪拌，離心分離，取上相水溶液，加入無水乙醇攪拌均勻，冷藏過夜，離心取沉淀稱重后溶解于生理鹽水中，用鹽酸溶液調(diào)至pH1.8～2.0得酸性水蛭素提取液。另取正辛烷加入丁二酸-2-乙基己基酯磺酸鈉使?jié)舛冗_(dá)到0.05～0.07mol·L-1，攪拌，得反膠束提取液。加入相當(dāng)于其體積二分之一的上述酸性水蛭素提取液，攪拌，離心分離，取上相加入1.5～2倍體積pH9.3～9.5的生理鹽水，攪拌，離心取下相，加無水乙醇攪拌均勻，冷藏過夜，離心取沉淀得水蛭素。
2. 據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水蛭素的雙水相_反膠束提取法，其特征在于所述的原材料處理是將菲牛蛭鮮活個體放入80 90°C的熱水中2 3分鐘，迅速撈出，放冷至室溫，瀝至半干；或?qū)⒂?18t:保存的菲牛蛭個體取出，放至室溫，瀝至半干。將瀝至半干的菲牛蛭個體于組織搗碎機(jī)中以10000 12000r/min處理5 6分鐘使之成漿狀。
3. 據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水蛭素的雙水相_反膠束提取法，其特征在于所述的水蛭素粗產(chǎn)品提取是將預(yù)處理過的漿狀原材料加入2 2. 5倍重量的生理鹽水?dāng)嚢?. 5 3小時，離心取水相，沉淀用組織搗碎機(jī)10000 12000r/min處理2 3分鐘搗成漿狀，按漿狀原材料的量加入1. 5 2倍生理鹽水，240 300r/min攪拌2 2. 5小時，離心取水相，沉淀再用組織搗碎機(jī)10000 12000r/min處理2 3min搗成漿狀，按漿狀原材料的量加入1 1. 5倍生理鹽水?dāng)嚢? 2. 5小時，離心去沉淀，取水相，合并3次的水相，此即為水蛭素粗產(chǎn)品水溶液。
4. 據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水蛭素的雙水相_反膠束提取法，其特征在于所述的水蛭素純化是在水蛭素粗產(chǎn)品水溶液中加入硫酸鈉使?jié)舛葹?. 05mol L—、加入聚乙二醇6000使質(zhì)量濃度為30 % ， 240 300r/min攪拌30分鐘，離心分離形成上、下相，取上相水溶液，加入2. 8 3倍無水乙醇攪拌均勻，冷藏過夜，離心；取沉淀稱重，溶解于4倍重量的生理鹽水中，用0. 05mol L—1的HC1溶液調(diào)至pHl. 8，得酸性水蛭素溶液；另取正辛烷加入丁二酸-2-乙基己基酯磺酸鈉使?jié)舛冗_(dá)到0. 05 0. 07mol L—、攪拌，得反膠束提取液。加入相當(dāng)于其體積二分之一的酸性水蛭素溶液，攪拌，離心分離，取上相加入1. 5 2倍體積pH9. 3 9. 5的生理鹽水，攪拌，離心取下相，加無水乙醇攪拌均勻，冷藏過夜，離心取沉淀得水蛭素。
5. 據(jù)權(quán)利要求4所述的一種水蛭素的雙水相-反膠束提取法，其特征在于關(guān)鍵試劑優(yōu)選的使用濃度為丁二酸_2-乙基己基酯磺酸鈉濃度0. 06mol L—、生理鹽水pH9. 4。
全文摘要
一種水蛭素的雙水相-反膠束提取法，將原材料處理后，加生理鹽水?dāng)嚢瑁x心得水相和沉淀。取水相備用，沉淀搗成漿狀，加生理鹽水?dāng)嚢?，離心得水相和沉淀。取水相備用，沉淀搗成漿狀，用生理鹽水重復(fù)處理一次。離心，去沉淀取水相。合并3次的水相，加硫酸鈉和聚乙二醇，攪拌，離心分離，取上相水溶液，加無水乙醇攪拌均勻，冷藏過夜，離心取沉淀稱重后溶解于生理鹽水中，用鹽酸調(diào)酸性水蛭素溶液。另取正辛烷加丁二酸-2-乙基己基酯磺酸鈉，攪拌，得反膠束提取液。加酸性水蛭素溶液，攪拌，離心分離，取上相加生理鹽水，攪拌，離心取下相，加無水乙醇攪拌均勻，冷藏過夜，離心取沉淀得水蛭素。本發(fā)明生產(chǎn)周期短，水蛭素提取率高，乙醇使用量少。
文檔編號C07K14/81GK101759802SQ200910194320
公開日2010年6月30日 申請日期2009年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月27日
發(fā)明者宋文東, 方富永, 王宏波, 苗艷麗 申請人:廣東海洋大學(xué)