專利名稱：用電刺激活體水蛭提取水蛭素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用電刺激活體水蛭提取水蛭素的方法，通過弱電刺激活體水蛭， 使水蛭腺體釋放腺液，同時(shí)確保水蛭保持活體狀態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)多次從活體水蛭的腺液中獲 得高純度水蛭素的方法。
背景技術(shù)：
水蛭素(hirudin)因最早從水蛭中分離得到而得名。天然水蛭素由65個(gè)氨基酸殘 基組成，分子量7000道爾頓。水蛭素能同凝血酶的催化中心及纖維蛋白原結(jié)合中心發(fā)生不 可逆的結(jié)合，使凝血酶失活，為目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)有力的凝血酶抑制劑。此外還有很強(qiáng)的抗血 栓作用，對(duì)多種實(shí)驗(yàn)性血栓模型有阻抑作用。水蛭素對(duì)于各種血栓疾病如靜脈血栓、彌散性 血管內(nèi)凝血、腦凝血、血栓靜脈炎及冠狀動(dòng)脈血栓都有預(yù)防和治療效果，尤其是靜脈血栓和 彌漫性血管內(nèi)凝血的治療；也可用于外科手術(shù)后預(yù)防動(dòng)脈血栓的形成，預(yù)防溶解血栓后或 血管成形術(shù)后再栓塞；改善體外血液循環(huán)和血液透析過程，在顯微外科手術(shù)中常因?yàn)槲呛?處血管栓塞而導(dǎo)致失敗，采用水蛭素可促進(jìn)傷口愈合。工業(yè)化生產(chǎn)水蛭素的方法多以對(duì)水 蛭活體的破壞方法獲得水蛭素，影響所得水蛭素的純度，同時(shí)對(duì)水蛭資源的供應(yīng)依賴過大， 尤其難以避免水蛭素生產(chǎn)的季節(jié)性問題。利用電流對(duì)生物體腺體的刺激影響作用，直接使 用直流弱電刺激活體水蛭批量提取高純度水蛭素的方式并保持水蛭的活體性狀的方法以 期簡化水蛭素的生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品純度，保持野生水蛭資源的重復(fù)利用，降低生產(chǎn)成本， 克服生產(chǎn)的季節(jié)性障礙問題的方法，至今尚未有成功實(shí)現(xiàn)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用電刺激活體水蛭提取水蛭素的方法，它能夠簡化水蛭 素的生產(chǎn)工藝，同時(shí)保持水蛭的活體，多次提取高純度水蛭素。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的在室溫下，先將活體水蛭從飼養(yǎng)槽中提取至貯藏槽，用去離 子水漂洗除其表面雜質(zhì)，濾出水分，再浸入生理鹽水漂洗，添加電解質(zhì)液層覆蓋，通入直流 電進(jìn)行刺激，同時(shí)確保合適的電流強(qiáng)度，避免水蛭死亡，收集水蛭分泌的液體，后將活體水 蛭從濾槽中放回飼養(yǎng)槽。用電刺激活體水蛭提取水蛭素的方法，具體步驟如下1、采用弱電或直流電刺激活體水蛭，獲得在電流刺激下水蛭產(chǎn)生的分泌物，2、將分泌物經(jīng)過800 μ m納濾膜后續(xù)處理30 180分鐘，除去80 90%的水份， 添加8 15%醫(yī)用淀粉賦形，減壓至0.9大氣壓下，在進(jìn)口溫度為230 180°C，出口溫度 90 75°C下進(jìn)行噴霧干燥，獲得含800AT-U/g的高活性抗凝血酶活性水蛭素干粉。還可以通過超濾膜除水后，加入0. 05%海藻糖、0. 02%乙酰半膀氨酸和0. 05%枸 杞酸鈉配制成的穩(wěn)定劑，制得含1000AT-U/g抗凝血酶液態(tài)水蛭素。放回飼養(yǎng)槽的水蛭在M小時(shí)后可以用上述同樣的方法重復(fù)提取水蛭素。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)與進(jìn)步之處在于
1、利用合適大小的直流弱電刺激生物活體導(dǎo)致腺體產(chǎn)生分泌的特點(diǎn)，連續(xù)刺激活 體水蛭唾液腺分泌唾液，獲得高純度水蛭素；2、弱電刺激后的水蛭活體保持活性，可以在隔段時(shí)間后繼續(xù)進(jìn)行水蛭素的提??；3、純的水蛭唾液可以得到較高純度的水蛭素；4、使用超濾膜除水提高有效成分濃度；5、合適的賦形淀粉添加量和合適的溫度設(shè)定噴霧干燥技術(shù)制粉；6、海藻糖、乙酰半膀氨酸、枸杞酸鈉的組合為保護(hù)劑，保護(hù)水蛭素混合液中抗凝血 酶的生理活性的穩(wěn)定性不發(fā)生變化。用上述方法獲得的產(chǎn)品經(jīng)檢測，產(chǎn)品中水蛭素中抗凝血酶的活性含量達(dá)到 800 (干粉)或 1000 (液體)AT-U/g。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1在20 30°C室溫下，先將活體水蛭從飼養(yǎng)槽中取至貯藏槽，用去離子水漂洗2分 鐘，除去活體水蛭表面的雜質(zhì)，濾出水分，再浸入生理鹽水漂洗20秒，使水蛭表面覆蓋電解 質(zhì)，濾除鹽水，平鋪放入到200目長方形不銹鋼濾槽內(nèi)，濾槽與地面絕緣，濾網(wǎng)下為同面積 已消毒潔凈器皿，濾槽兩端分別連接直流電的兩極，先調(diào)整至最小的輸出電流，然后打上電 源開關(guān)，調(diào)整電流為1 6mA，40分鐘后，斷開電源，收取器皿中濾槽滴出的液體，后將水蛭 從濾槽中放回貯藏槽，再放回飼養(yǎng)槽。器皿中濾槽滴出的液體大部分為水蛭素有效成分，經(jīng)過800 μ m納濾膜后續(xù)處理 30分鐘可以除90%水，然后添加15%的醫(yī)用淀粉，設(shè)定噴霧干燥進(jìn)口 210°C，出口溫90°C， 獲得含800AT-U/g的高活性抗凝血酶活性水蛭素干粉。實(shí)施例2在20 30°C室溫下，先將活體水蛭從飼養(yǎng)槽中取至貯藏槽，用去離子水漂洗2分 鐘出去活體水蛭表面的雜質(zhì)，濾出水分，再浸入生理鹽水漂洗20秒，使水蛭表面覆蓋電解 質(zhì)，濾除鹽水，平鋪放入底部為200目濾網(wǎng)的長方形不銹鋼濾槽內(nèi)，濾槽與地面絕緣，濾網(wǎng) 下為同面積已消毒潔凈器皿，濾槽兩端分別連接直流電的兩極，先調(diào)整至最小的輸出電流， 打上電源開關(guān)，調(diào)整電流為5 12mA，進(jìn)行電刺激20分鐘后，斷開電源，收取器皿中濾槽滴 出的液體，然后將水蛭從濾槽中放回貯藏槽，再放回飼養(yǎng)槽。器皿中濾槽滴出的液體大部分為水蛭素有效成分，經(jīng)過800 μ m納濾膜后續(xù)處理 30分鐘，除去90%的水，添加15%的醫(yī)用淀粉，減壓至0. 9大氣壓下進(jìn)行噴霧干燥，150°C下 獲得含800AT-U/g的高活性抗凝血酶活性水蛭素干粉。實(shí)施例3在20 30°C室溫，先將活體水蛭從飼養(yǎng)槽中取至貯藏槽，用去離子水漂洗2分鐘 出去活體水蛭表面的雜質(zhì)，濾出水分，再浸入生理鹽水漂洗20秒，使水蛭表面覆蓋電解質(zhì)， 濾除鹽水，平鋪放入底部為200目濾網(wǎng)的長方形不銹鋼濾槽內(nèi)，濾槽與地面絕緣，濾網(wǎng)下為 同面積已消毒潔凈器皿，濾槽兩端分別連接直流電的兩極，先調(diào)整至最小的輸出電流，打上 電源開關(guān)，調(diào)整電流為12 20mA，進(jìn)行電刺激10分鐘后，斷開電源，收取器皿中濾槽滴出的 液體，后將水蛭從濾槽中放回貯藏槽，再放回飼養(yǎng)槽。
器皿中濾槽滴出的液體大部分為水蛭素有效成分，經(jīng)過800 μ m納濾膜后續(xù)處理 30分鐘，除去90%水，加入0. 05%海藻糖、0. 02%乙酰半膀氨酸和0. 05%枸杞酸鈉配成的 穩(wěn)定劑，制得500 1000AT-U/g抗凝血酶液態(tài)水蛭素。實(shí)施例4在20 30°C室溫，先將活體水蛭從飼養(yǎng)槽中取至貯藏槽，用去離子水漂洗2分鐘 出去活體水蛭表面的雜質(zhì)，濾出水分，再浸入生理鹽水漂洗20秒，放入不銹鋼網(wǎng)的吊籃內(nèi)， 浸入裝有0.5 濃度的鹽水槽中，鹽水槽內(nèi)通入直流電，使得槽中鹽水處于帶電狀態(tài)， 先調(diào)整至最小的輸出電流，打上電源開關(guān)，調(diào)整電流為3 12mA，進(jìn)行電刺激5 20分鐘 后，移出，然后將水蛭從銹鋼網(wǎng)的吊籃內(nèi)倒回貯藏槽，再倒回飼養(yǎng)槽，同時(shí)重復(fù)將新裝活體 水蛭的另一個(gè)不銹鋼網(wǎng)的吊籃浸入鹽水槽中，實(shí)現(xiàn)活體水蛭提取水蛭素的連續(xù)生產(chǎn)。鹽水槽中滴出的液體大部分為水蛭素有效成分和鹽水溶液混合物，經(jīng)過800 μ m 納濾膜后續(xù)處理30分鐘，除去90%水，添加0. 05%海藻糖、0. 02%乙酰半膀氨酸、0. 05%枸 杞酸鈉配成的穩(wěn)定劑，制得含1000AT-U/g抗凝血酶活性水蛭素含水混合物。可直接常溫貯 藏，也可以通過噴霧干燥得到水蛭素干粉。實(shí)施例5在20 30°C室溫，先將活體水蛭從飼養(yǎng)槽中取至貯藏槽，用去離子水漂洗2分鐘 出去活體水蛭表面的雜質(zhì)，濾出水分，置入50 200升塑料桶中，再倒入0. 5 濃。C的 鹽水，鹽水的量為水蛭量的體積與鹽水體積比為1 0.5 1.5，塑料桶內(nèi)底部放置金屬電 極，塑料桶頂端的液面放置金屬電極，分別連接直流電的兩極，先調(diào)整至最小的輸出電流， 打上電源開關(guān)，緩慢調(diào)整電流為6 12mA，進(jìn)行電刺激20分鐘后，斷開電源，將水蛭從塑料 桶中倒回貯藏槽，后再倒回飼養(yǎng)槽。收集塑料桶中的液體，這部分液體大部分為水蛭素有效 成分和鹽水溶液混合物，經(jīng)過800 μ m納濾膜后續(xù)處理30分鐘，除去90%水，加入0. 05%海 藻糖、0. 02%乙酰半膀氨酸和0. 05%枸杞酸鈉配成的穩(wěn)定劑，制得含1000AT-U/g抗凝血酶 液態(tài)水蛭素。
權(quán)利要求
1.用電刺激活體水蛭提取水蛭素的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟1.1采用弱電或直流電刺激活體水蛭，獲得在電流刺激下水蛭產(chǎn)生的分泌物，1.2將分泌物經(jīng)過800 μ m納濾膜后續(xù)處理30 180分鐘，除去80 90 %的水份，添加 8 15%醫(yī)用淀粉賦形，減壓至0. 9大氣壓下，在進(jìn)口溫度為230 180°C，出口溫度90 75°C下進(jìn)行噴霧干燥，獲得含800AT-U/g的高活性抗凝血酶活性水蛭素干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用電刺激活體水蛭提取水蛭素的方法，其特征在于，該方法 包括如下步驟1.1采用弱電或直流電刺激活體水蛭，獲得在電流刺激下水蛭產(chǎn)生的分泌物，1. 2將分泌物經(jīng)過800 μ m納濾膜后續(xù)處理30 180分鐘，除去80 90 %的水份， 加入由0. 05%海藻糖、0. 02%乙酰半膀氨酸和0. 05%枸杞酸鈉配制成的穩(wěn)定劑，制得含 1000AT-U/g抗凝血酶液態(tài)水蛭素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用電刺激活體水蛭提取水蛭素的方法，其特征在于，所述用 直流電刺激活體水蛭，直流電的電流強(qiáng)度為1 20mA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用電刺激活體水蛭提取水蛭素的方法，其特征在于，所述用 直流電刺激活體水蛭，直流電的電極使用不銹鋼。
全文摘要
用電刺激活體水蛭提取水蛭素的方法，利用電流對(duì)生物體腺體的刺激作用，直接使用直流弱電刺激活體水蛭批量提取高純度水蛭素的方式，并保持水蛭的活體性狀，以期簡化水蛭素的生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品純度，保持野生水蛭資源的重復(fù)利用，降低生產(chǎn)成本，克服生產(chǎn)的季節(jié)性障礙問題。本發(fā)明提取的水蛭素經(jīng)過納濾除水，減壓噴霧干燥，制成含抗凝血酶活性達(dá)800AT-U/g的粉狀水蛭素，加入保護(hù)劑的抗凝血酶活性達(dá)1000AT-U/g液態(tài)水蛭素。
文檔編號(hào)C07K1/14GK102146136SQ20101060445
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者刁建中, 蘇國強(qiáng) 申請人:南寧乙翔生物科技有限公司