專利名稱：針對分枝桿菌的多肽疫苗和接種策略的制作方法
技術領域：
本發(fā)明總體而言涉及重組疫苗和接種方法領域。更特別地，本發(fā)明涉及用于初 免一力口強(prime-boost)免疫策略的重組結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis) 蛋白的施用。
背景技術：
每年全世界有800至1000萬人患結核病。結核病的全球發(fā)病率以每年的速率 增長，這主要是由于非洲疾病患病率的快速增長。在其他區(qū)域中，成功的控制努力已經(jīng)開始 穩(wěn)定疾病的發(fā)病率。然而估計大約2，000，000，000人，即等于世界人口的三分之一，被結核 分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis bacilli)即導致TB 的微生物感染(World Health Organization 2006Tuberculosis Facts (世界衛(wèi)生組織 2006 年結核病事實))。對于找到結核病的新治療或接種策略的需要受到世界HIV感染率增加的壓力，目 前250，000例TB死亡是HIV相關的。結核病自身是人類的第二大殺手，其每年導致世界上 超過 200 萬例死亡(World Health Organization 2006Tuberculosis Facts (世界衛(wèi)生組 織2006年結核病事實))。減毒的牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)卡介苗(bacillus Calmette-Guerin,BCG)疫苗是目前許可用于人類的唯一的結核病疫苗。BCG疫苗對于嚴重 的兒科的和肺外形式的結核病是有效的。然而，對發(fā)展中國家的成年人肺結核的保護是不 足的，成年人的保護在 0 至 80%之間變動(Fine P. Ε. Μ.，Lancet 2000 ；346 1339-1345) 結核病接種的可變效力看上去在地理上是集中的。例如在英國，已觀察到大約75%的保護 (Hart P.D.和Sutherland I.，BMJ，1977 ;2，293-295)。相比之下，在印度和馬拉維的臨床研 究未能顯示針對肺結核的一致保護(Fine，PE等人，Scand J Infec Dis, 2001 ；33 :243_45 ； Ponnighaus J. M.，Lancet,1992 ； 339 :636_639)。由于TB的唯一有效疫苗是BCG疫苗，目前的研究努力集中在改進BCG效力上 (Dietrich G.，Vaccine, 2003 ；21 :667_670)。例如，相對于標準 BCG 疫苗、單獨表達 Ag85B 的重組BCG疫苗或表達Ag85B和ESAT-6的融合蛋白的重組BCG疫苗，過量表達抗原Ag85B、 早期分泌的抗原(ESAT-6)和IFN-Y的融合蛋白的重組BCG疫苗增加了特定抗體滴定度和 MM^&M^- (Xu Y. ,FEMS Immunology and Medical Microbiology, 2007 ；51 :480_487)。 ESAT-6，一種由毒性的結核分枝桿菌產(chǎn)生的蛋白，在標準的BCG疫苗菌株中不存在，并且目 前作為針對結核病的潛在的疫苗亞單位(subimit)得到了大量的研究。例如，在隨后用結 核病H37Rv激發(fā)的小鼠中與BCG免疫聯(lián)合的編碼ESAT-6的DNA疫苗顯示了改進的ESAT-6特異性干擾素 Y (Fan X.，Scandinavian Journal of Immunology, 2007 年 10 月 4 日；66 523-528)。除了新的亞單位疫苗的研究之外，初免-加強策略作為改進BCG免疫原性的方法 目前正在研究中(Goonetilleke N. P. , Journal of Immunology 2003;171:1602-1609; Kaufmann S. H. , Nature Reviews Immunology 2001;1:20-30)。初免一力卩強策略通常使 用DNA疫苗。例如，當表達Ag85B的DNA疫苗被施用于接著用BCG疫苗加強的鼠結核分 枝桿菌模型中時，觀察到超過單獨的BCG疫苗的改進的保護效力(Feng C. G.，Infectious Immunology 2001 ；69 :4174_4176)。相似地，編碼結核分枝桿菌蛋白 Apa、HSP_65 和 HSP-70 的DNA注射以及隨后的常規(guī)BCG接種也改進了針對小鼠中結核病激發(fā)的保護(Ferraz， Infection and Immunity 2004 ；72 :6945_6950)。通常通過肌肉內(nèi)或皮下途徑來進行傳統(tǒng)的免疫。然而，結核病主要是呼吸系統(tǒng)疾 病。因此，針對感染的保護和隨后疾病的根除可最好通過對呼吸道粘膜的直接施用來實現(xiàn) (Kallenius 等人，Tuberculosis (愛丁堡)，2007 ;87 :257_66)。鼻內(nèi)接種可具有超過其 他施用途徑的優(yōu)勢，例如鼻內(nèi)接種不受到已形成的全身免疫的影響，而腸胃外接種在含有
的中 Y^C雙(van Savage J. Μ. , Journal of Infectious Disease 1990 ；161 487-492)。對預先存在的抗體的存在的規(guī)避在一些地理區(qū)域中是重要的，在所述地理區(qū)域中 最需要針對結核病的改進的疫苗。之前暴露于蠕蟲和腐生分枝桿菌所致的先前Th2背景免 疫已被認為降低BCG疫苗誘發(fā)免疫保護的能力(Rook, Vaccine, 2005 ；23 2115-2120)0此 外，設想鼻內(nèi)接種在預防宿主中結核分枝桿菌感染中可能是有效的(Kauffman SH. ,Nature Reviews of Immunology 2006;6:699-704)。鼻內(nèi)接種的動物研究顯示了與皮下接種途 徑相比保護效力的增加(Giri, PK.等人，F(xiàn)EMS Immunology and Medical Microbiology, 2005 ；45 87-93 ；Chen, L.等)κ, Infection and Immunity, 2004 ；72 238-246)。盡管已在人類和動物系統(tǒng)二者中對活BCG疫苗或死BCG疫苗、蛋白亞單位疫苗、重 組細菌載體疫苗、血漿DNA疫苗或組合的免疫手段進行了初步研究，但是對于哪個方法在 受治療者中產(chǎn)生最強的免疫應答和最高水平的保護知道的很少。此外，有關由每種疫苗類 型誘發(fā)的免疫應答特征的細節(jié)有待完全闡明。增加的結核病感染的患病率和增加的抵抗， 特別是在發(fā)展中世界中，引起對改進的結核病疫苗和接種策略的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種疫苗，其增加受治療者中的免疫應答，其中所述疫苗包含至少一 種結核分枝桿菌多肽，其中所述多肽可選地為Ag85A、Ag85B、MPT-64、Pst-Sl、Apa, GroES, GroEL, Dnak, CFP-10, Rv0831c和Rvl324、其部分、其組合或其多重體(multiple)?？蛇x地 以其天然形式將這些重組蛋白純化，或者它們還包含適合增加純化的標簽。結核分枝桿菌 多肽可選地為重組的。本發(fā)明的疫苗可選地含有乳液。適合的乳化劑包括超分子生物載體 (supramolecular biovector, SMBV)、納米顆粒、脂質(zhì)體或其組合。本發(fā)明的疫苗可選地含有佐劑。適合的佐劑說明性地包括二甲基雙十八烷基溴化 銨(dimethyl dioctadecyl-ammonium bromide, DDA)；單憐酉先月旨 A (monophosphoryl lipidA, MPL) ；LTK63，親脂性季銨鹽-DDA (lipophilic quaternary ammonium-DDA)，DDA-MPL，鋁 鹽，氫氧化鋁，磷酸鋁，磷酸鋁鉀，Montanide ISA-51，ISA-720，微顆粒，免疫刺激復合物，脂 質(zhì)體，病毒體，病毒樣顆粒，CpG寡核苷酸，霍亂毒素，來自大腸桿菌(E.coli)的不耐熱的毒 素，脂蛋白，樹突狀細胞，IL-12，GM-CSF，說明性地包括磷酸鈣納米顆粒的納米顆粒，用以形 成納米乳液的大豆油、乳化劑和乙醇的組合；AS04，ZADAXIN或其組合。本發(fā)明還提供了增加受治療者免疫應答的方法，其中結核分枝桿菌多肽施用于受 治療者。施用可選地通過包括如下的途徑皮內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、霧化、口服、舌 下、陰道內(nèi)、經(jīng)直腸、靜脈內(nèi)、粘膜內(nèi)或者本領域已知的其他遞送方法。增加免疫應答的方 法可選地使用對受治療者施用第二疫苗，其可選地為Ag85A、Ag85B、MPT-64、Pst-Sl、Apa, GroES, GroEL, Dnak, CFP-IO, Rv0831c和Rvl324或其組合、上述多肽的表位或其肽。可選 地，BCG疫苗的施用在重組結核病多肽的施用之前發(fā)生?？蛇x地，BCG疫苗的施用可在重組 結核病多肽的施用之后發(fā)生，或者可選地，BCG疫苗的施用與重組結核病多肽、表位或肽的 施用同時發(fā)生。BCG疫苗可選地為重組的(表達一個或多個上述多肽)或天然的。此外， BCG疫苗和/或重組結核病多肽的施用在受治療者暴露于分枝桿菌感染或患病之前、過程 中或之后發(fā)生。本發(fā)明還提供了藥物包(pharmaceutical package)，其包含選自包含Ag85A、 Ag85B、MPT-64、Pst-Sl、Apa、GroES、GroEL、Dnak、CFP-10、Rv0831c 和 Rvl324 的組的至少一 種多肽或其組合。還有乳化劑和佐劑。乳化劑可選地為二甲基雙十八烷基溴化銨。佐劑可 選地為單磷酰脂A。


圖1表示由銀染色法處理的純化的新重組結核分枝桿菌蛋白的SDS-PAGE(4-20% 梯度凝膠)，其中第1道表示分子量標志物，第2道是Rv0164，第3道是Rv0831c，而第4道 是 Rvl324 ；圖2表示由鼻內(nèi)或皮下BCG接種所誘發(fā)的T細胞應答的動力學；圖3表示由鼻內(nèi)或皮下BCG接種所誘發(fā)的無應答的動力學；圖4表示在鼻內(nèi)BCG接種后的早期(6周)和晚期(30周)時間點處的受治療 者的局部和外周免疫區(qū)室(compartment)中結核分枝桿菌全細胞溶胞產(chǎn)物(whole cell lysate, WCL)和短期培養(yǎng)濾液(short term culture filtrate, STCF)特異性 T 細胞的分 布，其中所述結果表示為從各自的未受刺激的培養(yǎng)物中減去SFU之后的3至6次測定的平 均值士標準偏差；圖5表示在鼻內(nèi)BCG接種后的早期(6周)和晚期(30周)時間點處的受治療者 的局部和外周體液中結核分枝桿菌全細胞溶胞產(chǎn)物(WCL)和短期培養(yǎng)濾液(STCF)特異性 抗體的水平，其中所述ELISA測量的結果表示為減去對照孔吸光度之后的三個孔在492nm 的平均吸光度士標準偏差；圖6表示結核分枝桿菌重組抗原在早期(3周)和晚期(30周)時間點處誘發(fā)鼻 內(nèi)BCG接種的受治療者的T細胞應答的能力，其中ELISP0T測定的結果表示為從各自的未 受刺激的培養(yǎng)物中減去SFU之后的兩次測定的平均值士標準偏差；圖7表示在用多組分亞單位疫苗進行鼻內(nèi)免疫2周后的受治療者中結核分枝桿菌重組抗原誘發(fā)T細胞應答的能力，其中ELISP0T測定的結果表示為從各自的未受刺激的培 養(yǎng)物中減去SFU之后的兩次測定的平均值士標準偏差；圖8表示在用多組分亞單位疫苗進行鼻內(nèi)免疫2周后的受治療者中結核分枝桿菌 重組抗原特異性抗體應答，其中結果表示為減去對照孔吸光度之后的三次測定中在492nm 的平均吸光度士標準偏差；圖9表示免疫6周后用Apa擴展的T細胞抑制巨噬細胞中結核分枝桿菌的細胞內(nèi) 生長；圖10表示鼻內(nèi)免疫的受治療者的多肽免疫原特異性增殖應答，其中Rv0164、 Rv0831c和Rvl324單獨地封裝在陽離子脂質(zhì)體中并單獨地施用；圖11表示用封裝在陽離子脂質(zhì)體中的Rv0164、Rv0831c和Rvl324的組合進行鼻 內(nèi)免疫的受治療者的多肽免疫原特異性增殖應答被；圖12表示用編碼Rv0164、Rv0831c或Rvl324的單個多肽進行鼻內(nèi)免疫的受治療 者的肺、CLN和脾中多肽免疫原特異性T細胞的分布；圖13表示在用封裝在陽離子脂質(zhì)體中的重組Rv0164、Rv0831c或Rvl324免疫2 和4周后的受治療者的鼻灌洗液和血清中的多肽免疫原特異性的異型和同種型抗體應答；圖14表示在用封裝在陽離子脂質(zhì)體中的重組Rv0164、Rv0831c和Rvl324的組合 免疫2和4周后的受治療者的鼻灌洗液和血清中的多肽免疫原特異性的異型和同種型抗體 應答；圖15表示結核分枝桿菌的天然Apa (nApa)、重組APA (rApa)、重組Ag85A (rAg85A) 和對照DDA-MPL佐劑在用各自的蛋白亞單位疫苗或單獨的DDA-MPL佐劑進行鼻內(nèi)免疫的 BALB/c小鼠中對肺、頸部淋巴結(CLN)或脾細胞誘發(fā)Thl應答(IFN-γ和IL-2)的比較能 力；圖16表示結核分枝桿菌的天然Apa、重組ΑΡΑ、重組Ag85A和對照DDA-MPL在用各 自的蛋白亞單位疫苗或單獨的DDA-MPL佐劑進行鼻內(nèi)免疫的BALB/c小鼠中對肺、CLN和脾 細胞誘發(fā)Th2或Thl7應答的比較能力；圖17表示在肺、頸部淋巴結(CLN)和脾細胞培養(yǎng)物中，免疫4周后用牛分枝 桿菌BCG體外激發(fā)之后亞單位免疫及假免疫的小鼠中的肺、CLN和脾細胞培養(yǎng)物中分泌 ThKIFN-Y和IL-2)細胞因子的細胞的頻率；圖18表示免疫4周后用牛分枝桿菌BCG體外激發(fā)之后亞單位免疫及假免疫的小 鼠中的肺、頸部淋巴結(CLN)和脾細胞培養(yǎng)物中分泌Th2(IL-4)和Thl7(IL-17)細胞因子 的細胞的頻率。
具體實施例方式增加的HIV患病率增加了對結核分枝桿菌疫苗的需要，所述疫苗對發(fā)達和發(fā)展中 世界的兒童和成年患者都具有效力。本發(fā)明作為針對分枝桿菌(Mycobacterium)的新疫苗 具有用途。為了回應針對結核病的大范圍BCG疫苗效力，提供了全新發(fā)明的策略以加強BCG 疫苗施用后產(chǎn)生的免疫應答。為此，結核分枝桿菌的分泌蛋白代表用于加強BCG疫苗效力 的抗原的寶貴來源。本發(fā)明提供單獨或與BCG聯(lián)合使用的增加受治療者的免疫應答的疫苗。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明使用至少一種結核分枝桿菌多肽。適合于本發(fā)明的多肽 包括毒性結核分枝桿菌在受治療者體內(nèi)表達的任何多肽。適合用于本發(fā)明的多肽可選地 包括 Ag85A、Ag85B、MPT-64、Pst-Sl、Apa、GroES, GroEL, Dnak, CFP-IO, Rv0831c 和 Rvl324、 其部分、其組合或其多重體。多重體說明性地指超過一種多肽序列類型或超過一個拷貝的 單一多肽序列。適合于本發(fā)明的多肽可選地為重組的或天然產(chǎn)生的。優(yōu)選地，適合于本發(fā)明的多肽是重組的和通過本領域已知方法獲得的。說明性地， 將核苷酸序列克隆進質(zhì)粒，所述質(zhì)粒轉染進大腸桿菌并表達。為了簡化純化步驟，從大腸 桿菌表達的多肽可選地包括標簽序列。適合用于本發(fā)明的標簽的說明性實例包括多組氨 酸、CBP、CYD (共價但可解離的NorpD肽)、stMp-2、FLAG、HPC或蛋白C肽重鏈標簽(heavy chain of protein C peptide tag)或者GST和MBP蛋白融合標簽系統(tǒng)。可理解，其他標簽 系統(tǒng)是相似地可操作的。在優(yōu)選的實施方案中，重組多肽表達在大腸桿菌中，并使用親和標 簽系統(tǒng)純化，接著通過例如在表達的多肽中引入因子Xa、凝血酶或其他酶的切割位點將標 簽酶促切割。標簽切割的方法是本領域中已知的，而且任何有效方法被理解為適合用于本 發(fā)明。在優(yōu)選的實施方案中，使用多組分疫苗。多亞單位疫苗可選地含有一組單獨的多 肽或者單個融合蛋白或融合蛋白家族，其中每種蛋白可選地表示由毒性結核分枝桿菌表達 的單個蛋白。優(yōu)選地，使用九個多肽的疫苗。可理解，每種單獨的抗原或多肽獨立地適合用 于本發(fā)明。沒有料到地，多組分疫苗的施用增加每種單獨組分的免疫原性。因此，九個亞單 位的疫苗的優(yōu)選實施方案證明協(xié)同的免疫原性。術語受治療者說明性地為能夠?qū)σ呙绲募ぐl(fā)產(chǎn)生免疫應答的活生物體。受治療者 的非限制性的實例包括人、任何較低等的靈長類、狗、貓、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、豬、倉鼠、馬、 驢、牛、負鼠、獾、山羊或其他哺乳動物或非哺乳動物。術語免疫應答說明性地為受治療者免疫系統(tǒng)的任何改變，其響應于來自如下的激 發(fā)疫苗、傳染性的或另外的外來生物體、組織、細胞、抗原、抗體、核苷酸鏈或本領域公認的 其他免疫刺激物質(zhì)。免疫應答的非限制性實例包括⑶4+或⑶8+T細胞中的IL-2、IL-4或 IFN-Y的體外分泌；免受結核分枝桿菌H37Rv或其他傳染性生物體激發(fā)的保護；亞硝酸鹽 水平的改變；在各種免疫區(qū)室中的Thl和Th2細胞因子應答；異型和同種型抗體水平的改 變；抗原的體外識別；B細胞應答；受感染的巨噬細胞中結核分枝桿菌的生長抑制；存活； 或本領域已知的其他應答。術語多肽說明性地為具有兩個或更多個氨基酸殘基的鏈。在優(yōu)選的實施方案 中，適合用于本發(fā)明的多肽是Rvl860 (Apa)蛋白、整個重組的或天然的蛋白、其突變體、其 部分、表位或肽、其同系物的氨基酸序列，或者與其他肽序列合并的Apa序列。以登錄號 YP_177849 找到 Apa 序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗是多組分疫苗。多組分疫苗說明性地包括九個多肽抗原例 如 Ag85A、Ag85B、MPT-64, Pst-Sl、Apa、GroES, GroEL, DnaK 和 CFP-10。作為包含在疫苗中 的候選者的可操作的代表性結核分枝桿菌H37Rv多肽以及它們各自的核苷酸序列Ag 85A(Rv3804c)基因 ID 886132 ；蛋白 ID :NP_218321Ag 85B(Rvl886c)基因 ID 885785 ；蛋白 ID :NP_216402MPT-64(Rvl980c)基因 ID 885925 ；蛋白 ID :NP_216496
Pst-Sl (Rv0934)基因 ID 885724 ；蛋白 ID :YP_177770Apa(Rvl860)基因 ID 885896 ；蛋白 ID :YP_177849GroES(Rv3418c)基因 ID 887583 ；蛋白 ID :NP_217935GroEL(Rv0440)基因 ID 886354 ；蛋白 ID :NP_214954Dnak(Rv0350)基因 ID 885946 ；蛋白 ID :NP_214864CFP-IO (Rv3874)基因 ID 886194 ；蛋白 ID :NP_218391CFP-31 (Rv0831c)基因 ID 885349 ；蛋白 ID :NP_215346CFP-32(Rvl324)基因 ID 886897 ；蛋白 ID :NP_215840MTSP-17/CFP-15 (Rv0164)基因 ID 886267 ；蛋白 ID :YP_177617。多肽優(yōu)選地來自結核分枝桿菌實驗室菌株或臨床分離株，但是還可來自牛分枝桿 菌、牛分枝桿菌BCG、鳥分枝桿菌(M. avium)、副結核分枝桿菌(M. paratuberculosis)、恥垢 分枝桿菌(M. smegmatis)、潰瘍分枝桿菌(M. ulcerans)或其他分枝桿菌來源。疫苗可選地 包括等摩爾濃度的每種抗原，但是可理解每種抗原的獨特摩爾濃度也適合于本發(fā)明。示例 性的疫苗將向小受治療者遞送每劑包括10 μ g的每種抗原的總共90 μ g的重組抗原混合 物，或者向人類受治療者遞送達到或超過1000 μ g的每種抗原。以與劑量制劑相適合的方 式并以預防、治療有效的和致免疫的量施用疫苗。待施用的量取決于待治療的受治療者，包 括例如個體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應答的能力，以及期望的保護程度。適合的劑量范圍是每 次接種大約幾百微克活性成分的水平，優(yōu)選的范圍是從約0. 1至1000 μ g。初期施用和加強 注射的適合方案也是可變的，但是其通常為初期施用接著是隨后的接種或其他施用。疫苗 的劑量將取決于施用途徑，并且將根據(jù)待接種的人的年齡而改變而且根據(jù)待接種的人的體 型而在更小的程度上改變。令人吃驚地，上述多亞單位疫苗的鼻內(nèi)(i.n.)遞送導致對九個單獨抗原中每個 的肺特異性免疫應答。每種抗原的識別水平是獨特的，而IFN-Y分泌細胞的水平如下排 序Apa > MPT-64 > DnaK > Pst-Sl > GroEL > GroES > Ag85A > Ag85B > CFP-10。還在其他免疫區(qū)室中觀察到該抗原識別模式。然而，當測量了 IL-2水平時， 基于微球體的細胞因子多重免疫測定(multiplexed micro-sphere based cytokine immunoassay)顯示了對 Ag85A、Ag85B 和 Pst-Sl 的最大應答(表 2)。在一個優(yōu)選的實施方案中，疫苗含有單個多肽抗原。優(yōu)選地，抗原是分枝桿菌 Apa分泌蛋白，其也被稱作45/47-kDa蛋白復合物或來自基因modD的蛋白(Romain，F(xiàn).等 人，Infect. Immun. , 1993 ；61 :724_750)。Apa作為具有九種糖形式的糖基化蛋白進行分泌 (Horn, C 等人，J. Biol. Chem.，1999 ；274 =32023-32030)。先前的研究證明，Apa 的糖基化 對于體外和體內(nèi)的抗原性是必需的(Romain，R等人，Infect Immun, 1999 ；67 :5567_5572)。 關于在引發(fā)免疫應答中對糖基化的需要，這些作者提供了三種可能的解釋。第一，已經(jīng)報 道了當用其他糖肽免疫時的糖肽特異性應答，暗示肽主鏈和糖基化二者都與T淋巴細胞受 體相互作用(Carbone, FR 和 Gleeson PA, Glycobiology, 1997 ；7 :725_730 ；Deck B 等人， J Immunol, 1995 ；155 1074-1078 ；Haurum, JS 等人，J Exp Med, 1994 ； 180 :739_744)。第 二，對于引發(fā)免疫應答負責任的受體在本質(zhì)上可能是非特異性的以便許多抗原的甘露糖基 化是可通過單一受體類型識別的(Stahl，PD 和 Ezekowitz，RAB，Curr Opin Immunol, 1998 ；10 :50-55)。最后，糖基化的存在或不存在可改變巨噬細胞或樹突狀細胞對這種分子的攝取 或加工。Apa的抗原性被認為與糖基化的存在相關。然而，在蛋白亞單位接種之后，糖基化 對APA的T和B細胞免疫原性的作用未被詳細評估。相應地，Romain等人的初免-加強策略成功地在用包括編碼Apa、Hsp70和Hsp65 的載體的三價DNA疫苗初免并用BCG疫苗加強之后引發(fā)改進的免疫應答。由于抗原表達在 宿主細胞中，DNA疫苗的使用產(chǎn)生糖基化的抗原(Apa等)。在Romain的情況下，初免抗原 在表達過程中進行哺乳動物細胞糖基化，而且任何抗原性或免疫原性預計是糖基化抗原暴
露的結果。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，多肽不經(jīng)糖基化而產(chǎn)生。在一個非限制性的實例中， 多肽在大腸桿菌中合成，其中大腸桿菌在本領域中被公認為不能將與哺乳動物細胞類型或 結核分枝桿菌相關的蛋白適當?shù)靥腔??？衫斫?，不將多肽糖基化的其他合成方法是相?地適合的。因此，在該實施方案中，蛋白免受糖基化。由于Apa的高度細胞識別可例如歸因 于糖基化的存在，而且分析Apa的免疫原性或抗原性的所有先前研究可歸因于糖基化的抗 原，所以期望糖基化的缺失將不產(chǎn)生有效的結果。令人吃驚地，在本發(fā)明中，使用非糖基化 的多肽的接種導致穩(wěn)健的免疫原性。本發(fā)明適合作為標準的獨立的疫苗、初免疫苗或加強疫苗。優(yōu)選地，本發(fā)明用于初 免-加強策略。更優(yōu)選地，本發(fā)明用作初免疫苗。當用作初免疫苗時，本發(fā)明說明性地接著 是用BCG疫苗或其他亞單位/DNA疫苗的免疫。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用單個的亞 單位初免疫苗。優(yōu)選地，其中多肽是Apa的疫苗?？衫斫猓渌嚯氖窍嗨频剡m合的。在該 實施方案中，用Apa蛋白的免疫可選地接著是用單個的亞單位或多組分疫苗的免疫，所述 多組分疫苗說明性地使用除了 Apa之外或者排除Apa之后的超過一種蛋白。隨后接種的遞 送可選地是在短的或長的時間段內(nèi)。在非限制性的實例中，在一天或一周中遞送第二次接 種。可選地，在一年或幾年后遞送第二次接種。可理解，第二疫苗的遞送可以是在受治療者 生命中的任何時間。優(yōu)選地，第二疫苗是蛋白亞單位疫苗或甚至BCG疫苗(正常的或重組的)。第二或 隨后的疫苗的遞送可選地是通過與第一免疫相同的遞送途徑或通過可選的途徑。在優(yōu)選的 實例中，初免疫苗通過鼻內(nèi)途徑遞送。隨后的加強疫苗也通過鼻內(nèi)途徑遞送。在優(yōu)選的實施方案中，在用單或多組分疫苗加強之前進行BCG疫苗的遞送。優(yōu)選 地，通過多組分疫苗的遞送加強BCG接種。更優(yōu)選地，通過用單組分疫苗的接種來加強BCG， 其中所述單組分是編碼Apa蛋白的多肽。相似地，可理解，加強疫苗的遞送可選地在受治療 者生命中任何時間遞送。本發(fā)明可選地被用作組合疫苗。說明性地，用單或多組分疫苗來補充BCG疫苗。該 策略允許單個多肽、多組分和BCG疫苗以任意組合同時遞送。在優(yōu)選的實施方案中，包含單個或多個多肽的單或多組分疫苗通過鼻內(nèi)途徑遞 送，而BCG疫苗通過皮內(nèi)或皮下途徑遞送。更優(yōu)選地，單或多組分疫苗通過鼻內(nèi)途徑遞送， 而加強BCG疫苗也通過鼻內(nèi)途徑遞送。可選地，通過鼻內(nèi)或經(jīng)皮途徑遞送BCG疫苗，而加強 的單或多組分疫苗也通過相同途徑遞送?？衫斫猓绢I域已知的遞送方法適合于通過這些 或其他進入途徑來遞送疫苗。發(fā)明的疫苗的遞送可選地在用TB進行主動或非主動感染之前、過程中或之后，或者在患病之后，單獨或者與抗結核化療聯(lián)合。因此，單或多組分疫苗的遞送可選地為預防性 的、感染后的或治療性的。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明設計為預防或消除疾病，或者預防 感染。可選地，單或多組分疫苗的遞送是治療性的。多肽可選地作為裸露的多肽在水溶液中、在乳液中或在其他適合的遞送組合物中 進行遞送。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明作為疫苗或作為藥物包的疫苗組分進行遞送。可 選地，多肽(或多個多肽)或免疫原性肽或表位存在于包括適合的乳化劑的乳液中。在優(yōu) 選的實施方案中，多組分疫苗乳化或封裝在適合的疫苗載運體(carrier)中。更優(yōu)選地，單 個的亞單位疫苗被乳化。更優(yōu)選地，編碼Apa的多肽被乳化。適合的乳化劑說明性地包括 超分子生物載體(SMBV)、例如 Major，M 等人，Biochim. Biophys. Acta, 1997 ；1327 32-40, De Migel, I 等人，Pharm. Res.，2000 ；17 :817_824，美國專利第 6，017，513，7，097，849， 7，041，705,6, 979，456,6, 846，917,6, 663，861,6, 544，646,6, 541，030,6, 368，602 號， Castignolles, N.等人，Vaccine，1996 ；14 :1353_1360，Prieur, E.等人，Vaccine，1996 ； 14 :511-520，Baudner B 等人，Infect Immun,2002 ；70 4785-4790 中所述的；脂質(zhì)體例如 El Guink等人，Vaccine，1989 ；7 147-151和美國專利第4，196，191號中所述的納米顆粒； 或本領域已知的其他試劑。適合使用的試劑通常是商業(yè)上可得的?？蛇x地，本發(fā)明包括多肽與佐劑的共同遞送。適合的佐劑說明性地包括二甲基 雙十八烷基溴化銨(DDA)；單磷酰脂A(MPL)；大腸桿菌不耐熱的腸毒素，其基因修飾的衍 生物，LTK63，海藻糖二分枝酸酯和合成的衍生物，親脂性季銨鹽-DDA，DDA-MPL，DDA-TDM， DDA-TDB, IC-31，鋁鹽，氫氧化鋁，磷酸鋁，磷酸鋁鉀，美國專利公布20070212329中所述 的那些，節(jié)約抗原的佐劑(antigen-sparing adjuvants)，Montanide ISA-51，ISA-720， 微顆粒，免疫刺激復合物，脂質(zhì)體，病毒體，病毒樣顆粒，CpG寡核苷酸，霍亂毒素，來自 大腸桿菌的不耐熱的毒素，脂蛋白，樹突狀細胞，IL-12，GM-CSF，說明性地包括磷酸鈣 納米顆粒的納米顆粒，用以形成納米乳液的大豆油、乳化劑和乙醇的組合；Glax0-Smith Kline (Middlesex, UK)生產(chǎn)的 AS04 ；可從 SciClone Pharmaceuticals (香港)獲得的 ZADAXIN ；本領域已知的其他試劑，其組合或其片段。有關下面的非限制性的實施例，對本發(fā)明進一步進行說明。實施例1BCG、單和多組分疫苗的產(chǎn)生BCG(哥本哈根)疫苗提供作為美國Bethesda的食 品與藥品管理局(FDA)的生物制品評估研究中心的TB臨床前疫苗參考標準。將凍干的BCG 疫苗重新懸浮于疫苗稀釋劑(稀釋的Sauton培養(yǎng)基，Statens血清研究所，哥本哈根，丹 麥)中。對于單或多組分疫苗的產(chǎn)生，單一劑量由在DDA(250yg/劑，Sigma-Aldrich, St. Louis, M0)和 MPL(產(chǎn)生自明尼蘇達沙門氏菌(Salmonella minnesota) Re 595 ；25μ g/ 劑，Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)中乳化的10 μ g的每種多肽所組成。如Sable SB等 A, Vaccine, 2005 ；23 =4175-4184中所述制備了乳液。簡言之，首先將MPL與含有0. 2%三 乙胺(Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)的不含內(nèi)毒素的無菌水(Burdick & Jackson, Muskegon,MI)混合。混合物在70°C水浴中加熱30s，然后超聲處理30s，進行三次。通過將 DDA懸浮于無菌水中來制備乳液，并通過在水浴中在80°C下將懸液加熱5-lOmin來獲得均 勻的粉末分散。冷卻至室溫之后，就在使用之前將MPL和抗原與DDA混合。
實施例2多肽的產(chǎn)生在科羅拉多Fort Collins的科羅拉多州立大學的微生物學、免疫學 和病理學系，通過由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)/美國國家過敏和傳染病研究所(NIAID) 資助的TB疫苗測試和研究材料協(xié)議(TB Vaccine Testing and Research Material contract)獲得了九個重組結核分枝桿菌H37Rv蛋白(表1)、全細胞溶胞產(chǎn)物(WCL)和總 的短期培養(yǎng)濾液蛋白(STCF)。表1
候選疫 苗Sanger 注解計算的 分子量 (kDa)a觀察的 分子量 (kDa)b批次號內(nèi)毒素水 平(ng/mg) d功能Ag85ARv3804c35.5530.505.rEC.04.28.Ag85A1.37分枝?；D移 酶/纖連蛋白 仕人 口Ag85BRv 1886c34.45.29.505.rEC.04.25.Ag85B1.43分枝?；D移 酶/纖連蛋白 々士八 一 O 口MPT-64Rv 1980c24.7224.005.rEC.05.25.MPT641.23未知Pst-SlRv093438.1138.005.rEC.07.12.Pstsl1.90磷酸鹽轉運蛋 白ApaRvl86032.5945-4705.rEC.06.03.ModD1.77纖連蛋白結合 /宿主細胞附 著GroESRv3418c10.6710.0-12.002.rEC.06.12.GroES0.69伴侶蛋白 (HSP10 ) /ATP 酶GroELRv044056.7065.005.rEC.06.08.GroEL22.09伴侶蛋白 (HSP65 )DnakRv035066.7070.003.rEC.07.21.DnaK0.86伴侶蛋白 (HSP70 ) /ATP 酶CFP-IORv387410.6610.005.rEC.07.12.CFP101.67未知 /ESAT-6 家族成員 可選地，特定的多肽被克隆，表達和分離。說明性地，如Sable，S.等人，Infection and Immunity, 2005 ；73 :3547_3558 和 Sable，S 等人，Vaccine, 2005 ；23 :4175_4184 所述 的進行分離和表征。簡言之，在疾病防控中心的生物技術核心機構合成了用于克隆和測序 的引物。設計用于在NCBI數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的Rv0164(mtsp-17/TB18. 5)、Rv0831c (cfp-31) 和Rvl324(cfp-32)基因序列的下述PCR引物以特異性地擴增相應基因并引入BamHl/Ndel 限制性內(nèi)切酶識別位點Rv0164正向，GCT CATATGATG ACG GCAATC TCG TGC TC(SEQ ID NO 1) ；Rv0164 反向，GCT GGA TCC TTA GCT GGC CGC CAG CTG CTC GGC GC(SEQ ID NO 2)； Rv0831c正向，GCT CAT ATG CTC CCC GAG ACA AAT CAG G(SEQ ID NO 3)；和Rv0831c反向， GCT GGATCC TTACTG GCGAAG CAG CTC AT (SEQ ID NO 4) ；Rvl324 正向，GCT CATATG ACG CGTCCG CGA CCC CCG C(SEQ ID NO 5)；和Rvl324反向，GCT GGA TCC TCAGTA CAG CGC GTT GGC GAG (SEQ ID NO 6)。通過用這些引物組進行結核分枝桿菌H37Rv染色體DNA的PCR擴增獲 得了 DNA片段，在瓊脂糖凝膠上純化并克隆進TOPO TA克隆載體(Invitrogen，CA，美國)。 在含卡那霉素(25μβ/πι1)的Luria-Bertani培養(yǎng)基上選擇假定的重組大腸桿菌(TOP 10) 克隆。提取了質(zhì)粒并通過PCR、限制性內(nèi)切酶消化和測序確認了插入片段。將BamHl/Ndel 切割的插入片段符合讀框地克隆進表達載體pET19-b(NoVagen，CA，美國)，并通過測序確 認所得的質(zhì)粒。含有感興趣的基因的pET19_b表達載體隨后用來轉化大腸桿菌BL-21 (DE3)細胞 (Novagen ；EMD Biosciences，CA，美國)。在含有 100 μ g/ml 氛節(jié)西林的 Luria-Bertani 培 養(yǎng)基中用0.25mM IPTG(異丙基β-D-硫代半乳糖苷)誘導了編碼相應重組蛋白的基因， 同時在25°C水浴中培養(yǎng)16h。按照制造商的說明，使用Bugbuster試劑盒(Novagen，CA, 美國)將細胞裂解，并且在8M脲存在下溶解之后使用鎳-次氮基三乙酸(Ni-NTA)瓊脂糖 基質(zhì)(HisBind純化試劑盒；Novagen，CA，美國)將重組蛋白從內(nèi)含體中，或者根據(jù)制造商 的實驗方案從可溶性周質(zhì)級分中純化。在洗脫之前在沖洗緩沖液中使用0. 5% ASB-14從 柱子中除去內(nèi)毒素，同時如Oganesyan，N等人，2005 ；1345-711X所述的進行柱上的重新 折疊(on-column refolding)。將重組蛋白制劑集中起來并針對0. IM PBS (pH 7.2)進行 透析。使用用相同緩沖液平衡的分析型superdex-200柱(10/300 ;Amersham Pharmacia Biotech)，通過快速蛋白液相色譜法將透析的Rv0164和Rv0831c進一步純化。在針對20mM Tris-HCKpH 8. 2)透析后使用UNO Ql陰離子交換柱(Bio-Rad，CA，美國)并使用0-1M NaCl 線性梯度將Rvl324純化。通過SDS-PAGE分析了級分，用PBS (pH 7.2)進行緩沖液更換并 將其在Centricon YM-3 (MiIlipore，MA, USA)上濃縮。將純化的重組蛋白過濾(0. 22 μ M ； Millipore, ΜΑ，美國)滅菌并使用microBCA蛋白評價方法(QuantiPro BCA測定試劑盒； Sigma-Aldrich，M0，美國)進行定量。通過LC-MS-MS進一步確認了蛋白身份。根據(jù)制造 商的實驗方案，通過鱟變形細胞溶胞產(chǎn)物測定(LAL-QCL-1000測定試劑盒；Cambrex，MD，美 國)確定了蛋白制劑中脂多糖(LPS)的含量。將蛋白等分并儲存在-70°C直到進一步使 用。如microBCA 方法所評估，一貫地以 l_2mg/L 的 Rv0164、4_5mg/L 的 Rv0831c 和 6-8mg/L的Rvl324蛋白的范圍內(nèi)的產(chǎn)量來實現(xiàn)重組蛋白的表達。在還原條件下(SDS-PAGE ； 4-20%梯度)進行的凝膠的銀染(圖1)表明了純化的重組Rv0164蛋白的分子量為 20. OkDa，重組Rv0831c蛋白的分子量為33. OkDa，而重組Rvl324蛋白的分子量為37. OkDa0 通過LC-MS-MS進一步確認了純化的蛋白的身份。在將蛋白用于受治療者的免疫或體外免 疫測定之前，分析了制劑的內(nèi)毒素(LPS)污染。在所有情況下，LPS以不被懷疑干擾體內(nèi) 或體外免疫原性實驗的量存在(9. OEU的LPS/mg的Rv0164，16EU的LPS/mg的Rv0831c和 Rvl324)。實施例3受治療者的接種對于小鼠受治療者，通過使用26規(guī)格(gauge)注射針在兩條后 腿的醫(yī)淺肌(gluteus superf icialis muscle)禾口股二頭肌(biceps femoral is muscle) 的上方注射50 μ 1的BCG懸液(7 X IO5CFU)的施用來通過皮下接種對BCG疫苗進行遞送。 通過使用細頭微量移液器將總共30μ1的BCG疫苗(7Χ IO5CFU)應用于外鼻孔(每鼻孔15μ 1)，并允許小鼠將懸液自然地吸入肺部來施用BCG疫苗。對于所有研究，對于任何施用 途徑都將BCG疫苗稀釋劑用作對照。相似地進行人類受治療者的接種。通過鼻內(nèi)或皮下注 射施用的人類受治療者的BCG給藥是在1-8 X IO5CFU之間。除了使用每劑90 μ g的重組結核分枝桿菌蛋白混合物(每種多肽10 μ g)之外，如 上所述以2周的間隔通過鼻內(nèi)途徑將多組分疫苗向小鼠遞送三次。人受治療者的劑量包括 施用IO-IOOOyg的每種多肽。大動物受治療者的劑量范圍接近于具有相似分級的接收區(qū) 間的人的劑量范圍。由于接收區(qū)間在尺寸上成比例地更小，所以小動物需要在范圍低端的 劑量。對于所有研究，通過施用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS) (pH 7. 2) DAA-MPL來進行假免疫。實施例4樣品采集在靶時間點上在麻醉中通過心臟穿刺來進行小動物的血液采集。大動 物和人受治療者已被/將被從靜脈內(nèi)抽血至適合的抗凝血劑中。通過確立的步驟收集尿。 通過用含有完全無EDTA的蛋白酶抑制劑混合物(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德 國)的200μ 1的PBS(pH 7. 2)反復沖洗被處死小鼠的鼻孔和相連的上呼吸道來進行鼻灌 洗。血清、尿和鼻沖洗液被儲存在_20°C直到使用。對于小鼠研究，來自肺、脾、鼻相關的淋巴樣組織(nasal associated lymphoid tissue, NALT)、頸部淋巴結(CLN)、腹股溝淋巴結(ILN)、腸系膜淋巴結(MLN)以及股骨和 脛骨骨髓(BM)的樣品被無菌地摘除并置于補充了 100IU/ml青霉素、50μ g/ml鏈霉素、 ImML-谷氨酰胺、25mMHEPES、lmM丙酮酸鈉、5X 10_5Μβ -巰基乙醇、維生素和非必需氨基酸 (Gibco-Invitrogen, Grand Island, NY)和10%的內(nèi)毒素測試的熱滅活的胎牛血清(FCS ； Atlas Biologicals, Fort Collins, CO)的 RPMI 1640 中。通過用 RPMI 1640 培養(yǎng)基沖洗 相應的腔分離了胸廓和腹膜滲出液細胞。實施例5免疫細胞的分離為了分離肺細胞，在麻醉中通過心臟穿刺將小鼠放血并用含 有10U mr1的肝素的PBS通過右室灌流它們的肺以除去血管內(nèi)的白血球。然后用補充的 RPMI 中的含有 lmg/ml 膠原酶 IV 型(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)和 25U πιΓ1 的 DNA 酶(Roche，Penzberg，德國)的酶混合物對肺灌流并在無菌皿中將其切成小片，在37°C下 將碎片(fragment)在酶混合物中溫育lh。將消化的肺碎片用5ml注射器活塞擠壓穿過 70 μ m孔徑的細胞過濾器(BD Falcon, Bedford, ΜΑ)以獲得單細胞懸液，并且用RBC裂解 緩沖液(eBioscience，San Diego, CA)將紅細胞在室溫下裂解4_5min。將肺細胞沖洗，通 過離心回收并在補充的RPMI中重新懸浮以使用臺盼藍染料排除方法計數(shù)。如所述的分離 NALT (Asanuma, H，等人，J Immunol Methods, 1997 ；202 123-131)，并通過用 RPMI 沖洗股 骨和脛骨的腔來分離BM。通過將各自器官輕輕地研磨穿過70 μ m孔徑的細胞過濾器進入 10-20ml的補充的RPMI來獲得脾、淋巴結、BM或NALT的單細胞懸液。以300 Xg將細胞懸 液離心lOmin，并在必要時通過用RBC裂解緩沖液處理來除去紅細胞。用新鮮的RPMI將細 胞沖洗幾次并相應地調(diào)節(jié)細胞濃度。實施例6來自鼻內(nèi)和皮下BCG施用的Thl應答在鼻內(nèi)或皮下施用后，在12周的過程中 測量了肺、脾和各自的引流淋巴結中分泌干擾素_ Y (IFN- y )、IL-2和IL-4的抗原特異 性T細胞的頻率和分布。如上所述分離了細胞，并且獲得的細胞的總數(shù)量不依賴于所進行的免疫的類型。根據(jù)制造商的實驗方案，通過IFN-Y、IL-2和IL-4ELISP0T測定試劑盒 (BD-Biosciences, San Diego，CA)，在鼻內(nèi)和皮下兩種BCG免疫(圖1)之后在肺和脾中評 估了結核分枝桿菌WCL特異性IFN- y、IL-2和IL-4應答。在評估的所有三個時間點，在肺和引流CLN中發(fā)現(xiàn)鼻內(nèi)免疫之后比皮下免疫之后 有更多的分泌IFN-γ、IL-2和IL-4的細胞，除了在12周時間點時，在肺中觀察到在皮下 BCG免疫之后比鼻內(nèi)免疫之后有更多的分泌WCL特異性IL-4的SFU(ρ < 0.0001)。相反 地，在評估的所有時間點，在引流側面(接種位點)的ILN中和脾中皮下BCG免疫比鼻內(nèi)免 疫誘導更高的WCL特異性IFN-γ、IL-2和IL-4應答，除了對于IFN-γ和IL-2，其中在12 周時間點時，在鼻內(nèi)組的脾中觀察到比皮下組更高的WCL特異性SFU(對于IFN- γ和IL-2 分別地P < 0. 01和0. 05)。實施例7單獨BCG免疫之后一氧化氮的產(chǎn)生如Sable，S等人，Eur Respir J，2007 ；29 337-346所述的，通過使用亞硝酸鈉標準物的Griess測定來測量作為一氧化氮(NO)產(chǎn)生的 指示物的培養(yǎng)的細胞的上清液中亞硝酸鹽(N02_)的積累。在37°C下培養(yǎng)96h之后用10 μ g πιΓΜα、大腸桿菌LPS-TLR-4配體(InvivoGen，San Diego, CA)或單獨的RPMI培養(yǎng)基刺激 的每種條件的1 X IO6個細胞ml—1的上清液(100 μ 1)被一式三份地測定，并在550nm處測 量吸光度。用BCG鼻內(nèi)免疫的小鼠肺細胞培養(yǎng)物的WCL刺激在所有三個時間點上產(chǎn)生了顯著 高于鼻內(nèi)稀釋免疫的(P < 0. 0001)或皮下BCG免疫的(P < 0. 0001)小鼠的亞硝酸鹽水平 (圖3A)。皮下BCG之后在脾細胞培養(yǎng)物中的WCL誘導的亞硝酸鹽水平在所有三個時間點 (P < 0. 0001)上顯著高于皮下稀釋免疫所觀察到的，以及在3周(ρ < 0. 0001)和6周(ρ <0.05)時間點上顯著高于鼻內(nèi)BCG免疫之后所觀察到的。然而，在12周時間點上，與皮 下BCG免疫相比，鼻內(nèi)BCG免疫誘導了脾中增加的WCL特異性亞硝酸鹽水平(ρ < 0. 05)，雖 然在每個情況下的水平相對低(圖3Α)。此外，發(fā)現(xiàn)在12周時鼻內(nèi)BCG免疫之后的胸廓和腹膜滲出液細胞在用WCL刺激之 后產(chǎn)生比皮下BCG免疫之后分離的那些水平顯著更高(ρ < 0. 0001)的亞硝酸鹽水平(圖 3Β)。在免疫后6和30周使用ELISP0T和淋巴細胞增殖以及兩個結核分枝桿菌抗原制 劑STCF和WCL評估了鼻內(nèi)BCG免疫在各種局部免疫區(qū)室和遠部免疫區(qū)室中誘發(fā)分枝桿菌 特異性ThKIFN-γ和IL-2)和Th2(IL-4)細胞因子應答的能力。從不同位置分離的細胞以IX IO6個細胞/ml接種在含有100 μ 1補充的RPMI-1640 的無菌96孔平底組織培養(yǎng)板中(Costar，Corning，NY)。以5 1淋巴細胞/DC使用了 BM 衍生的樹突狀細胞(DC)。對每個處理組，一式三份地或或一式四份地用100 μ 1補充的RPMI 中10 μ g/ml的純化的重組結核分枝桿菌抗原、抗原組合、WCL、STCF或Con-A作為細胞生活 力和反應性的陽性對照、或者單獨的培養(yǎng)基作為陰性對照激發(fā)細胞。在37°C下含有5% CO2 的潮濕氣氛中將培養(yǎng)物培養(yǎng)72h。向各孔加入1 μ Ci的3H-胸腺嘧啶核苷(Perkin Elmer, Wellesley，MA)，并在培養(yǎng) 18_20h 后在玻璃纖維濾器(Perkin Elmer, ffellesley, MA)上使 用自動細胞收集器(T0MTEC，Inc. Hamden, CT)來收集細胞。一旦干燥，使用β -閃爍計數(shù) 器(Perkin Elmer, ffellesley, ΜΑ)對摻入的放射性進行計數(shù)。增殖表示為在減去不含抗原的培養(yǎng)物的每分鐘的平均計數(shù)(CPM)之后的抗原刺激的培養(yǎng)物的每分鐘的平均計數(shù)，并 且通過將抗原刺激的孔中每分鐘的平均計數(shù)除以未刺激的孔中每分鐘的平均計數(shù)來計算 刺激指數(shù)(Si)。鼻內(nèi)BCG免疫在肺、排空鼻道的局部淋巴結(即CLN)和脾中誘導了 STCF和WCL 二者特異性的長期T細胞應答(圖4)。在MLN中免疫6周后還觀察到強的細胞因子應答， 所述MLN使胃腸道排空。然而，MLN中STCF和WCL特異性應答在30周降低。在鼻內(nèi)BCG 免疫之后，腹膜滲出液細胞(PEC)顯示了自6周至30周的分泌STCF和WCL特異性Thl和 Th2細胞因子的細胞的應答的增加。從6周至30周，骨髓中分泌STCF和WCL 二者特異性的 IFN- γ和IL-2的SFU也增加了，而從6周至30周，WCL特異性IL-4SFU減少了。NALT顯 示了在早期(在6周SI分別為12. 15和18. 60 ；未刺激的培養(yǎng)物的平均CPM為720)和晚 期(在30周SI分別為10. 26和12. 52 ；未刺激的培養(yǎng)物的平均CPM為660)時間點的STCF 和WCL 二者特異性的增殖。STCF和WCL特異性的抗體異型(IgG和IgA)和同種型(IgGl和IgG2a)水平在鼻 內(nèi)BCG免疫的小鼠的血清、鼻灌洗液和尿中進行評估。在30周，通過鼻內(nèi)途徑的免疫誘發(fā) 了與6周時間點相比顯著升高的抗原特異性抗體應答(圖5)，并且其特征為在血清中占優(yōu) 勢的抗原特異性IgG異型水平以及鼻灌洗液和尿中占優(yōu)勢的IgA水平。實施例8鼻內(nèi)BCG免疫之后由結核分枝桿菌的多肽誘發(fā)的IFN-γ應答評估了結核分枝桿 菌的多肽在3和30周被T和B淋巴細胞識別的能力，并在圖6中對其說明。在3周時間點處，肺和CLN中所有抗原的識別比來自脾的細胞中的高。在被評估的 所有抗原中，Apa在3周時誘發(fā)最強的IFN- Y應答，而GroEL在30周時誘發(fā)最強的IFN- γ 應答。通常，與Apa或GroEL誘發(fā)的那些相比，Ag85A、Ag85B、Pst_Sl和GroES誘發(fā)的IFN- γ 應答是中等的。在評估的所有時間點上，與GroEL誘發(fā)的應答相比，Apa誘發(fā)的IL-2應答 是低的。在30周時在MLN、PEC和BM中評估的抗原識別模式與在肺、CLN和脾中觀察到的 相似(圖5)，雖然抗原特異性應答的大小在器官到器官之間變化。在3周時，血清、鼻灌洗液和尿中抗原特異性的異型和同種型應答是低的。然而， 在30周時，觀察到的最強的抗體應答是針對Ag85復合物蛋白(對于Ag85B，平均血清IgG A492是1. 189士0. 009)接著是Pst-Sl，而與其余抗原(平均A492 < 0. 1)相比，Apa特異性抗 體應答(平均A492范圍是0. 3-0. 1)是中等的。實施例9多組分多肽接種之后T細胞和抗體的應答圖7中說明了在用單獨多肽進行體外 刺激之后在不同免疫區(qū)室中分泌Thl和Th2細胞因子的細胞的頻率。在用多肽多組分混 合物-DDA-MPL鼻內(nèi)免疫之后，如ELISP0T (圖7)和T細胞增殖(3H-胸腺嘧啶核苷攝取) 測定所評估的，肺的T淋巴細胞比衍生自其他器官的那些更強地識別所有九種多肽。在肺 水平上在誘導分泌IFN- γ的細胞的方面單獨多肽的識別順序是Apa > MPT-64 > Dnak > Pst-Sl > GroEL > GroES > Ag85A > Ag85B > CFP-IO0 除了 NALT、MLN 和 BM 之外，在被評 估的所有免疫區(qū)室中抗原識別模式是相似的。雖然在免疫之后Apa在大多數(shù)位點上誘導了 產(chǎn)生IFN-γ和IL-4 二者的細胞，但是分泌IL-2的細胞的頻率是低的。另一方面，據(jù)觀察 Ag85復合物(A和B)、Pst-Sl和Dnak是分泌IL-2的細胞的突出的誘導劑。
測量單獨多肽對細胞因子的誘導的基于微球體的細胞因子多重免疫測定的結果 表明，作為對Apa刺激的響應，在肺細胞培養(yǎng)物上清液中分泌了升高水平的IL-12(p70)、 TNF-α、GM-CSF、IL-4和IL-10。在評估的純化的抗原中，Ag85A、Ag85B和Pst-Sl誘導了最 強的IL-2應答，而Apa產(chǎn)生的IL-2水平是最低的(表2)。評估了在多組分亞單位免疫之后單獨多肽誘導細胞毒性T細胞應答的能力。如所 觀察到的靶細胞對中性紅的攝取的減少(數(shù)據(jù)未顯示)，只有Apa誘導了顯著的巨噬細胞細 胞毒性(平均百分比細胞毒性30% )。表2
釋放的細 胞因子 (pg/ml)用于體外刺激的蛋白無 AgAg25AAg85BMDT-64PxBlAgaGroESGroELDeakCFP-16混合 物SFCFWCLIL-218.4859.3863.4424.1738.9176.6535.4393.5659.9367.6700.0609.0778.0IL-12 (p70)BDL4.28’324.03.024.0BDL8.34.2BDL16.220.131.7TNF-α4.123.232.747.032.747.527.942.223.213.756.552.9258.6GMCSF75.0130.1161.1162.2111.9203.9.336.4106.2157.596.3594.7467.3753.6IL-42.933.324.942.120.367.933.816.214.715.754.035.044.0IL-5193.7267.1352.9266.7118.6203.6212.8148.4382.1209.1745.4579.7876.5IL-1043.951,365.855.043.9102.951.351.362.243.9131.5156.0399.1實施例10在鼻內(nèi)多組分免疫之后的多肽特異性抗體應答鼻內(nèi)免疫主要地誘導了血清中的 免疫原特異性IgG水平，而在鼻灌洗液中觀察到IgA和IgG 二者的水平(圖8)。Apa在鼻 灌洗液、血清和尿中分別誘導了顯著的IgA、IgGl和IgG2a同種型應答。Pst_Sl、Ag85B和 Ag85A還誘導了強的體液應答。實施例11在BCG免疫之后Apa擴展的淋巴細胞對感染的巨噬細胞中結核分枝桿菌的抑制 如Worku和Hoft ,Infect Immun,2003 ；71 1763-1773所述的并作下述修改，進行了抗原擴 展的效應T淋巴細胞對巨噬細胞中細胞內(nèi)結核分枝桿菌生長的體外作用。通過在24孔板 (Costar, Cambridge, Mass.)中培養(yǎng)腹膜滲出液細胞制備了來自BCG免疫的或假免疫的小 鼠的腹膜巨噬細胞，并允許巨噬細胞在腹膜T細胞存在下于37°C分化5天。5天后，通過輕 輕沖洗除去未粘附的細胞以獲得粘附的巨噬細胞群體。在單獨的RPMI培養(yǎng)基中將來自BCG 免疫的或假免疫的小鼠的效應細胞、肺細胞和脾細胞(2X IO5個細胞/ml)培養(yǎng)5天以用作 靜止的(rested) T細胞陰性對照，或者將其用WCL (20 μ g/ml)或Apa(IOygAil)在24孔板 中刺激5天。在第6天，用結核分枝桿菌以1的感染復數(shù)(multiplicity of infection)將 巨噬細胞感染。4小時后，通過低速離心(< 1，OOOrpm)除去細胞外桿菌，并將巨噬細胞重 新懸浮于新鮮的培養(yǎng)基中。在96孔板(ΙΟΟμΙ/孔)中以IX IO6個細胞/ml接種感染的巨 噬細胞，并將其與未粘附的肺或脾效應細胞(100 μ 1/孔)以1 1的比例在37°C、5%C02 下共同培養(yǎng)72小時。在72h通過用0.06%的十二烷基硫酸鈉(Sigma-Aldrich，St. Louis， MO)裂解巨噬細胞15分鐘來進行CFU的計算。來自每孔的溶胞產(chǎn)物的3組連續(xù)10倍稀釋 物在0. 05%吐溫-80 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)中被制備，并被鋪板在7H11瓊脂上。 在37°C下用5% CO2培養(yǎng)3-4周后對菌落進行計數(shù)。使用下式來確定結核分枝桿菌生長抑 制的百分比抑制百分比=100-[100X [(來自抗原刺激的T細胞的CFU)/(來自培養(yǎng)基靜止的T細胞的CFU)]]。鼻內(nèi)BCG免疫6周后分離并用Apa擴展的肺T細胞展現(xiàn)了與只用培養(yǎng)基擴展的T 細胞相比對腹膜巨噬細胞中結核分枝桿菌生長的更大的抑制(圖9)。此外，該抑制比皮下 BCG免疫之后分離的肺細胞所帶來的抑制顯著地更高(ρ < 0. 01)。實施例12用單組分疫苗鼻內(nèi)免疫之后增殖應答的誘導在用包含用陽離子脂質(zhì)體封裝的 多肽的單個或多個多肽的疫苗鼻內(nèi)免疫之后，評估了單獨的多肽在從肺、CLN或脾分離的 細胞中誘導增殖應答的能力。作為增殖應答的量度，評估了 3[h]-胸腺嘧啶核苷摻入。在 用代表性多肽體外刺激之后，肺細胞顯示了比從脾分離的細胞更高的摻入(圖10)。多肽 Rv0831c和Rvl324在不同的靶器官中誘導了相當?shù)脑鲋硲?，而?和4周時間點上評估 的由Rv0164誘導的應答是低的。在鼻內(nèi)免疫之后，用編碼Apa的多肽的免疫還誘導強的增 殖應答，其二者在免疫2周后都被觀察到。在用Rv0831c、Rvl324和Rv0164(10yg每種蛋白/劑)的組合進行免疫之后， Rv0831c和Rvl324在體外刺激后的靶器官培養(yǎng)物中誘導了比Rv0164顯著更好的增殖(圖 11)。實施例13單或多組分鼻內(nèi)免疫之后分泌免疫原特異性細胞因子的細胞的頻率通過如之前 的實施例中所述的ELISP0T評估了 Rv0831c、Rvl324或Rv0164誘導分泌Thl和Th2細胞因 子的細胞的能力。在免疫后2和4周，用Rv0831c的鼻內(nèi)免疫顯示了與用Rvl324或Rv0164 的免疫相比更高數(shù)目的分泌IFN- y、IL-2和IL-4的細胞(圖12)。用Apa的免疫產(chǎn)生高 水平的分泌Thl和Th2細胞因子的細胞。在評估的三個器官中，單獨的分泌免疫原特異性 細胞因子的細胞的頻率在肺的水平上較高，其與增殖測定的結果是可比的。當三種多肽通過鼻內(nèi)共同施用時，Rv0831c比Rvl324和Rv0164誘導了更高數(shù)目的 分泌細胞因子的細胞。在肺中觀察到的水平對于Apa蛋白來說比Rv0831c高兩倍以上(比 較圖7和12)。實施例14在單或多組分鼻內(nèi)免疫之后血清和鼻灌洗液中的免疫原特異性的異型和同種型 應答在免疫之后2和4周通過ELISA測量了異型和同種型免疫球蛋白應答。簡言之，估計 了對純化的重組抗原和抗原組合有特異性的總免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)和 IgG同種型IgGl和IgG2a。在100 μ 1包被緩沖液(0. 05Μ碳酸鹽，ρΗ 9. 5)中以濃度2 μ g/ ml懸浮的單獨的抗原或抗原混合物在37°C下2h允許結合至MaxiSorp的ELISA板(Nalge Nunc International, Rochester, NY)的孔中。在用 PBS-T 沖洗三次后，在 4°C下在 PBS-T 中 用3%的牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich，St. Louis,M0)將孔阻斷過夜。在含有BSA 的PBS-T中分別以1 200或1 100稀釋度向每孔中加入血清或鼻灌洗液樣品(ΙΟΟμΙ)。 在37°C下允許抗原抗體結合進行2h。用PBS-T將板沖洗4次，并向相應孔中加入在含有1 % BSA的PBS-T中1 1，000稀釋的100μ 1的偶聯(lián)辣根過氧化物酶的抗小鼠二抗(抗小鼠 IgG 和 IgA，Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 和抗小鼠 IgG 1 和 IgG2a，BD-Biosciences，San Diego, CA) 0 90min后用PBS-T將板沖洗6次。用檸檬酸鹽底物緩沖液(ρΗ 5.0)中的鄰苯 二胺(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)和過氧化氫將反應顯色。20min后通過加入100 μ 1的IM H2SO4終止反應，并在492nm下測量吸光度(A492)。用Rvl324的免疫顯示了超過對Rv0831c和Rv0164所觀察到的強的免疫原特異性 抗體應答(圖13)。鼻內(nèi)Rvl324免疫誘導的抗體應答特征為在2和4周時間點所評估的血 清中具有IgGl和IgG2a同種型二者水平的強的免疫原特異性IgG應答以及鼻灌洗液中具 有顯著的IgGl同種型水平的混合的IgA和IgG應答。用陽離子脂質(zhì)體封裝的Rvl324鼻內(nèi)免疫的小鼠的血清和鼻灌洗液中Rvl324特異 性的異型和同種型的滴定度隨后在2周時間點評估并描繪于圖14中。實施例15-基于天然和重組的Apa的實驗性亞單位疫苗在小鼠中的免疫原性對于亞單位接種，單獨地使用10 μ g的天然結核分枝桿菌Apa、重組大腸桿菌表達 的Apa或重組的Ag85A[在二甲基雙十八烷基溴化銨(DDA ；250 μ g/劑，Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)和單磷酰脂A (產(chǎn)生自明尼蘇達沙門氏菌Re 595的MPL ；25 μ g/齊[J， Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)中單獨地乳化的10 μ g的每種免疫原]以2周的間隔通過 鼻內(nèi)途徑將BALB/c小鼠免疫三次。首先將MPL與含有0.2%三乙胺(Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)的不含內(nèi)毒素的無菌水(Burdick&Jackson，Muskegon, MI)混合。在 70°C 水浴中將混合物加熱30s，然后超聲處理30s。加熱和超聲步驟重復兩次。為了制備乳液， 將DDA懸浮于無菌水中并通過在水浴中在80°C下將懸液加熱5-lOmin來獲得均勻的粉末 分散。冷卻至室溫之后，就在使用之前將MPL和抗原與DDA混合。假免疫的小鼠接受了在 DDA-MPL 中乳化的 PBS (pH 7. 2)。接種后，在麻醉中通過心臟穿刺將小鼠放血并在免疫之后2和4周處死。肺、 脾和頸部淋巴結(CLN)被無菌地摘除并置于補充了 100IU/ml青霉素、50 μ g/ml鏈霉素、 ImML-谷氨酰胺、25mM HEPES、ImM丙酮酸鈉、5X ICT5M β -巰基乙醇、維生素和非必需氨 基酸(Gibco-Invitrogen，Grand Island, NY)和10%的內(nèi)毒素測試的熱滅活的胎牛血清 (FCS ；Atlas Biologicals, Fort Collins, CO)的 RPMI 1640 中。在每種情況下，對于每個 處理組，從4只小鼠收集了相應的淋巴樣器官或淋巴樣器官以外的器官(extra-lymphoid organ)，并且提取了細胞以分析體外結核分枝桿菌抗原特異性細胞應答。使用從每個處理 組收集的集中的鼻灌洗液和血清評估了抗原特異性抗體應答。為了分離肺細胞，在麻醉中通過心臟穿刺將小鼠放血并用含有10U ml—1的肝素的 PBS通過右室灌流它們的肺以除去血管內(nèi)的白血球。然后用補充的RPMI中的含有l(wèi)mg/ml 膠原酶 IV 型(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)和 25U πιΓ1 的 DNA 酶(Roche, Penzberg，德 國)的酶混合物對肺灌流并在無菌皿中將其切成小片，并且在37°C下將片段在酶混合物中 溫育lh。將消化的肺片段用5ml注射器活塞擠壓穿過70 μ m孔徑的細胞過濾器(BD Falcon, Bedford,ΜΑ)以獲得單細胞懸液，并且用RBC裂解緩沖液(eBioscience，San Diego, CA)將 紅細胞在室溫下裂解4-5min。將肺細胞沖洗，通過離心回收并在補充的RPMI中重新懸浮以 使用臺盼藍染料排除方法計數(shù)。通過將相應器官輕輕地研磨穿過70 μ m孔徑的細胞過濾 器進入10-20ml的補充的RPMI來獲得脾和淋巴結的單細胞懸液。以300Xg將細胞懸液離 心lOmin，并在必要時通過用RBC裂解緩沖液處理來除去紅細胞。用新鮮的RPMI將細胞沖 洗幾次并相應地調(diào)節(jié)細胞濃度。根據(jù)制造商的方案，使用了商業(yè)上可得的干擾素(IFN)-Y、IL-2、IL_4(小鼠 ELISP0T 組；BD-Biosciences，San Diego, CA)和 IL-17 (小鼠 ELISP0T 組；eBioscience)來計算結核分枝桿菌抗原特異性細胞的頻率。簡言之，用ΙΟΟμΙ的PBS(pH 7.2)中的5yg/ ml捕捉抗體將96孔ELISP0T板進行包被并在4°C下溫育過夜。用含有10% FCS的200 μ 1 補充的RPMI在室溫下2h將游離的結合位點阻斷。對于所有位點將細胞濃度調(diào)節(jié)至1X IO6 和2X IO6個細胞/ml并加入適當?shù)目字?。如之前對抗原性或免疫原性研究所述的，未?入BM衍生的DC或巨噬細胞以補充已經(jīng)存在于細胞懸液中的抗原呈遞細胞。對于每個處理 組，用在100 μ 1體積中的10 μ g/ml的單獨的純化的結核分枝桿菌抗原、WCL、伴刀豆球蛋白 A(Con-Α ；Sigma-Aldrich, St. Louis, M0)或單獨的培養(yǎng)基一式三份地刺激了細胞。在37°C 的含有5% CO2的潮濕氣氛下溫育36h之后，將未附著的細胞從孔中吸走，并用蒸餾水裂解 余下的細胞。用含有0.05%吐溫-20 (PBS-T)的PBS將孔再次沖洗，并用標記了生物素的抗 小鼠細胞因子抗體和偶聯(lián)了辣根過氧化物酶的鏈霉抗生物素蛋白檢測細胞因子分泌的位 點。使用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)底物試劑組(BD-Bioscience，San Diego, CA)對酶反 應顯色。使用 ELISP0T 讀數(shù)器(Cellular Technology Limited, Cleveland, OH)來對每孔 中斑點形成單位(spot forming unit, SFU)的數(shù)目進行計數(shù)。如ELISP0T測定所評估的，在免疫后4周，使用DDA-MPL佐劑中天然的或重組的 Apa對小鼠的免疫在肺、頸部淋巴結(CLN)和脾中誘導了相當?shù)腡hl(IFN-Y和IL-2)(圖 15)、Th2(IL-4)和Thl7(IL-17)(圖16)細胞因子應答。在圖15中，結核分枝桿菌的天然 Apa(nApa)、重組APA (rApa)、重組Ag85A (rAg85A)和對照DDA-MPL佐劑在用各自的蛋白亞單 位疫苗或單獨的DDA-MPL佐劑進行鼻內(nèi)免疫的BALB/c小鼠中對肺、頸部淋巴結(CLN)或脾 細胞誘發(fā)Thl應答(IFN-Y和IL-2)的可比較的能力。鼻內(nèi)rAg85A-DDA-MPL亞單位接種用 作評估天然或重組Apa的免疫原性的陽性對照。免疫之后四周(用于接種的小鼠的結核分 枝桿菌激發(fā)的時間點)，通過ELISP0T計算了肺、頸部淋巴結(CLN)和脾中分泌抗原特異性 ThKIFN-Y和IL-2)細胞因子的細胞的頻率并表示為斑點形成單位(SFU)/器官的百萬個 細胞。結果顯示為3至6次測定的平均值士標準偏差。在圖16中，結核分枝桿菌的天然 Apa、重組ΑΡΑ、重組Ag85A和對照DDA-MPL在用各自的蛋白亞單位疫苗或單獨的DDA-MPL 佐劑進行鼻內(nèi)免疫的BALB/c小鼠中對肺、CLN和脾細胞誘發(fā)Th2或Thl7應答的可比較的 能力。免疫之后四周，通過ELISP0T測定計算了肺、頸部淋巴結(CLN)和脾中分泌抗原特異 性Th2(IL-4)和Thl7(IL-17)細胞因子的細胞的頻率并表示為斑點形成單位(SFU)/器官 的百萬個細胞。結果顯示為3至6次測定的平均值士標準偏差。天然或重組Apa誘導的T 細胞應答與rAg85A免疫所誘導的那些也是可比的。在用活的牛分枝桿菌BCG體外刺激各 自的肺、CLN和脾細胞培養(yǎng)物之后也未觀察到在三種疫苗免疫的組中誘導T細胞(Thl、Th2 和Thl7)應答的差異，這表明三個疫苗組在結核分枝桿菌遭遇或體內(nèi)實驗激發(fā)之后可能誘 導相似的T細胞細胞因子應答(圖17和18)。在圖17中，在肺、頸部淋巴結(CLN)和脾細 胞培養(yǎng)物中免疫4周后，用牛分枝桿菌BCG體外激發(fā)之后亞單位免疫及假免疫的小鼠的肺、 CLN和脾細胞培養(yǎng)物中分泌ThKIFN-γ和IL-2)細胞因子的細胞的頻率。在不含抗生素 的情況下用活的牛分枝桿菌BCG哥本哈根CFU來刺激各自的器官細胞培養(yǎng)物(1 10的比 例)36小時。通過ELISP0T測定計算了分泌IFN- γ和IL-2的細胞并表示為斑點形成單位 (SFU)/器官的百萬個細胞。結果顯示為3至6次測定的平均值士標準偏差。對于使用本發(fā)明必要的所有試劑是從本領域已知的來源可得的，或者通過本文所 述的技術或通過本領域公認的方法所容易合成的。
所引用的或本文所另外呈現(xiàn)的參考文獻指示本發(fā)明所涉及的領域的技術水平。這 些參考文獻特此通過引用被并入，如同每份單獨的參考文獻被清楚地和單獨地并入本文一 樣。參考文獻1. Anonymous. 2006. Emergence of Mycobacterium tuberculosis with extensive resistance to second-line drugs—worldwide,2000-2004. Centers for Disease Control and Prevention. MMWR 55:301-305·2. Agger, Ε. Μ. , and P. Andersen. 2002. A novel TB vaccine ；towards a strategy based on our understanding of BCG failure. Vaccine 21 :7_14·3. Andersen，P.，and T. M. Doherty. 2005. The success and failure of BCG-implications for a novel tuberculosis vaccine. Nat Rev Microbiol 3:656—662.4. Arulanandam，B. P.，R. H. Raeder, J. G. Nedrud，D. J. Bucher, J. Le, and D. W. Metzger. 2001. IgA immunodeficiency leads to inadequate Th cell priming and increased susceptibility to influenza virus infection. J Immunol 166:226—231·5. Asanuma, H. , A. H. Thompson, T. Iwasaki, Y. Sato, Y. Inaba, C. Aizawa, T. Kurata, and S. Tamura. 1997. Isolation and characterization of mouse nasal-associated lymphoid tissue. J Immunol Methods 202:123-131.6. Beatty，W. L.，and D. G. Russell. 2000. Identification of mycobacterial surface proteins released into subeellular compartments of infected macrophages. Infect Immun68 :6997_7002.7. Carpenter,Z. K. ,E. D. Williamson, and J. E. Eyles. 2005. Mucosal delivery of microparticle encapsulated ESAT_6induces robust cell-mediated responses in the lung milieu. J Control Release 104:67—77.8. Cas tan on-Arr eo la, M.，Y. Lopez-Vidal, C. Espi t ia-Pinzon，and R. Hernandez-Pando. 2005. A new vaccine against tuberculosis shows greater protection in a mouse model withprogressive pulmonary tuberculosis. Tuberculosis(Edinburgh，Scotland)85 :115_126.9. Chen，L，J. Wang，A. Zganiacz, and Z. Xing. 2004. Single intranasal mucosal Mycobacterium bovis BCG vaccination confers improved protection compared to subcutaneous vaccination against pulmonary tuberculosis. Infect Immun 72 238-246.10. D ' Souza，S.，V. Rosseels，0. Denis，A. Tanghe, N. De Smet，F(xiàn). Jurion， K. Palfliet，N. Castiglioni，A. Vanonckelen，C. Wheeler, and K. Huygen. 2002. Improved tuberculosis DNAvaccines by formulation in cationic lipids. Infect Immun 70 3681-3688.11. Denis, 0.，Ε. Lozes, and K. Huygen. 1997. Induction of cytotoxic T-cell responses against culture filtrate antigens in Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin-infected mice. Infect Immun 65 :676_684.12. Di Rosa，F(xiàn).，and R. Pabst. 2005. The bone marrow :a nest for migratorymemory T cells. Trends Immunol 26:360—366.
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權利要求
一種疫苗，包含Ag85A、Ag85B、MPT 64、Pst S1、Apa、GroES、GroEL、Dnak、CFP 10、Rv0831c、Rv1324中的至少一種結核分枝桿菌多肽或其免疫原性部分、肽或表位。
2.如權利要求1所述的疫苗，其中所述多肽是重組的。
3.如權利要求1所述的疫苗，其中所述多肽是Apa。
4.如權利要求1所述的疫苗，其中所述多肽是Rvl324。
5.如權利要求1所述的疫苗，其中所述多肽是Rv0831c。
6.如權利要求1所述的疫苗，其中所述多肽還包含適合純化的標簽。
7.如權利要求1所述的疫苗，還包含佐劑。
8.如權利要求8所述的疫苗，其中所述佐劑是二甲基雙十八烷基溴化銨(DDA)；單磷 酰脂A(MPL) ；LTK63,親脂性季銨鹽-DDA，海藻糖二分枝酸酯和合成的衍生物，DDA-MPL， DDA-TDM，DDA-TDB，IC-31，鋁鹽，氫氧化鋁，磷酸鋁，磷酸鋁鉀，Montanide ISA-51, ISA-720, 微顆粒，免疫刺激復合物，脂質(zhì)體，病毒體，病毒樣顆粒，CpG寡核苷酸，霍亂毒素，來自大腸 桿菌的不耐熱的毒素，脂蛋白，樹突狀細胞，IL-12，GM-CSF，說明性地包括磷酸鈣納米顆粒 的納米顆粒，用以形成納米乳液的大豆油、乳化劑和乙醇的組合；AS04，ZADAXIN或其組合。
9.如權利要求8所述的疫苗，還包含乳化劑或成膠囊劑。
10.如權利要求10所述的疫苗，其中所述乳化劑是超分子生物載體(SMBV)、納米顆粒、 脂質(zhì)體或其組合。
11.一種藥物包，包含單獨的或與BCG疫苗組合的根據(jù)權利要求1所述的疫苗；乳化劑；和佐劑。
12.如權利要求12所述的藥物包，其中所述佐劑是二甲基雙十八烷基溴化銨(DDA)；單 磷酰脂A (MPL) ；LTK63,親脂性季銨鹽-DDA，海藻糖二分枝酸酯和合成的衍生物，DDA-MPL， DDA-TDM，DDA-TDB，IC-31，鋁鹽，氫氧化鋁，磷酸鋁，磷酸鋁鉀，Montanide ISA-51，ISA-720， 微顆粒，免疫刺激復合物，脂質(zhì)體，病毒體，病毒樣顆粒，CpG寡核苷酸，霍亂毒素，來自大腸 桿菌的不耐熱的毒素，脂蛋白，樹突狀細胞，IL-12，GM-CSF，說明性地包括磷酸鈣納米顆粒 的納米顆粒，用以形成納米乳液的大豆油、乳化劑和乙醇的組合；AS04，ZADAXIN或其組合。
13.如權利要求12所述的藥物包，其中所述乳化劑是超分子生物載體(SMBV)、納米顆 粒、脂質(zhì)體或其組合。
14.一種在受治療者細胞組織中產(chǎn)生免疫應答的方法，包括向受治療者施用第一疫苗， 所述第一疫苗為根據(jù)權利要求1、8或10所述的疫苗。
15.如權利要求15所述的方法，還包括施用第二疫苗。
16.如權利要求16所述的方法，其中所述第二疫苗是根據(jù)權利要求1、8或10所述的疫 苗、BCG或其組合。
17.如權利要求17所述的方法，其中所述第一疫苗的施用是在所述第二疫苗的施用之、r -
18.如權利要求17所述的方法，其中所述第一疫苗的所述施用是在所述第二疫苗的施 用之后，而且所述第二疫苗是BCG。
19.如權利要求17所述的方法，其中所述第一疫苗的所述施用與所述第二疫苗同時。
20.如權利要求15所述的方法，其中所述第一疫苗的所述施用是在受治療者細胞組織 暴露于結核分枝桿菌之后。
全文摘要
本發(fā)明提供一種疫苗，其中來自結核分枝桿菌(M.tuberculosis)的多肽或肽的組合施用于受治療者以引發(fā)免疫應答。多肽疫苗作為使用BCG疫苗的初免-加強(prime-boost)策略的一部分進行施用以增加受治療者中的免疫保護，以便實現(xiàn)疾病的預防或消除。最后，提供一種藥物包，其包括當施用于受治療者時引發(fā)免疫保護的結核分枝桿菌多肽疫苗。
文檔編號C07K16/12GK101969976SQ200980108839
公開日2011年2月9日 申請日期2009年1月12日 優(yōu)先權日2008年1月11日
發(fā)明者托馬斯·M·欣尼克, 拉瑪·羅亞·阿瑪拉, 蘇拉吉·塞布爾, 邦尼·B·普利卡亞蒂斯, 馬尼·舍呂武 申請人:美國政府健康與人類服務部秘書處