專(zhuān)利名稱(chēng)：疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的核酸構(gòu)建體，可用于核酸接種方法，用于治療和預(yù)防表達(dá)MUC-1的腫瘤。具體地講，所述核酸是DNA，所述DNA構(gòu)建體包括編碼MUC-1衍生物的基因，任選地缺少所有完全的重復(fù)。更具體地講，對(duì)所述核酸進(jìn)行修飾，以便降低與野生型Muc-1的同源性。本發(fā)明還提供了包括所述構(gòu)建體的藥物組合物，特別是適合顆粒介導(dǎo)的送遞的藥物組合物，生產(chǎn)所述組合物的方法，以及它們?cè)卺t(yī)學(xué)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
上皮細(xì)胞粘蛋白MUC-1(又被稱(chēng)作episialin或多形上皮粘蛋白，PEM)是在很多上皮細(xì)胞上表達(dá)的大分子量糖蛋白。所述蛋白由細(xì)胞質(zhì)尾巴，跨膜結(jié)構(gòu)域和具有20個(gè)氨基酸基序(以下稱(chēng)之為VNTR單體，還可稱(chēng)之為VNTR表位或VNTR重復(fù))的不同數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)組成，所述串聯(lián)重復(fù)含有大比例的脯氨酸，絲氨酸和蘇氨酸殘基。由于在MUC-1基因座上的遺傳多態(tài)性，重復(fù)的數(shù)量是可變的，并且最常見(jiàn)的是在30-100的范圍內(nèi)(Swallow等，1987，Nature 32882-84)。在正常導(dǎo)管上皮細(xì)胞中，MUC-1蛋白僅存在于暴露于管腔的細(xì)胞的頂面上(Graham等，1996，Cancer Immunol Immunother 4271-80；Barratt-Boyes等，1996，Cancer Immunol Immunother 43142-151)。MUC-1分子的最突出的特征之一是它的廣泛的O-連接的糖基化。在每一個(gè)MUC-1 VNTR單體內(nèi)，有五個(gè)可利用的O-連接的糖基化位點(diǎn)。
VNTR以典型的或完全的重復(fù)和不完全的(非典型的)重復(fù)為特征，對(duì)于在20個(gè)氨基酸中包括2-3個(gè)差別的完全的重復(fù)來(lái)說(shuō)，具有很小的變化。以下是完全重復(fù)的序列。
1 2 3 4 5 8 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20A PDTR P A P G S T A PPA H G V T SE S TAQ加下劃線的氨基酸可以用所示出的氨基酸殘基取代。所述完全的重復(fù)是相同的重復(fù)序列，特定的氨基酸取代除外(即，3號(hào)位置上D→E，4號(hào)位置上T→S，和14號(hào)位置上P→T、A或Q)。完全的重復(fù)以以下事實(shí)為特征，即在單個(gè)MUC1分子內(nèi)它們能夠出現(xiàn)很多次。
不完全的重復(fù)對(duì)上述共有序列具有不同的氨基酸取代，在氨基酸水平上具有55-90％同一性。在下面示出了四種不完全的重復(fù)，在取代下面加下劃線APDTRPAPGSTAPPAHGVTS-完全的重復(fù)APATEPASGSAATWGQDVTS-不完全的重復(fù)1VPVTRPALGSTTPPAHDVTS-不完全的重復(fù)2APDNKPAPGSTAPPAHGVTS-不完全的重復(fù)3APDNRPALGSTAPPVHNVTS-不完全的重復(fù)4野生型-Muc-1上的不完全的重復(fù)位于完全的重復(fù)區(qū)的旁側(cè)。在MUC1序列上，每一個(gè)不同的不完全的重復(fù)僅出現(xiàn)一次，并且表現(xiàn)出對(duì)完全的重復(fù)序列進(jìn)行2-9個(gè)氨基酸的取代(相當(dāng)于55-90％氨基酸同一性)。
在通過(guò)所述上皮細(xì)胞的腫瘤轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的惡性癌中，有若干變化影響MUC-1的表達(dá)。所述蛋白的極化表達(dá)喪失，并且發(fā)現(xiàn)它分布在轉(zhuǎn)化細(xì)胞的整個(gè)表面上。MUC-1的總量也增加了，通常增加了10倍或更多(Strous & Dekker，1992，Crit Rev Biochem Mol Biol 2757-92)。最顯著的是，O-連接的糖鏈的數(shù)量和質(zhì)量發(fā)生了顯著改變。有較少的絲氨酸和蘇氨酸殘基是糖基化的。發(fā)現(xiàn)所述糖鏈異常地縮短了，產(chǎn)生了與腫瘤相關(guān)的糖類(lèi)抗原STn(Lloyd等，1996，J Biol Chem，27133325-33334)。所述糖基化改變的結(jié)果是以前通過(guò)糖鏈篩選的MUC-1的肽鏈上的各種表位現(xiàn)在變得可以接觸。通過(guò)這種方式變得可以接觸的一個(gè)表位是通過(guò)存在于每個(gè)包括20個(gè)氨基酸的VNTR完全單體上的序列APDTR(Ala 8-Arg 12)形成的(Burchell等，1989，Int J Cancer 44691-696)。
很明顯的是，在MUC-1中發(fā)生的這些改變，意味著能夠激活針對(duì)在腫瘤上表達(dá)的MUC-1形式的免疫系統(tǒng)的疫苗，能夠有效抗上皮細(xì)胞腫瘤，并且，抗實(shí)際上存在MUC-1的其他細(xì)胞類(lèi)型，如T細(xì)胞淋巴細(xì)胞。被所述免疫系統(tǒng)用于殺傷表達(dá)異常蛋白的細(xì)胞的主要效應(yīng)物機(jī)制之一，是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)(CTL′s)，并且，該反應(yīng)是在治療腫瘤的疫苗和抗體反應(yīng)中所需要的。好的疫苗能夠激活免疫反應(yīng)的所有途徑。不過(guò)，現(xiàn)有的糖類(lèi)和肽疫苗，如Theratope或BLP25(Biomira Inc，Edmonton，Canada)優(yōu)先激活免疫反應(yīng)的一種途徑——分別為體液和細(xì)胞反應(yīng)，并且需要更好的疫苗設(shè)計(jì)，以便產(chǎn)生更平衡的反應(yīng)。
與常規(guī)蛋白疫苗接種相比，核酸疫苗具有多種優(yōu)點(diǎn)，其中，它們能夠方便地大量生產(chǎn)。即使是在小的劑量下，業(yè)已報(bào)導(dǎo)它們能夠誘導(dǎo)強(qiáng)的免疫反應(yīng)，并且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)以及抗體反應(yīng)。
不過(guò)，完整長(zhǎng)度的MUC-1非常難于加工，因?yàn)樗鼈兙哂懈叨戎貜?fù)的序列，這種序列很容易發(fā)生重組，這些重組事件會(huì)導(dǎo)致很大的開(kāi)發(fā)困難。另外，VNTR區(qū)的富含GC的特性，使得測(cè)序困難。另外，是由于調(diào)控原因-有必要全面表征DNA構(gòu)建體。要對(duì)具有如此高頻率重復(fù)結(jié)構(gòu)的分子進(jìn)行測(cè)序是很困難的。由于不能準(zhǔn)確地了解在野生型MUC-1中存在多少重復(fù)單位，使得不能夠準(zhǔn)確地表征完整長(zhǎng)度的MUC-1，使得它不能被接受用于調(diào)控用途。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了編碼能夠在體內(nèi)引起免疫反應(yīng)的MUC-1衍生物的核酸序列，所述免疫反應(yīng)能夠識(shí)別表達(dá)MUC-1的腫瘤，其中，所述核酸是修飾過(guò)的，以便非重復(fù)區(qū)的RSCU至少為0.6，并且與圖9所示的MUC-1VNTR核苷酸序列相比在相應(yīng)的非重復(fù)區(qū)與野生型MUC-1DNA具有低于85％的同一性。
在一種實(shí)施方案中，上述編碼MUC-1衍生物的核酸缺少任何重復(fù)(完全的和不完全的)單位。
在另一種實(shí)施方案中，所述核酸序列只缺少完全的重復(fù)。在另一種實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體包括1-15個(gè)完全的重復(fù)，優(yōu)選7個(gè)完全的重復(fù)。所述完全的重復(fù)相對(duì)野生型MUC-1而言可以是修飾過(guò)的或未修飾過(guò)的。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述不完全的重復(fù)區(qū)的RSCU(相對(duì)同義密碼子使用(又被稱(chēng)作密碼子指數(shù)CI))至少為0.65，并且與不完全的重復(fù)區(qū)相比具有低于80％的同一性。
令人吃驚的是，所述構(gòu)建體能夠引起識(shí)別表達(dá)MUC-1的腫瘤的細(xì)胞反應(yīng)和抗體反應(yīng)。
所述構(gòu)建體還可以包括改變了的重復(fù)(VNTR單位)如減弱了的糖基化突變體。可以摻入的外源T-細(xì)胞表位包括T輔助表位，如來(lái)自細(xì)菌蛋白和毒素，并且來(lái)自病毒來(lái)源，如來(lái)自白喉或破傷風(fēng)的T-輔助表位，例如，P2和P30或來(lái)自Hep B核心抗原的表位?？蓪⑺鼈儞饺氡景l(fā)明的MUC-1構(gòu)建體的任一個(gè)末端。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼具有異源蛋白的融合蛋白的核酸，它在本發(fā)明的MUC-1構(gòu)建體的N或C末端。所述融合配偶體提供了T-輔助表位，或者能夠誘導(dǎo)記憶反應(yīng)。
其例子包括破傷風(fēng)，白喉，結(jié)核或肝炎蛋白，如破傷風(fēng)或白喉毒素，特別是摻入了P2和/或P30表位的破傷風(fēng)毒素的片段。結(jié)核桿菌肽的例子是Ra12，相當(dāng)于Mtb32a的192-323號(hào)氨基酸(Skeiky等Infection and Immunity(1999)673998-4007)。乙型肝炎核心抗原是另一種實(shí)施方案的例子。
其他的優(yōu)選的免疫學(xué)融合配偶體包括蛋白D，通常是來(lái)自肺炎鏈球菌的N末端1/3(例如，N末端1-109)；LYTA或其部分(優(yōu)選C-末端部分)(Biotechnology)10795-798，1992)。
在本發(fā)明的另一方面，所述核酸序列是質(zhì)粒形式的DNA序列。所述質(zhì)粒優(yōu)選是超螺旋的。由所述核苷酸序列編碼的蛋白是新的，并且構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)方面。
在本發(fā)明的另一方面，提供了藥物組合物，它包括如上文所述的核酸序列或蛋白，以及可以藥用的賦形劑，稀釋劑或載體。
優(yōu)選的載體是金珠，并且所述藥物組合物適合通過(guò)顆粒介導(dǎo)的藥物送遞方法送遞。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于醫(yī)學(xué)中的藥物組合物和新核酸構(gòu)建體。具體地講，提供了本發(fā)明的構(gòu)建體，在生產(chǎn)藥物，用來(lái)治療或預(yù)防表達(dá)MUC-1的腫瘤中的用途。
本發(fā)明還提供了治療患有或易感于表達(dá)MUC-1的腫瘤，特別是乳腺癌，肺癌，前列腺癌(特別是非小細(xì)胞肺癌)，胃癌和其他GI(胃腸道)癌的方法，包括施用安全的和有效量的上述組合物或核酸。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)上述藥物組合物的方法，包括將本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或蛋白與可以藥用的賦形劑，稀釋劑或載體混合。
本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明野生型MUC-1分子包括信號(hào)序列，前導(dǎo)序列，不完整的或非典型的VNTR，完整的VNTR區(qū)，其他非典型的VNTR，非VNTR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
提供了構(gòu)建體，其中，非VNTR區(qū)進(jìn)行過(guò)密碼子修飾，使它的RSCU至少為0.6，并且與相應(yīng)的野生型區(qū)具有低于85％的同一性。所述構(gòu)建體是有利的-因?yàn)樗鼈兘档土送粗亟M的可能，具有增強(qiáng)了的表達(dá)，并且是免疫原性的，并且能夠產(chǎn)生識(shí)別表達(dá)MUC-1的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞和抗體反應(yīng)。
更優(yōu)選的是，所述密碼子修飾區(qū)的RSCU至少為0.65，并且與相應(yīng)的野生型區(qū)具有至少80％的同一性。在比較多核苷酸序列時(shí)，如果兩個(gè)序列中的核苷酸序列在進(jìn)行下文所述的最大相關(guān)性比對(duì)時(shí)相同，這兩種序列就被認(rèn)為是“同一的”。
兩個(gè)序列之間的比較通常是通過(guò)在比較窗上比較所述序列進(jìn)行的，以便確定并且比較具有序列相似性的局部區(qū)域。本文所說(shuō)的″比較窗″，表示具有至少大約20個(gè)連續(xù)位置的片段，通常具有30-大約75，40-大約50個(gè)連續(xù)位置，其中，在對(duì)兩種序列進(jìn)行最佳比對(duì)之后，可以將序列與具有相同數(shù)量的連續(xù)位置的參考序列進(jìn)行比較。
因此，在本發(fā)明中，用于比較的具有密碼子修飾的非重復(fù)區(qū)和具有最佳序列比對(duì)的非重復(fù)區(qū)可以通過(guò)以下方法進(jìn)行Smith和Waterman的局部同一性算法(1981)Add.APL.Math 2482，Needleman和Wunsch的同一性比對(duì)算法(1970)J.Mol.Biol.48443，Pearson和Lipman的相似性檢索方法(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444，所述算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施(Wisconsin Genetics軟件包GAP中的BESTFIT，BLAST，F(xiàn)ASTA，和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)，或通過(guò)檢查。
適合確定百分序列同一性和序列相似性的算法的一種優(yōu)選例子是BLAST和BLAST 2.0程序，分別參見(jiàn)Altschul等(1977)Nucl.AcidsRes.253389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410?？梢允褂肂LAST和BLAST 2.0，例如，采用本文所披露的參數(shù)，以便測(cè)定本發(fā)明的多核苷酸的百分序列同一性。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件，可以從National Center for BiotechnologyInformation公開(kāi)獲得。
DNA密碼具有4個(gè)字母(A，T，C和G)，并且利用這些字母拼寫(xiě)三字母“密碼子”，它們表示由生物基因編碼的蛋白中的氨基酸。將沿DNA分子的密碼子的線性序列翻譯成由所述基因編碼的蛋白中的氨基酸的線性序列。所述密碼是高度簡(jiǎn)并的，用61種密碼子編碼20種天然氨基酸，并且有三個(gè)密碼子表示“終止”信號(hào)。因此，大部分氨基酸是由一種以上密碼子編碼的——實(shí)際上有一些氨基酸是由四種或四種以上不同密碼子編碼的。
由于可以將一種以上密碼子用于編碼特定氨基酸，業(yè)已發(fā)現(xiàn)生物的密碼子使用模式是高度非隨機(jī)的。不同的物種在密碼子選擇方面表現(xiàn)出不同的偏好，另外，在同一物種中，在高水平和低水平表達(dá)的基因之間密碼子的使用可能明顯不同。這種偏好在病毒，植物，細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是不同的，并且某些物種表現(xiàn)出相對(duì)其他物種的偏離隨機(jī)密碼子選擇的更強(qiáng)的偏好。例如，人和其他哺乳動(dòng)物的偏好不如某些細(xì)菌或病毒的強(qiáng)。由于上述原因，當(dāng)哺乳動(dòng)物基因在大腸桿菌中表達(dá)或病毒基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)用于有效表達(dá)的密碼子不適當(dāng)分布的可能性較大。據(jù)信，在發(fā)生表達(dá)的宿主中罕見(jiàn)密碼子的異源DNA序列簇是該宿主中低異源表達(dá)水平的指標(biāo)。
因此，可以對(duì)特定原核(例如大腸桿菌或酵母)或真核宿主偏好的密碼子進(jìn)行修飾，以便編碼相同的蛋白，但是與野生型序列不同。所述密碼子修飾過(guò)程可以包括任何序列，通過(guò)人工或計(jì)算機(jī)軟件生成，其中天然序列的某些或全部密碼子是修飾過(guò)的。業(yè)已公開(kāi)了若干種方法(Nakamura等，Nucleic Acids Research 1996，24214-215；WO98/34640)。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選方法是Syngene方法，即Calcgene方法的改進(jìn)(R.S.Hale和G Thompson(ProteinExpression and Purification Vol.12 pp.185-188(1998))。
這種密碼子修飾方法可能具有以下優(yōu)點(diǎn)中的某一些或全部1)通過(guò)用更常用的密碼子取代罕見(jiàn)的或不常用的密碼子而改善基因產(chǎn)物的表達(dá)，2)消除或添加限制酶位點(diǎn)，以便有利于下游克隆，和3)降低在DNA載體上的插入序列和基因組序列之間的同源重組的可能性，和4)改善在人體內(nèi)的免疫反應(yīng)。本發(fā)明的序列有利地具有較低的重組可能，但是，至少能夠以與野生型序列相同的水平表達(dá)。由于用來(lái)產(chǎn)生密碼子修飾序列的SynGene程序的算法的性質(zhì)，它可能產(chǎn)生極大數(shù)量的不同的密碼子修飾的序列，它們具有類(lèi)似的功能。簡(jiǎn)單地講，密碼子是使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分配的，以便提供具有接近于在高度表達(dá)的人類(lèi)基因，如β-肌動(dòng)蛋白中天然存在的密碼子頻率。
本發(fā)明的多核苷酸中，密碼子使用模式相對(duì)典型的MUC-1的使用模式發(fā)生了改變，以便能更好地體現(xiàn)高度表達(dá)的基因在目標(biāo)生物中的密碼子偏好，例如，人β-肌動(dòng)蛋白?！迕艽a子使用系數(shù)″是特定多核苷酸序列的密碼子模式如何與目標(biāo)物種類(lèi)似的指標(biāo)。密碼子頻率可以來(lái)自很多物種的高度表達(dá)的基因的文獻(xiàn)來(lái)源(例如，參見(jiàn)Nakamura等Nucleic Acids Research 1996，24214-215)。將61個(gè)密碼子中每一個(gè)的密碼子頻率(用所選類(lèi)型的基因的每1000個(gè)密碼子出現(xiàn)的次數(shù)表示)對(duì)20種天然氨基酸中的每一種進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以便將每一種氨基酸的最常使用的密碼子的值設(shè)定為1，并且將不太常用的密碼子的頻率規(guī)定為0-1之間的值。因此，61種密碼子中的每一種都賦予了目標(biāo)物種的高度表達(dá)的基因的1或低于1的值。為了計(jì)算特定多核苷酸相對(duì)所述物種的高度表達(dá)的基因的密碼子使用系數(shù)，給出了所述特定多核苷酸的每一個(gè)密碼子的折合值，并且取所有這些值的幾何平均數(shù)(通過(guò)用密碼子的總數(shù)除所述值的天然對(duì)數(shù)的總和，并且取反對(duì)數(shù))。所述系數(shù)的值在0和1之間，并且所述系數(shù)越高，所述多核苷酸中有越多的密碼子是常用的密碼子。如果多核苷酸序列的密碼子使用系數(shù)為1，所有密碼子都是目標(biāo)物種的高度表達(dá)的基因的“最常用的”密碼子。
根據(jù)本發(fā)明，所述多核苷酸的密碼子使用方式優(yōu)選排除了表示＜10％的用于特定氨基酸的密碼子的密碼子。相對(duì)的同義密碼子使用(RSCU)值是觀察到的密碼子數(shù)量除以預(yù)期數(shù)量，前提是所述氨基酸的所有密碼子以相同的頻率使用。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選排除了在目標(biāo)生物的高度表達(dá)的基因中RSCU值低于0.2的密碼子。本發(fā)明的多核苷酸中高度表達(dá)的人類(lèi)基因的密碼子使用系數(shù)通常大于0.6，優(yōu)選大于0.65，最優(yōu)選大于0.7。用于人類(lèi)的密碼子使用表還可以從Genbank中查閱到。
比較而言，高度表達(dá)的β肌動(dòng)蛋白基因的RSCU為0.747。
下面列出了人的密碼子使表
人(高度表達(dá)的)基因的密碼子選擇1/24/91(human_high.cod)
非VNTR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域在VNTR5′的大約80個(gè)氨基酸，和3′VNTR的190-200個(gè)氨基酸。本發(fā)明的所有構(gòu)建體包括來(lái)自該區(qū)域的至少一個(gè)表位。表位通常是由至少七個(gè)氨基酸序列組成的。因此，本發(fā)明的構(gòu)建體包括至少一個(gè)來(lái)自非VNTR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的表位。優(yōu)選包括基本上所有或更優(yōu)選所有非VNTR結(jié)構(gòu)域。特別優(yōu)選的是，所述構(gòu)建體包括由以下序列組成的表位FLSFHISNL；NSSLEDPSTDYYQELQRDISE，或NLTISDVSV。更優(yōu)選的是在該構(gòu)建體中包括兩個(gè)，優(yōu)選所有三個(gè)表位序列。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包括N-末端前導(dǎo)序列。所述信號(hào)序列，跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域分別全部是任選存在或缺失的。當(dāng)存在時(shí)，優(yōu)選對(duì)所有這些區(qū)域進(jìn)行修飾。
本發(fā)明的優(yōu)選的構(gòu)建體是1)密碼子修飾的截短的MUC-1(即完整的MUC-1，不具有完全的重復(fù))2)密碼子修飾的截短的MUC-1Δss(As I，不過(guò)還缺少信號(hào)序列)3)密碼子修飾的截短的MUC-1ΔTM ΔCYT(As 1，不過(guò)缺少跨膜和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域)4)密碼子修飾的截短的MUC-1Δss ΔTM ΔCYT(As 3，不過(guò)還缺少信號(hào)序列)同樣優(yōu)選的是上述1-4的等同的構(gòu)建體，但是缺少不完全的MUC-1重復(fù)單位。所述構(gòu)建體被稱(chēng)作容易消化的(gutted)-MUC-1。在一種實(shí)施方案中，所述不完全的VNTR單位中的一個(gè)或多個(gè)是通過(guò)改變糖基化位點(diǎn)突變的，以便降低糖基化可能性。所述突變優(yōu)選是取代，但是可以是插入或缺失。通常用纈氨酸，異亮氨酸，丙氨酸或天冬酰胺取代至少一個(gè)蘇氨酸或絲氨酸。因此，優(yōu)選至少一個(gè)，優(yōu)選2或3個(gè)或更多個(gè)氨基酸是用上述氨基酸取代過(guò)的。
其他優(yōu)選的構(gòu)建體與上述構(gòu)建體是等同的，不過(guò)包括1-15，優(yōu)選2-8，更優(yōu)選7個(gè)VNTR(完全的)重復(fù)單位。
在另一種實(shí)施方案中，所述容易消化的MUC-1核酸在前導(dǎo)序列和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合部分提供有限制位點(diǎn)。通常，該限制位點(diǎn)是Nhe1位點(diǎn)?？蓪⒃撐稽c(diǎn)用作克隆位點(diǎn)，用于插入編碼其他肽的序列，所述肽包括，例如糖基化突變體(即VNTR區(qū)突變以消除O-糖基化位點(diǎn))，或編碼T-輔助表位的異源序列，如來(lái)自破傷風(fēng)毒素的P2或P30，或野生型VNTR單位。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了表達(dá)載體，它包括本發(fā)明的多核苷酸序列，并且能夠指導(dǎo)它的表達(dá)。所述載體適合驅(qū)動(dòng)異源DNA在細(xì)菌，昆蟲(chóng)，或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，特別是在人細(xì)胞中表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包括本發(fā)明的多核苷酸序列的宿主細(xì)胞，或本發(fā)明的表達(dá)載體。宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌，例如大腸桿菌細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人細(xì)胞，或可以是昆蟲(chóng)細(xì)胞。包括本發(fā)明的載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是體外轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)的細(xì)胞或通過(guò)給所述哺乳動(dòng)物施用所述載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染過(guò)。
本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明的多核苷酸序列的藥物組合物。所述組合物優(yōu)選包括DNA載體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包括多個(gè)顆粒，優(yōu)選金顆粒，用包括編碼本發(fā)明的多核苷酸序列的DNA包被，所述核苷酸序列編碼本文所披露的MUC-1氨基酸序列。在另一種實(shí)施方案中，所述組合物包括可以藥用的賦形劑和本發(fā)明的DNA載體。
所述組合物還可以包括佐劑，或者與佐劑或免疫刺激劑同時(shí)或序貫施用。
因此，本發(fā)明的一種實(shí)施方案是，本發(fā)明的載體與免疫刺激劑一起使用。所述免疫刺激劑優(yōu)選是與本發(fā)明的核酸載體同時(shí)施用的，并且在優(yōu)選實(shí)施方案中，是配制在一起的。所述免疫刺激劑包括，(不過(guò)所列舉的并非是詳盡的，并且不排除其他制劑)合成的咪唑喹啉如咪喹莫特[S-26308，R-837]，(Harrison，等Reduction ofrecurrent HSV disease using imiquimod alone or combined witha glycoprotein vaccine′，Vaccine 191820-1826，(2001))；和resiquimod[S-28463，R-848](Vasilakos，等′Adjuvantactivities of immune response modifier R-848Comparison withCpG ODN′，Cellular immunology 20464-74(2000))，在抗原呈遞細(xì)胞和T-細(xì)胞表面上組成型表達(dá)的羰基的Schiff堿和胺，如妥卡雷瑣(Rhodes，J.等′Therapeutic potentiation of the immunesystem by costimulatory Schiff-base-forming drugs′，Nature37771-75(1995))，作為蛋白或肽的細(xì)胞因子，趨化因子和共刺激分子，其中包括促炎細(xì)胞因子，如干擾素，特別是干擾素α，GM-CSF，IL-1α，IL-1β，TGF-α和TGF-β，Thl誘導(dǎo)物，如干擾素γ，IL-2，IL-12，IL-15，IL-18和IL-21，Th2誘導(dǎo)物，如IL-4，IL-5，IL-6，IL-10和IL-13和其他趨化因子和共刺激基因，如MCP-1，MIP-1α，MIP-1β，RANTES，TCA-3，CD80，CD86和CD40L，其他免疫刺激導(dǎo)向配體，如CTLA-4和L-選擇蛋白，細(xì)胞凋亡刺激蛋白和肽，如Fas，(49)，合成脂基佐劑，如vaxfectin，(Reyes等，′Vaxfectin enhancesantigen specific antibody titres and maintains Thl type immuneresponse to plasmid DNA immunization′，Vaccine 193778-3786)角鯊烯，α-生育酚，polysorbate 80，DOPC和膽固醇，內(nèi)毒素，[LPS]，Beutler，B.，′Endotoxin，′Toll-like receptor 4，and the afferentlimb of innate immunity′，Current Opinion in Microbiology 323-30(2000))；CpG寡核苷酸-和二核苷酸，Sato，Y.等，′Immunostimulatory DNA sequences necessary for effectiveintradermal gene immunization′，Science 273(5273)352-354(1996)。Hemmi，H.等，′A Toll-like receptor recognizesbacterial DNA′，Nature 408740-745，(2000)，和其他能夠誘導(dǎo)Toll受體產(chǎn)生Thl-誘導(dǎo)性細(xì)胞因子的其他可能的配體，如合成的分枝桿菌脂蛋白，分枝桿菌蛋白p19，肽聚糖，磷壁酸和脂質(zhì)A?？梢允褂闷渌?xì)菌免疫刺激蛋白，如霍亂毒素，大腸桿菌毒素和它們的突變類(lèi)毒素。
用于誘導(dǎo)主要是Thl-型反應(yīng)的某些優(yōu)選的佐劑包括，例如，脂質(zhì)A衍生物，如單磷酰脂質(zhì)A，或優(yōu)選3-脫氧乙酰化單磷酰脂質(zhì)A。MPL佐劑可以從Corixa Corporation獲得(Seattle，WA；例如，參見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)。含有CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸是未甲基化的)也誘導(dǎo)主要的Thl反應(yīng)。所述寡核苷酸是眾所周知的，并且披露于以下文獻(xiàn)中，例如，參見(jiàn)WO 96/02555，WO 99/33488和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,008,200和5,856,462。以下文獻(xiàn)中還披露了免疫刺激DNA序列，例如，Sato等，Science 273352，1996。其他優(yōu)選的佐劑包括皂苷，如Quil A，或其衍生物，包括QS21和QS7(AquilaBiopharmaceuticals Inc.，F(xiàn)ramingham，MA)；七葉皂苷；毛地黃皂苷；或絲石竹或昆諾藜皂苷。
還提供了本發(fā)明的多核苷酸，或本發(fā)明的載體用于治療或預(yù)防表達(dá)MUC-1的腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移的用途。
本發(fā)明還提供了治療或預(yù)防表達(dá)MUC-1的腫瘤，包括腫瘤轉(zhuǎn)移在內(nèi)的與它相關(guān)的任何癥狀或疾病的方法，包括施用有效量的本發(fā)明的多核苷酸，載體或藥物組合物。藥物組合物的施用可以采用一劑或多劑的形式，例如，采用“激發(fā)-加強(qiáng)”治療接種方案。在某些場(chǎng)合下，“激發(fā)”接種可以通過(guò)顆粒介導(dǎo)的本發(fā)明多核苷酸的DNA送遞進(jìn)行，優(yōu)選摻入到質(zhì)粒-衍生的載體，并且通過(guò)施用包括相同多核苷酸序列的重組病毒載體“加強(qiáng)”，或用佐劑中的蛋白加強(qiáng)。相反，激發(fā)可以用病毒載體或用蛋白制劑進(jìn)行，通常，使用在佐劑中制備的蛋白，并且用本發(fā)明的DNA疫苗加強(qiáng)。
如上文所述，本發(fā)明包括表達(dá)載體，所述載體包括本發(fā)明的核苷酸序列。所述表達(dá)載體通常是在分子生物學(xué)領(lǐng)域構(gòu)建，并且可以，例如，涉及使用質(zhì)粒DNA和合適的引發(fā)劑，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和其他因子，例如，聚腺苷酸化信號(hào)，這些因子可能是必需的，并且它們是以正確的取向定位的，以便能夠進(jìn)行蛋白表達(dá)。其他合適的載體對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。作為這一方面的其他例子，可以參見(jiàn)Sambrook等Molecular Cloninga Laboratory Manual.2ndEdition.CSH Laboratory Press.(1989)。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的多核苷酸，或用于本發(fā)明載體中的多核苷酸是與控制序列可操作地連接，所述控制序列能夠提供宿主細(xì)胞對(duì)編碼序列的表達(dá)，即所述載體是表達(dá)載體。術(shù)語(yǔ)″可操作地連接″表示并列關(guān)系，其中，上述部分的關(guān)系使得它們能夠以預(yù)期的方式起作用。與編碼序列″可操作地連接″的調(diào)控序列，如啟動(dòng)子是以這種方式定位的，使得所述編碼序列能夠在與調(diào)控序列相容的條件下表達(dá)。
例如，所述載體可以是質(zhì)粒，人工染色體(例如，BAC，PAC，YAC)，具有復(fù)制起點(diǎn)的病毒或噬菌體載體，任選具有用于表達(dá)所述多核苷酸的啟動(dòng)子，并且任選具有所述啟動(dòng)子的調(diào)控因子。所述載體可以包括一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記基因，例如，對(duì)于細(xì)菌質(zhì)粒來(lái)說(shuō)包括氨芐青霉素或卡那霉素抗性基因，或?qū)τ谡婢d體來(lái)說(shuō)包括抗性基因。載體可以體外使用，例如用于生產(chǎn)DNA或RNA，或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，例如，哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，例如用于生產(chǎn)由所述載體編碼的蛋白。所述載體還適合體內(nèi)使用，例如，用于DNA疫苗接種方法或基因治療。
可以選擇啟動(dòng)子和其他表達(dá)調(diào)控信號(hào)，以便與設(shè)計(jì)表達(dá)的宿主細(xì)胞相容。例如，哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子包括金屬硫蛋白啟動(dòng)子，它能夠反應(yīng)于諸如鎘的重金屬而被誘導(dǎo)，和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。還可以使用病毒啟動(dòng)子，如SV40大T抗原啟動(dòng)子，人巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期(IE)啟動(dòng)子，勞氏肉瘤病毒LTR啟動(dòng)子，腺病毒啟動(dòng)子，或HPV啟動(dòng)子，特別是HPV上游調(diào)控區(qū)(URR)。所有這些啟動(dòng)子有充分的報(bào)導(dǎo)并且在本領(lǐng)域中可方便地獲得。
優(yōu)選的啟動(dòng)子元件是缺少內(nèi)含子A，但是包括外顯子1的CMV立即早期啟動(dòng)子。因此提供了包括受HCMV IE早期啟動(dòng)子控制的本發(fā)明的多核苷酸的載體。
合適的病毒載體的例子包括單純皰疹病毒載體，牛痘或甲病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括慢病毒，腺病毒和腺伴隨病毒。使用所述病毒的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。例如，可以將逆轉(zhuǎn)錄病毒用于將本發(fā)明的多核苷酸穩(wěn)定地整合到宿主基因組中，盡管所述重組不是優(yōu)選的。相反，復(fù)制缺陷型腺病毒載體保留了附加染色體，并因此可以瞬時(shí)表達(dá)?？梢圆捎媚軌蛟诶ハx(chóng)細(xì)胞(例如，桿狀病毒載體)，在人類(lèi)細(xì)胞或在細(xì)菌中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的載體，以便生產(chǎn)大量由本發(fā)明的多核苷酸編碼的HIV蛋白，例如，用作亞基疫苗或用于免疫測(cè)定。本發(fā)明的多核苷酸在病毒疫苗中具有特殊用途，因?yàn)橐郧皣L試制備完整長(zhǎng)度的牛痘構(gòu)建體的努力一直沒(méi)有成功。
還可以使用細(xì)菌載體，例如，減毒的沙門(mén)氏菌屬，或利斯特氏菌屬可以用作細(xì)菌載體。本發(fā)明的多核苷酸可用于通過(guò)表達(dá)編碼的蛋白進(jìn)行生產(chǎn)，所述表達(dá)可以在體外進(jìn)行，在體內(nèi)進(jìn)行或離體進(jìn)行。因此，所述核苷酸可能涉及重組蛋白合成，例如，用于提高產(chǎn)量，或?qū)嶋H上將它本身用作治療劑，用于DNA接種技術(shù)。當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸被用于在體外或離體細(xì)胞，例如在細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)所編碼的蛋白時(shí)，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行修飾，以便包括要表達(dá)的多核苷酸。所述細(xì)胞包括瞬時(shí)，或優(yōu)選包括穩(wěn)定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系?？梢酝ㄟ^(guò)插入編碼本發(fā)明的多肽的載體進(jìn)行修飾的細(xì)胞的特定例子包括哺乳動(dòng)物HEK293T，CHO，HeLa，293和COS細(xì)胞。所選擇的優(yōu)選的細(xì)胞系是這樣的細(xì)胞系，它不僅是穩(wěn)定的，而且還能夠進(jìn)行成熟的糖基化，和多肽的細(xì)胞表面表達(dá)。表達(dá)可以在轉(zhuǎn)化過(guò)的卵母細(xì)胞中進(jìn)行。多肽可以是由本發(fā)明的多核苷酸表達(dá)的在轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的細(xì)胞，優(yōu)選小鼠細(xì)胞中表達(dá)。表達(dá)來(lái)自本發(fā)明的多核苷酸的多肽的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物屬于本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明還提供了對(duì)哺乳動(dòng)物對(duì)象進(jìn)行免疫的方法，該方法包括給所述動(dòng)物對(duì)象施用有效量的所述疫苗或疫苗組合物。最優(yōu)選的是，用于DNA疫苗，疫苗組合物和免疫治療劑中的表達(dá)載體是質(zhì)粒載體。
DNA疫苗能夠以″裸露的DNA″形式施用，例如利用注射器或高壓噴射器施用的液體制劑，或用脂質(zhì)體或刺激性轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑制備的DNA，或通過(guò)粒子介導(dǎo)的DNA送遞(PMDD)。所述所有送遞系統(tǒng)為本領(lǐng)域所公知。例如，可以通過(guò)病毒載體送遞系統(tǒng)將所述載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明的組合物可以通過(guò)多種方法送遞，如肌內(nèi)，皮下，腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)，黏膜，如鼻內(nèi)途徑。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物是通過(guò)皮內(nèi)途徑送遞的。具體地講，所述組合物是通過(guò)基因槍(特別是粒子轟擊)施用技術(shù)送遞的，該技術(shù)涉及將所述載體包被在珠子(例如，金)上，然后在高壓下施用到表皮中；例如，在以下文獻(xiàn)中所披露的Haynes等，JBiotechnology 4437-42(1996)。
在一種典型例子中，氣體驅(qū)動(dòng)的粒子加速可以用諸如由Powderject Pharmaceuticals PLC(Oxford，UK)和PowderjectVaccines Inc.(Madison，WI)生產(chǎn)的器械實(shí)現(xiàn)，其中的某些例子披露于以下文獻(xiàn)中美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,846,796；6,010,478；5,865,796；5,584,807；和歐洲專(zhuān)利號(hào)0500 799。該方法提供了無(wú)針頭送遞途徑，其中，在通過(guò)手持式器械產(chǎn)生的氦氣射流中將諸如多核苷酸的微顆粒的干粉制劑加速到高速度，將所述顆粒推進(jìn)到感興趣的目標(biāo)組織中，通常是皮膚。所述顆粒優(yōu)選是0.4-4.0μm直徑的金球，更優(yōu)選0.6-2.0μm直徑，并且將DNA綴合物包被在其上，然后裝入藥筒或彈夾，以便放入“基因槍”。
在相關(guān)實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的組合物的氣體驅(qū)動(dòng)的無(wú)針頭注射的其他器械和方法包括由Bioject，Inc.(Portland，OR)提供的器械，其中的某些例子披露于以下文獻(xiàn)中美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,790,824；5,064,413；5,312,335；5,383,851；5,399,163；5,520,639和5,993,412.
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的核苷酸可以通過(guò)微型針頭施用，它可能具有包被在針頭上的DNA，或從儲(chǔ)存物中送遞所述組合物。包括編碼抗原性肽的核苷酸序列的載體是以這樣的用量施用的，它是預(yù)防或治療有效的。要施用的量對(duì)于粒子介導(dǎo)的送遞來(lái)說(shuō)，通常在1皮克-1毫克核苷酸/劑范圍內(nèi)，優(yōu)選1皮克-10微克核苷酸/劑，而對(duì)于其他途徑來(lái)說(shuō)為10微克-1毫克核苷酸/劑。確切用量根據(jù)要免疫的患者的體重和施用途徑可能有很大的不同。
對(duì)于包括編碼抗原性肽的核苷酸序列的免疫原成分來(lái)說(shuō)，可以一次性施用或反復(fù)施用，例如，施用1-7次，優(yōu)選1-4次，間隔時(shí)間為大約1天至大約18個(gè)月。另外可能的是，施用需要有規(guī)律地進(jìn)行較長(zhǎng)的時(shí)間，同時(shí)監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展。例如，對(duì)于慢性癌癥或其他慢性疾病來(lái)說(shuō)，可能需要每月施用，持續(xù)超過(guò)18個(gè)月的較長(zhǎng)的時(shí)間。對(duì)于某些患者/疾病狀況來(lái)說(shuō)，需要在患者的生命時(shí)間中經(jīng)常性地施用。不過(guò)，這種治療方案同樣可以根據(jù)患者的體形，要治療/預(yù)防的疾病，所施用的核苷酸的量，施用途徑，以及對(duì)于有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)學(xué)從業(yè)者來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的其他因素而有顯著的改變?；颊呖梢越邮芤环N或多種其他抗癌藥物，作為它們的總體治療方案的一部分。
將裸露的多核苷酸或載體導(dǎo)入患者體內(nèi)的合適的技術(shù)還包括用合適的媒介物局部涂敷。所述核酸可以在皮膚上或在黏膜表面上局部外用，例如，通過(guò)鼻內(nèi)，口腔，陰道內(nèi)或直腸內(nèi)施用。裸露的多核苷酸或載體能夠與可以藥用的賦形劑，如磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)同時(shí)存在。還可以使用諸如丁哌卡因的促進(jìn)劑促進(jìn)DNA吸收，它可以是獨(dú)立的或包含在DNA制劑中。給受體直接施用核酸的其他方法包括超聲波，電刺激，電穿孔和顯微接種，這些方法披露于US-5,697,901中。
可以通過(guò)若干種已知的轉(zhuǎn)染技術(shù)增強(qiáng)核酸構(gòu)建體的吸收，例如，包括使用轉(zhuǎn)染劑的技術(shù)。所述制劑的例子包括陽(yáng)離子制劑，例如，磷酸鈣和DEAE-葡聚糖和lipofectants，例如，lipofectam和transfectam。要施用的核酸的劑量可以改變。
還可以通過(guò)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法施用本發(fā)明的核酸序列。所述細(xì)胞包括從對(duì)象體內(nèi)收獲的細(xì)胞?？梢栽隗w外將本發(fā)明的裸露的多核苷酸或載體導(dǎo)入所述細(xì)胞，并且隨后可以將轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)胞送回對(duì)象體內(nèi)?？梢酝ㄟ^(guò)同源重組事件將本發(fā)明的多核苷酸可以整合到業(yè)已存在于細(xì)胞中的核酸中。如果需要，轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)胞可以在體外生長(zhǎng)，并且可以將一種或多種所得到的細(xì)胞用于本發(fā)明?？梢酝ㄟ^(guò)已知的外科手術(shù)和顯微手術(shù)技術(shù)(例如，移植，顯微注射等)將細(xì)胞提供在患者體內(nèi)的適當(dāng)?shù)牟课弧?br> 實(shí)施例1.導(dǎo)入MUC1密碼子修飾方法盡管MUC1是RSCU(又被稱(chēng)作密碼子系數(shù)指數(shù)(C1))為0.535的人類(lèi)基因，密碼子修飾能進(jìn)一步改進(jìn)密碼子指數(shù)和表達(dá)。這對(duì)于劑量可能有限的臨床設(shè)置來(lái)說(shuō)是特別重要的。第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)是密碼子使用的操作會(huì)降低在MUC1免疫治療和基因組中的MUC1基因座之間重組的潛力。在重組可能導(dǎo)致質(zhì)粒整合到基因組中的臨床設(shè)置下是特別重要的。
1.1序列設(shè)計(jì)在

圖1中示出了用于MUC1修飾的起始序列。該序列來(lái)自質(zhì)粒JNW656，并且表示包括七個(gè)VNTR重復(fù)單位的MUC1表達(dá)盒的完整的編碼序列。在密碼子修飾之前，并且由于以前用寡核苷酸建立VNTR重復(fù)單位的困難性，制備了缺少VNTR重復(fù)的實(shí)際的MUC1序列(圖2)。該序列的CI值為0.499。該方法是對(duì)MUC1的非VNTR序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，然后工程化到密碼子修飾的序列上的限制酶位點(diǎn)重新插入7xVNTR片段。
通過(guò)Syngene程序，根據(jù)圖2a中的實(shí)際的MUC1序列獲得了實(shí)際的密碼子修飾序列的選擇(圖3)。表1表示起始MUC1序列的CI值與兩種典型的密碼子修飾序列的比較。
表1.MUC1修飾序列的密碼子系數(shù)指數(shù)
除了密碼子修飾之外，還篩選了所有序列的限制酶克隆位點(diǎn)。根據(jù)最高的CI值和有利的限制酶位點(diǎn)特征，選擇了序列2。為了促進(jìn)克隆和表達(dá)，在所述序列上產(chǎn)生了以下序列(參見(jiàn)圖4)1)添加了5′和3′克隆位點(diǎn)(Nhel，Xbal，Xhol，Notl和BamHl)2)將Kozak序列(GCCACC)插入起始密碼子ATG的5′。
3)通過(guò)在64號(hào)密碼子(AGC→TCC)和209號(hào)密碼子(AGC→TCC)上的沉默突變，除去了兩個(gè)不合適的BlpI位點(diǎn)。
4)通過(guò)在259號(hào)密碼子上發(fā)生的以下突變(TTG→CTG)，除去了罕見(jiàn)的亮氨酸密碼子。
5)重新導(dǎo)入了Bpu101/BbvC1位點(diǎn)(參見(jiàn)圖4，加方框的區(qū)域)，以便促進(jìn)7x VNTR片段的克隆。
6)重新導(dǎo)入了Blp1位點(diǎn)(參見(jiàn)圖4，加方框的區(qū)域)，以便促進(jìn)7x VNTR區(qū)的克隆。
在圖4示出的這種工程改造過(guò)的序列的CI值為0.735。將Syngene程序用于將該片段分解成52-60-聚體的寡核苷酸，具有20個(gè)堿基的最低的重復(fù)。
1.2寡核苷酸構(gòu)建使用兩個(gè)步驟的PCR方法，使用以下條件首先組裝了重疊的引物。由此產(chǎn)生了片段的多樣性群體。用5′和3′末端末端引物回收/擴(kuò)增完整長(zhǎng)度的片段。從瓊脂糖凝膠上切除所得到的PCR片段，純化，用Nhe1和Xho1限制，并且克隆到pVAC上。通過(guò)限制酶分析和序列驗(yàn)證陽(yáng)性克隆。將驗(yàn)證過(guò)的載體標(biāo)為JNW749。JNW749上的MUC1密碼子修飾的序列包括兩個(gè)沉默突變(在圖5中突出顯示的)，這些突變是由于寡核苷酸構(gòu)建的易錯(cuò)性質(zhì)造成的。
組裝反應(yīng)-PCR條件反應(yīng)混合物
1x Pfx緩沖液1μl寡核苷酸混合物0.5mM dNTPsPfx聚合酶(5U)1mM MgSO4總體積＝50μl1. 94℃30秒2. 40℃120秒3. 72℃10秒4. 94℃15秒5. 40℃30秒6. 72℃20秒+3秒/循環(huán)7.循環(huán)到步驟4，25次8.保持在4℃下回收反應(yīng)-PCR條件反應(yīng)混合物1x Pfx緩沖液10μl組裝反應(yīng)混合物0.625mM dNTPs50皮摩爾5′末端引物50皮摩爾3′末端引物Pfx聚合酶(5U)1mM MgSO41x Pfx增強(qiáng)劑總體積＝50μl1. 94℃45秒2. 60℃30秒3. 72℃120秒4.循環(huán)到步驟1，25次
5. 72℃240秒6.保持在4℃下1.3重新導(dǎo)7x VNTR片段JNW749包括缺少7x VNTR單位的密碼子修飾的MUC1表達(dá)盒。將7x VNTR盒從Blp1/BbvC1盒上的JNW656中切除，并且連接到事先用Blp1和BbvC1限制過(guò)的JNW749上。在進(jìn)行限制酶分析和序列驗(yàn)證之后，選擇被標(biāo)明為JNW758的克隆作進(jìn)一步的分析。在圖5中示出了JNW758上的MUC1盒。JNW758中的MUC1表達(dá)盒的最終的C1值為0.699，它體現(xiàn)了相對(duì)起始值0.535的明顯提高。
1.4MUC1表達(dá)的比較在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中之后，比較了來(lái)自載體JNW656(天然MUC1)和JNW758(密碼子修飾的MUC1)的MUC1表達(dá)。采用流式細(xì)胞分析(FACS)，在它們的表面上表達(dá)MUC1的細(xì)胞的百分比在天然(對(duì)于JNW656來(lái)說(shuō)為13.2％)，和密碼子修飾的盒(對(duì)于JNW758來(lái)說(shuō)為18.1％)之間非常相似。在通過(guò)Western印跡分析時(shí)(圖6)，結(jié)果表明了密碼子修飾的MUC1的表達(dá)與天然MUC1相比中度地增強(qiáng)。使用Area Density Tool(Labworks，UVP Ltd，UK)，通過(guò)密度測(cè)定法分析，對(duì)Western印跡上的MUC1表達(dá)進(jìn)行定量。來(lái)自JNW656(天然MUC1)的MUC1表達(dá)提供了48527的隨意斑點(diǎn)密度值，而密碼子修飾的MUC1(JNW758)提供了94839的值，表明了與天然7x VNTR MUC1相比，密碼子修飾的MUC1的表達(dá)提高了大約2倍。
1.5DNA相似性在對(duì)MUC1的起始序列(來(lái)自JNW656)和密碼子修飾的序列(來(lái)自JNW758)進(jìn)行ClustalV(加權(quán)的)比對(duì)之后的配對(duì)距離證實(shí)密碼子修飾的序列與原始MUC1序列的相似性為82.8％。缺少7x VNTR區(qū)(位于BbvC1和Blp1位點(diǎn)之間)的相同的序列的相似性在進(jìn)行ClustalV比對(duì)之后進(jìn)一步降低到75.1％。
1.6對(duì)7x VNTR MUC1和密碼子修飾的7x VNTR MUC1的細(xì)胞反應(yīng)的比較在用pVAC(空載體)，JNW656(7x VNTR MUC1)和JNW758(密碼子修飾的7x VNTR MUC1)在第0天初次免疫和第21天加強(qiáng)免疫之后通過(guò)ELISPOT評(píng)估了細(xì)胞反應(yīng)。在使用CD8肽SAPDNRPAL(SAP)進(jìn)行強(qiáng)化免疫7天之后進(jìn)行分析。圖7表示在用SAP肽和IL-2重新刺激脾細(xì)胞之后IFNγ的生產(chǎn)與用7x VNTR MUC1或密碼子修飾的7x VNTRMUC1免疫的組相當(dāng)。
結(jié)合來(lái)自Western印跡的結(jié)果，這些數(shù)據(jù)表明了密碼子修飾的7xVNTR MUC1與天然7x VNTR MUC1表達(dá)和免疫原性相比是有利的，并且在降低與基因組MUC1序列的重組可能方面具有顯著優(yōu)點(diǎn)。
1.7其他方法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分析的方法可以通過(guò)以下方法分析來(lái)自各種DNA構(gòu)建體的MUC1表達(dá)將質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞中，然后對(duì)總細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western印跡分析，或?qū)?xì)胞膜表達(dá)的MUC1進(jìn)行流式細(xì)胞分析。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可以使用Transfectam試劑(Promega)按照生產(chǎn)商的指南進(jìn)行。簡(jiǎn)單地講，可以用5×104CHO細(xì)胞/孔接種24-孔組織培養(yǎng)平板，所述細(xì)胞存在于1ml DMEM完全培養(yǎng)基(DMEM，10％ FCS，2mM L-谷氨酰胺，青霉素100IU/ml，鏈霉素100μg/ml)中，并且在37℃培養(yǎng)16小時(shí)?？梢詫?.5μg DNA添加到251μl的0.3M NaCl(足夠一個(gè)孔)中，并且將2μl的Transfectam添加到25μl的Milli-Q中。所述DNA和Transfectam溶液應(yīng)當(dāng)輕柔地混合，并且在室溫下培養(yǎng)15分鐘。在該培養(yǎng)步驟中，應(yīng)當(dāng)用PBS洗滌細(xì)胞一次，并且用150μl的無(wú)血清培養(yǎng)基(DMEM，2mM L-谷氨酰胺)覆蓋。然后應(yīng)當(dāng)將所述DNA-Transfectam溶液滴加到所述細(xì)胞中，并且輕柔地?fù)u晃所述平板，并且在34℃下培養(yǎng)4-6小時(shí)。然后應(yīng)當(dāng)添加500μl的DMEM完全培養(yǎng)基，并且在37℃下再培養(yǎng)細(xì)胞48-72小時(shí)。
1.8用MUC1質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的流式細(xì)胞分析在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染之后，用PBS洗滌CHO細(xì)胞一次，并且用凡爾生(1∶5000)/0.025％胰蛋白酶溶液處理，以便將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移到懸浮液中。在胰蛋白酶化之后，使CHO細(xì)胞沉淀，并且重新懸浮在FACS緩沖液(PBS，4％FCS，0.01％疊氮化鈉)中。以15μg/ml的最終濃度添加第一抗體ATR1，并且將樣品放在冰上培養(yǎng)15分鐘。對(duì)照細(xì)胞在沒(méi)有ATR1的條件下用FACS緩沖液培養(yǎng)。用FACS緩沖液洗滌細(xì)胞三次，重新懸浮在100μl含有10μl第二抗體山羊抗小鼠免疫球蛋白FITC偶聯(lián)的F(ab′)2(Dako，F(xiàn)0479)的FACS緩沖液中，并且在冰上培養(yǎng)15分鐘。在進(jìn)行第二抗體染色之后，用FACS緩沖液洗滌所述細(xì)胞三次。用FACScan(Becton Dickinson)進(jìn)行FACS分析。同時(shí)測(cè)定每一個(gè)樣品的1000-10000個(gè)細(xì)胞的FSC(前角光散射)和SSC(集成光散射)以及綠色(FL1)熒光(表達(dá)為集成熒光的對(duì)數(shù))。進(jìn)行記錄，排除了FCS超出范圍的聚集體。數(shù)據(jù)表達(dá)為用細(xì)胞數(shù)量(Y-軸)對(duì)熒光強(qiáng)度(X-軸)作圖的直方圖。
1.9用MUC1質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的Western印跡分析用PBS洗滌瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，并且用凡爾生(1∶5000)/0.025％胰蛋白酶溶液處理，以便將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移到懸浮液中。在胰蛋白酶化之后，使CHO細(xì)胞沉淀，并且重新懸浮在50μl的PBS中。添加等體積的含有50mM DTT的2x TRIS-甘氨酸SDS樣品緩沖液(Invitrogen)，并且將該溶液加熱到95℃保持5分鐘。將1-20μl的樣品加樣到4-20％TRIS-甘氨酸凝膠1.5mm(Invitrogen)上，并且在恒定電壓(125V)下，在1x TRIS-甘氨酸緩沖液(Invitrogen)中電泳90分鐘。將預(yù)先染色的大范圍的標(biāo)記(New England Biolabs，#P7708S)用于測(cè)定所述樣品的大小。在電泳之后，將所述樣品轉(zhuǎn)移到Immobilon-P PVDF膜(Millipore)上，用甲醇預(yù)先濕潤(rùn)，使用Xcell III Blot Module(Invitrogen)，含有20％甲醇的1x轉(zhuǎn)移緩沖液(Invitrogen)，并且用25V的恒定電壓電泳90分鐘。在4℃下，用含有3％干燥的脫脂乳(Marvel)的TBS-Tween(Tris-緩沖的鹽溶液，pH 7.4，含有0.05％的Tween 20)封閉所述膜過(guò)夜。第一抗體(ATR1)以1∶100的比例稀釋?zhuān)⑶遗c所述膜一起在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。在用TBS-Tween充分洗滌之后，第二抗體以1∶2000的比例用含有3％干燥的脫脂乳的TBS-Tween稀釋?zhuān)⑶以谑覝叵屡c所述膜一起培養(yǎng)1小時(shí)。在充分洗滌之后，所述膜與Supersignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物(Pierce)一起培養(yǎng)5分鐘。除去過(guò)量的液體，并且將所述膜密封在兩片食品薄膜之間，并且對(duì)Hyperfilm ECL膠片(Amersham Pharmacia Biotech)曝光1-30分鐘。
實(shí)施例2.對(duì)7VNTR-MUC-1-PADRE-C和密碼子修飾的7VNTR-MUC-1-PADRE-C的細(xì)胞反應(yīng)的比較2.1密碼子優(yōu)化的MUC-1 Padre的構(gòu)建與PADRE輔助表位融合的MUC1表達(dá)盒的構(gòu)建構(gòu)建了含有PADRE輔助表位(參見(jiàn)Immunity(1994)1(9)751-761)的三種MUC1設(shè)計(jì)。PADRE是含有聚丙氨酸主鏈的泛-DR結(jié)合表位，所述主鏈在T細(xì)胞受體能夠接觸的位點(diǎn)上具有大的/帶電荷的殘基。首先通過(guò)將短的接頭插入pVAC1產(chǎn)生了C-末端融合體。所述接頭是通過(guò)讓兩種引物PADREFOR和PADREREV退火產(chǎn)生的，并且，通過(guò)Nhe1和Xho1位點(diǎn)將該接頭克隆到pVAC1上，產(chǎn)生了載體JNW800。通過(guò)切除Xba1片段上的MUC1盒，將來(lái)自JNW656(7x VNTR MUC1)和JNW758(密碼子優(yōu)化的7x VNTR MUC1)的7x VNTR MUC1表達(dá)盒插入JNW800，并且克隆到Xba1位點(diǎn)上，產(chǎn)生了以下兩種載體。
7x VNTR MUC1 C-term PADREJNW8107x VNTR MUC1(密碼子優(yōu)化的)C-term PADREJNW812來(lái)自JNW810和JNW812的MUC1表達(dá)盒和PADRE表位的測(cè)序構(gòu)建了第三種載體，其中，將PADRE序列插入C-末端的最外端，并且還位于緊靠MUC1的信號(hào)序列之后的第二個(gè)位置。將所述N-末端PADRE表位插入信號(hào)序列下游的原因是避免所述表位作為MUC1肽的天然的翻譯后加工的一部分被切除(有關(guān)MUC1上的裂解位點(diǎn)的細(xì)節(jié)參見(jiàn)Biochem.Biophys.Res.Comm(2001)283715-720)。所述載體是通過(guò)兩個(gè)階段的方法構(gòu)建的。首先，在silico制備了含有N-末端和C-末端PADRE表位的MUC1的N-末端序列，然后通過(guò)使用重疊的寡核苷酸(如上文所述)通過(guò)PCR構(gòu)建。通過(guò)Nhe1-Xho1位點(diǎn)將PCR片段插pVAC1，并且驗(yàn)證序列，產(chǎn)生了質(zhì)粒JNW802。從存在于BbcVI-Xba1片段上的JNW758中分離密碼子優(yōu)化的7x VNTR MUC1的C-末端部分，并且克隆到JNW802中，由此重新產(chǎn)生了含有兩個(gè)PADRE表位的7x VNTR MUC1表達(dá)盒。該載體被標(biāo)明為7x VNTR MUC1(密碼子優(yōu)化的)C/N′PADRE或JMW814。
2.2分五組評(píng)估了30只C57小鼠(六只小鼠/組)A.PVac 7 VNTR JNW656B.pVac 7 VNTR PADRE C(密碼子優(yōu)化的) JNW812C.pVac 7 VNTR PADRE C(野生型) JNW810D.pVav 7 VNTR PADRE C/N′(密碼子優(yōu)化的) JNW814E.pVac Empty
在第0，12和42天，通過(guò)粒子介導(dǎo)的免疫用表達(dá)質(zhì)粒(1μg MUC-1DNA+0.5μg IL-2)對(duì)每一只動(dòng)物進(jìn)行免疫，并且在第28和第49天評(píng)估細(xì)胞免疫反應(yīng)。
結(jié)果如圖8A和B所示。
結(jié)論在用PVAC 7VNTR，PVAC 7VNTR-PADRE-C密碼子優(yōu)化的序列，PVAC7VNTR-PADRE-C wt序列，PVAC 7VNTR-PADRE C/N′密碼子優(yōu)化的序列免疫之后通過(guò)ELISPOT評(píng)估細(xì)胞反應(yīng)，在第0天進(jìn)行初次免疫之后，在第21和42天進(jìn)行加強(qiáng)。在用MUC1CD8肽(SAP)MUC1 CD4肽(298/9)和PADRE肽加強(qiáng)7天之后進(jìn)行分析。結(jié)果表明，與野生型小鼠相比，CD4和CD8 T細(xì)胞MUC1專(zhuān)一性反應(yīng)在密碼子優(yōu)化的構(gòu)建體中在第28天和第49天是相似的(或稍好一些)，并且被設(shè)計(jì)成避免同源重組。
總之，在MUC1抗原中包含密碼子優(yōu)化的序列能改善蛋白表達(dá)，在體內(nèi)使用時(shí)能產(chǎn)生類(lèi)似的或稍好一些的免疫反應(yīng)，在用于人類(lèi)臨床疫苗中時(shí)預(yù)計(jì)具有更好的安全譜。
權(quán)利要求
1.編碼能夠在體內(nèi)引起免疫反應(yīng)的MUC-1衍生物的核酸分子，所述反應(yīng)能夠識(shí)別表達(dá)MUC-1的腫瘤，其中，所述核酸的非重復(fù)區(qū)的RSCU值至少為0.6，并且與圖9所示的MUC-1 VNTR核苷酸序列相比，對(duì)于相應(yīng)的野生型MUC-1的非重復(fù)區(qū)具有低于85％的同一性水平。
2.如權(quán)利要求1的核酸分子，其中，所述RSCU至少為0.65。
3.如權(quán)利要求1的核酸分子，其中，所述同一性低于80％。
4.如權(quán)利要求1的編碼MUC-1衍生物的核酸分子，具有少于15個(gè)完全的重復(fù)單位。
5.如權(quán)利要求4的核酸分子，具有不完全的重復(fù)。
6.如權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的核酸分子，它缺少信號(hào)序列。
7.如權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的核酸分子，它編碼選自下組的一種或多種序列FLSFHISNL；NSSLEDPSTDYYQELQRDISE；和NLTISDVSV。
8.如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)的核酸分子，還包括編碼T-輔助表位的異源序列。
9.如權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的核酸分子，它是DNA分子。
10.包括權(quán)利要求1-9的DNA分子的質(zhì)粒。
11.一種藥物組合物，包括權(quán)利要求1-9的核酸或權(quán)利要求10的質(zhì)粒，和可以藥用的賦形劑，稀釋劑或載體。
12.如權(quán)利要求11的藥物組合物，其中所述載體是微粒。
13.如權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述微粒是金。
14.如權(quán)利要求11-13中任意一項(xiàng)的藥物組合物，還包括佐劑。
15.權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)的核酸，權(quán)利要求10的質(zhì)粒，或權(quán)利要求11-14的藥物組合物在醫(yī)學(xué)中的用途。
16.權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)的核酸在制備用于治療或預(yù)防表達(dá)MUC-1的腫瘤的藥物中的用途。
17.一種治療或預(yù)防腫瘤的方法，包括施用安全的和有效量的如權(quán)利要求1-9的核酸，或權(quán)利要求10的質(zhì)粒。
全文摘要
提供了與天然MUC－1具有較低同源性的MUC－1 DNA構(gòu)建體。提供了含有所述MUC－1構(gòu)建體的藥物組合物。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1753994SQ200480005230
公開(kāi)日2006年3月29日 申請(qǐng)日期2004年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月28日
發(fā)明者P·A·漢布林, M·D·L·A·羅查德?tīng)枎?kù)拉 申請(qǐng)人:葛蘭素集團(tuán)有限公司