專(zhuān)利名稱(chēng)：一種抗腫瘤小肽FpAT的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽藥物化學(xué)合成領(lǐng)域，具體涉及本發(fā)明涉及一種抗腫瘤小肽FpAT的制備方法。
背景技術(shù)：
抗腫瘤小肽FpAT的氨基酸序列為:L_天冬氨酰-L-絲氨酰-甘氨酰-L-谷氨酰-甘氨酰-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-纈氨酰-L-精氨酸。其結(jié)構(gòu)如下:
權(quán)利要求
1.FpAT小肽的制備方法,所述FpAT的氨基酸序列為H-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg-OH,其特征在于包括如下步驟: (1)將Fmoc-Arg(Pbf)-OH連接到載體2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂上獲得Fmoc-Arg (Pbf) -CTC 樹(shù)脂； (2)按照Fmoc/tBu固相多肽合成方法,根據(jù)FpAT的序列,從C端到N端逐步偶聯(lián)Fmoc保護(hù)氨基酸，直至完成FpAT肽樹(shù)脂的合成； (3)使用裂解試劑將FpAT從樹(shù)脂載體上切下，離心、干燥得到粗肽； (4)將步驟3所得的粗肽加純水溶解，調(diào)pH，利用制備型反相HPLC純化，收集目的產(chǎn)物，旋蒸，凍干得到FpAT成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，在步驟(4)中利用制備型反相HPLC純化所使用的流動(dòng)相，其特征在于:第一步純化流動(dòng)相A相可以為T(mén)FA、CH3C00H*H3P04的水溶液，B相為乙腈；第二步純化流動(dòng)相:A相可以為T(mén)EAP或PBS的水溶液，B相為乙腈；第三步純化流動(dòng)相A相可選擇庚烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉或高氯酸的水溶液，B相為乙腈。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:流動(dòng)相優(yōu)選組合為:第一步純化A相為T(mén)FA水溶液，B相為乙腈；第二步純化A相為T(mén)EAP水溶液，B相為乙腈；第三部純化A相為庚烷磺酸鈉水溶液，B相為乙腈。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中將粗肽加粗肽加純水溶解后，用10% 15%的稀氨水調(diào)pH至3 4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，在反應(yīng)釜中，通過(guò)加入N，N- 二異丙基乙胺和N，N- 二甲基 甲酰胺試劑，使Fmoc-Arg(Pbf)-OH和2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂反應(yīng)得到生產(chǎn)所需的Fmoc-Arg (Pbf) -CTC樹(shù)脂，其中Fmoc-Arg (Pbf) -OH與2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂投料摩爾比為1.5 2.5: I。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于:N,N-二異丙基乙胺與Fmoc-Arg(Pbf)-OH的投料摩爾比為3 4: 1，室溫反應(yīng)3 5小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于:步驟(I)所述的反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液抽掉，用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌后，加入二氯甲烷、甲醇及N，N- 二異丙基乙胺到反應(yīng)釜中，封閉兩次，每次15 20分鐘，以封閉2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂上未反應(yīng)的功能基，最后經(jīng)過(guò)洗滌、干燥得到所需的Fmoc-Arg(Pbf) -CTC樹(shù)脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述的偶聯(lián)在N，N-二異丙基碳二亞胺、1-羥基苯丙三氮唑以及N，N-二甲基甲酰胺的縮合體系中進(jìn)行，其中Fmoc保護(hù)氨基酸、N，N-二異丙基碳二亞胺、1-羥基苯并三氮唑的投料摩爾比為1:1 1.3: I 1.3，且Fmoc保護(hù)的氨基酸的投料量為與其進(jìn)行的偶聯(lián)的樹(shù)脂的摩爾數(shù)的2 4倍；從C端到N端偶聯(lián)完第10位氨基酸Asp后，脫Fmoc時(shí)要采用0.1M HOBt的20%哌啶/DMF溶液或環(huán)己亞胺/HOBt/NMP/DMSO = 4/4/71/71來(lái)抑制天冬酰亞胺雜質(zhì)的形成。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:在步驟(2)中，通過(guò)Kaiser法來(lái)判斷偶聯(lián)是否完全。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:在步驟(3)中，用TFA/苯甲硫醚/苯甲BI /EDT = 90/5/3/2 或 TFA: EDT: TIS = 95/2.5/2.5 的混合液作為裂解試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤小肽FpAT的制備方法，技術(shù)方案包括如下步驟采取Fmoc/tBu固相多肽合成策略，以2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂(CTC Resin)作載體，制備替代度為0.4～0.7mmol/g的Fmoc-Arg(Pbf)-CTC Resin；通過(guò)固相多肽合成方法，從FpAT的C端到N端的序列依次縮合Fmoc保護(hù)氨基酸，直至N末端的天冬氨酸縮合完成后，得到FpAT的全保護(hù)肽樹(shù)脂；用TFA/苯甲硫醚/EDT/苯甲醚做裂解試劑，無(wú)水乙醚沉降，獲得FpAT粗肽；將FpAT粗肽加水溶解，調(diào)節(jié)pH至3～4，使用制備型反相HPLC純化，收集純度合格的目的產(chǎn)物，凍干得到成品。此工藝操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)效率較高，對(duì)設(shè)備要求低，總收率可達(dá)到35％以上，可以規(guī)?；a(chǎn)，有較好的經(jīng)濟(jì)社會(huì)價(jià)值和應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K1/20GK103172704SQ20111042906
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者王良友, 陸冬冬, 陳逸民 申請(qǐng)人:蘇州中科天馬肽工程中心有限公司