一種從發(fā)酵液中分離提取3-羥基丁酮的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從發(fā)酵液中分離提取3-羥基丁酮的方法，具體為：將3-羥基丁酮發(fā)酵液用微濾膜過濾或離心的方法除去菌體，得發(fā)酵清液；向發(fā)酵清液中加入無機(jī)鹽，待溶解后，再向發(fā)酵清液中添加親水性有機(jī)溶劑，充分混勻，靜置至出現(xiàn)分相（分層），上相通過減壓蒸餾回收或除去親水性有機(jī)溶劑，得到提濃3-羥基丁酮的溶液，下相經(jīng)濃縮后可以循環(huán)利用。本發(fā)明通過親水有機(jī)溶劑和無機(jī)鹽形成的雙水相將3-羥基丁酮從發(fā)酵液中濃縮到有機(jī)溶劑溶液中，然后再通過減壓蒸餾分離回收有機(jī)溶劑，得到3-羥基丁酮濃縮液，該工藝操作簡單，易于放大，3-羥基丁酮的回收率高，所用無機(jī)鹽和有機(jī)溶劑能夠回收再利用，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種從發(fā)酵液中分離提取3-羥基丁酮的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵液中產(chǎn)物的分離提取技術(shù)，尤其涉及一種從發(fā)酵液中分離3-羥基丁酮的雙水相萃取方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]3-羥基丁酮(acetoin)，又名乙偶姻、醋嗡、甲基乙酰甲醇、2，3_ 丁醇酮，是一種重要的呈香化合物，天然存在于玉米、葡萄、可可、蘋果、香蕉、草莓及某些動物組織中，2004年美國能源部將其列為30種優(yōu)先開發(fā)利用的平臺化合物之一。3-羥基丁酮是一種具有奶香香味的香料物質(zhì) ，高濃度時(shí)具有濃郁強(qiáng)烈的奶油香氣，低濃度時(shí)具有雅淡清香的香奶味道，可以針對不同食品對奶香香味的要求加以調(diào)配，是一種口感良好的食用香料添加劑，廣泛應(yīng)用于配制咖啡、巧克力、堅(jiān)果、乳制品、香精、奶油等風(fēng)味物質(zhì)；3_羥基丁酮還是白酒、啤酒和葡萄酒中的重要微量組分之一，它的含量與酒精飲料的風(fēng)味有密切關(guān)系，因此常依據(jù)風(fēng)味要求用于酒類調(diào)香中；在醫(yī)藥領(lǐng)域中，3-羥基丁酮可以合成4-氯-4，5- 二甲基-1，3- 二氧雜環(huán)戊烷-2-酮和倫氨芐西林鹽酸鹽等能夠用于青霉素、氨芐青霉素等抗生素類藥物合成的中間體；3-羥基丁酮添加在煙草中，可以大大改善煙草的香味品質(zhì)，在煙草領(lǐng)域有著廣泛的開發(fā)利用前景。
[0003]目前，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)3-羥基丁酮的技術(shù)已取得了很好的發(fā)展，發(fā)酵產(chǎn)率最高已達(dá)60g/L以上，已經(jīng)達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的水平，但從發(fā)酵液中分離提純3-羥基丁酮的技術(shù)研究卻很少，這制約了生物技術(shù)生產(chǎn)3-羥基丁酮的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮，是以水溶液為介質(zhì)，但是3-羥基丁酮的親水性很強(qiáng)，在發(fā)酵液中與水混溶，本申請的發(fā)明人曾采用常溫蒸餾、減壓蒸餾等手段進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)在常壓蒸餾液中3-羥基丁酮的濃度與發(fā)酵液中濃度基本相同，而減壓蒸餾，餾分中3-羥基丁酮的濃度比發(fā)酵液中還低，因此，通過常壓和減壓蒸餾的方式不能有效從發(fā)酵液中分離3-羥基丁酮。同樣，因?yàn)?-羥基丁酮的極性強(qiáng)，采用與水不相混溶的弱極性或非極性溶劑萃取，3-羥基丁酮萃取率較低，不適合規(guī)?；瘧?yīng)用。中國專利CN102296094B從細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中分離3-羥基丁酮(乙偶姻)，先采用減壓蒸餾得到乙偶姻水溶液，然后用乙酸乙酯進(jìn)行6~8次萃取，這樣會大大增加操作成本，不適合工業(yè)化應(yīng)用。中國專利CN101012152A采用一種自制超高交聯(lián)樹脂HD-02吸附發(fā)酵液中的3-羥基丁酮，然后再用乙醇洗脫，將洗脫液蒸餾得到3-羥基丁酮，提濃比約I~3倍。該方法需要采用的是自制專用樹脂，且提濃比較低。目前尚未有關(guān)于從發(fā)酵液中高效分離提取3-羥基丁酮的報(bào)道。
[0004]雙水相萃取技術(shù)始于20世紀(jì)60年代，雙水相萃取中使用的雙水相是由兩種互不相溶的高分子溶液或者互不相溶的鹽溶液和高分子溶液組成。最常見的就是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dextran)和PEG/無機(jī)鹽(硫酸鹽、磷酸鹽等)體系。在實(shí)際應(yīng)用中因?yàn)槠暇厶堑染酆衔飪r(jià)格比較高，工業(yè)化應(yīng)用有一定的困難，人們開始尋求比較廉價(jià)的雙水相原料。研究發(fā)現(xiàn)，能與水混溶的小分子有機(jī)溶劑，如乙醇、異丙醇、丙酮等，加入到某些無機(jī)鹽水溶液中，可形成有機(jī)溶劑/無機(jī)鹽雙水相體系。這類新型的雙水相萃取體系，在眾多領(lǐng)域中表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。比如中國專利CN10321192A采用乙醇和硫酸銨體系從葡萄糖籽中提取總黃酮，總黃酮在乙醇相中的回收率達(dá)98%以上。中國專利CN101531652B利用親水小分子有機(jī)溶劑和無機(jī)鹽形成的雙水相體系從越橘果實(shí)殘?jiān)刑崛』ㄇ嗨兀ㄇ嗨厣舷嘀械幕厥章蔬_(dá)90%以上。盧俊彩等采用丙酮-硫酸銨雙水相體系分離純化色素(丙酮-硫酸銨雙水相體系分離純化紅花紅色素，化學(xué)研究與應(yīng)用，2007，19 (6) =679-682),紅色素收率大于98%。中國專利CN101012151B利用小分子有機(jī)溶劑和無機(jī)鹽形成的雙水相從發(fā)酵液中分離1，3-丙二醇，上相中1，3-丙二醇回收率約85~95%。中國專利CN101012152B利用小分子有機(jī)溶劑和無機(jī)鹽形成的雙水相從發(fā)酵液中分離2，3- 丁二醇，上相中2，3- 丁二醇回收率為85~95%。目前，尚未有關(guān)于米用雙水相萃取技術(shù)從發(fā)酵液中分離3-羥基丁酮的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對目前從發(fā)酵液中分離提取3-羥基丁酮的難題，本發(fā)明提供了一種采用雙水相萃取技術(shù)從發(fā)酵液中分離提濃3-羥基丁酮的方法，該方法采用親水性小分子有機(jī)溶劑與無機(jī)鹽形成的雙水相萃取體系從發(fā)酵液中分離提取3-羥基丁酮，回收率高，分離效果好。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]—種從發(fā)酵液中分離提取3-羥基丁酮的方法，包括以下步驟:
[0008](I)將3-羥基丁酮發(fā)酵液用微濾膜過濾或離心的方法除去菌體，得到發(fā)酵清液；
[0009](2)取一定體積的發(fā)酵清液，加入適量的無機(jī)鹽，待無機(jī)鹽完全溶解后，再向體系中加入適量的親水性有機(jī)溶劑，充分混勻，靜置分相(一般需靜置2~10h，優(yōu)選4~6h使分相完全)，上相(上層)為富含3-羥基丁酮的有機(jī)相，下相為富含水的無機(jī)鹽相(無機(jī)鹽溶液)。上相通過減壓蒸餾回收或除去親水性有機(jī)溶劑，即得到含3-羥基丁酮的濃縮液，下相經(jīng)濃縮后無機(jī)鹽可以循環(huán)利用；
[0010]在由發(fā)酵液、無機(jī)鹽和親水性有機(jī)溶劑三者組成的體系中，無機(jī)鹽的添加量為體系總質(zhì)量的10~40%，親水性有機(jī)溶劑的添加量為體系總質(zhì)量的10~40%。
[0011]所述步驟(1)中，3-羥基丁酮發(fā)酵液為:枯草芽孢桿菌利用葡萄糖為原料經(jīng)常規(guī)發(fā)酵制得的目的產(chǎn)物為3-羥基丁酮發(fā)酵液；或:其他芽孢桿菌或細(xì)菌利用葡萄糖為原料生產(chǎn)的目的產(chǎn)物為3-羥基丁酮發(fā)酵液。
[0012]所述步驟(1)中，3-羥基丁酮發(fā)酵液除菌可選用微濾膜微濾除菌，所用微濾膜的孔徑為0.1~0.4um ;也可選擇采用離心分離的方法除菌,離心條件為:4000~5000r/min,離心5~IOmin0
[0013]優(yōu)選的，所述步驟(2)中，無機(jī)鹽選自磷酸氫二鉀、硫酸銨，最優(yōu)選磷酸氫二鉀；無機(jī)鹽的添加量為體系總質(zhì)量的15~30% ；
[0014]優(yōu)選的，所述步驟(2)中，親水性有機(jī)溶劑選自無水乙醇、異丙醇、乙腈，最優(yōu)選無水乙醇(優(yōu)選乙醇的理由為:除考慮回收率外，還兼顧有機(jī)溶劑的回收方便和食用安全性)，親水性有機(jī)溶劑的添加量為體系總質(zhì)量的20~35%。
[0015]優(yōu)選的， 所述步驟(2)中，無機(jī)鹽選自磷酸氫二鉀，磷酸氫二鉀的添加量為體系總質(zhì)量的20~25% ;親水性有機(jī)溶劑選自無水乙醇，無水乙醇的添加量為體系總質(zhì)量的25~30%。
[0016]本發(fā)明公開的從發(fā)酵液中分離提取3-羥基丁酮的方法，是通過在發(fā)酵清液中加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的無機(jī)鹽和親水有機(jī)溶劑形成雙水相體系，發(fā)酵液中3-羥基丁酮被濃縮到有機(jī)溶劑相中，分離兩相，富含3-羥基丁酮的有機(jī)溶劑相通過減壓蒸餾分離回收有機(jī)溶劑，得到3-羥基丁酮濃縮液，有機(jī)溶劑相中3-羥基丁酮的回收率最高達(dá)97%以上，上下相3-羥基丁酮分配比最高可達(dá)15倍以上。該工藝操作簡單，易于放大，3-羥基丁酮的回收率高，所用無機(jī)鹽和有機(jī)溶劑能夠回收再利用，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。但本
【發(fā)明內(nèi)容】
不受以下實(shí)施例的限制。
[0018]實(shí)施例13-羥基丁酮發(fā)酵液的制備
[0019]本發(fā)明3-羥基丁酮發(fā)酵液是通過以下方法得到的:在100~1000L發(fā)酵罐中，裝有70~75%發(fā)酵培養(yǎng)基，常規(guī)滅菌后，以5%的接種量接種枯草芽孢桿菌SFA-H43 (或其他能夠轉(zhuǎn)化葡萄糖產(chǎn)3-羥基丁菌株的)到發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制適當(dāng)?shù)臏囟?30~37°C)、溶解氧(相對溶解氧濃度5~30%)、pH (5.5~7.0)，進(jìn)行通風(fēng)攪拌培養(yǎng)，至碳源耗盡(發(fā)酵液中檢測不到葡萄糖含量)，結(jié)束發(fā)酵，得到3-羥基丁酮濃度為40~70g/L的3-羥基丁酮發(fā)酵液。
[0020]上述3-羥基丁酮發(fā)酵液經(jīng)陶瓷微濾膜過濾(陶瓷膜的孔徑為0.2~0.4um，合肥世杰膜工程有限責(zé)任公司提供)除菌后，得到發(fā)酵清液(3-羥基丁酮的濃度40~70g/L)，用于下列實(shí)施例。
[0021]上述發(fā)酵用枯草芽孢桿菌菌株SFA-H43 (BacillussubtilisSFA_H43)已于2013年5月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNo:M2013181，保藏地址為:中國湖北省武漢市武漢大學(xué)，郵編=430072。該菌株在 申請人:的另一項(xiàng)發(fā)明專利申請中要求保護(hù)，申請日為2013年07月10日，申請?zhí)枮?201310289934.7。
[0022]上述菌株SFA-H43發(fā)酵3_羥基丁酮培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖100~160g/L，酵母浸提物 3 ~6g/L，玉米漿 5 ~10g/L，(NH4) 2HP042 ~3g/L，MgS042g/L, MnSO40.2g/L，其余為水，pH7.0 ~7.2。
[0023]實(shí)施例2發(fā)酵液中3-羥基丁酮的雙水相萃取
[0024]選取1000g雙水相體系，取發(fā)酵清液550g，加入的磷酸氫二鉀200g(質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，w/w),攪拌溶解,然后加入250g的無水乙醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%, w/w),充分混合混勻,靜置4h,混合料液完全分相，上相為有機(jī)溶劑相565mL，下層為無機(jī)鹽相304mL。上下相3-羥基丁酮的分配系數(shù)為13.37，有機(jī)相中3-羥基丁酮的回收率為96.1%。
[0025]實(shí)施例3發(fā)酵液中3-羥基丁酮的雙水相萃取
[0026]選取1000g的雙水相體系:取450g (45%，w/w)的發(fā)酵清液，加入25% (w/w)的磷酸氫二鉀，攪拌溶解，然后加入30% (w/w)的無水乙醇，充分混合混勻，靜置5h分相，有機(jī)相體積為580mL，下相體積為300mL，3-羥基丁酮的分配系數(shù)為17.83，有機(jī)相中3-羥基丁酮的回收率為97.6%。
[0027]實(shí)施例4發(fā)酵液中3-羥基丁酮的雙水相萃取[0028]選取1000g的雙水相體系:取550g (55%，w/w)的發(fā)酵清液，加入25% (w/w)的磷酸氫二鉀，攪拌溶解，然后加入20% (w/w)的無水乙醇，充分混合混勻，靜置5h分相，有機(jī)相體積為520mL，下相體積為320mL，3-羥基丁酮的分配系數(shù)為14.06，有機(jī)相中3-羥基丁酮的回收率為95.8%。
[0029] 實(shí)施例5發(fā)酵液中3-羥基丁酮的雙水相萃取
[0030]選取1000g的雙水相體系:取550g (55%，w/w)的發(fā)酵清液，加入250g (25%，w/w)的磷酸氫二鉀，攪拌溶解后，再加入200g (20%，w/w)的異丙醇，充分混勻，室溫下靜置4h，待分相完全后，測量上相(有機(jī)相)體積400mL，下相體積440mL，3-羥基丁酮的分配系數(shù)為
8.80，上相中3-羥基丁酮的回收率為88.8%。
[0031]實(shí)施例6發(fā)酵液中3-羥基丁酮的雙水相萃取
[0032]選取1000g的雙水相體系，稱取550g (55%，w/w)的離心去菌體發(fā)酵清液，加入25%(w/w)的磷酸氫二鉀，攪拌待溶解后，再加入20% (w/w)的乙腈，攪拌混合均勻，室溫下靜止3h,待完全分相后，測量上相體積480mL，下相體積420mL，3-羥基丁酮的分配系數(shù)為8.14，上相中3-羥基丁酮的回收率為90.3%。
[0033]實(shí)施例7發(fā)酵液中3-羥基丁酮的雙水相萃取
[0034]選取1000g的雙水相體系，稱取550g (55%，w/w)的離心去菌體發(fā)酵清液，加入25%(w/w)的硫酸銨，攪拌待溶解后，再加入20% (w/w)的無水乙醇，攪拌混合均勻，室溫下靜止6h，待完全分相后，測量上相體積360mL，下相體積540mL，3_羥基丁酮的分配系數(shù)為5.96，上相中3-羥基丁酮的回收率為80.0%。
[0035]實(shí)施例8發(fā)酵液中3-羥基丁酮的雙水相萃取
[0036]選取1000g的雙水相體系，稱取550g (55%，w/w)的離心去菌體發(fā)酵清液，加入25%(w/w)的硫酸銨，攪拌待溶解后，再加入20% (w/w)的乙腈，攪拌混合均勻，室溫下靜止4h，待完全分相后，測量上相體積380mL，下相體積500mL，3-羥基丁酮的分配系數(shù)為7.45，上相中3-羥基丁酮的回收率為85.0%。
【權(quán)利要求】
1.一種從發(fā)酵液中分離提取3-羥基丁酮的方法，其特征在于:步驟如下: (1)將3-羥基丁酮發(fā)酵液用微濾膜過濾或離心的方法去除菌體，得到發(fā)酵清液； (2)取一定體積的發(fā)酵清液，加入無機(jī)鹽，待無機(jī)鹽完全溶解后，再向體系中加入親水性有機(jī)溶劑，充分混勻，靜置分相，上相為富含3-羥基丁酮的有機(jī)相，下相為富含水的無機(jī)鹽相；上相通過減壓蒸餾回收或除去親水性有機(jī)溶劑，即得到3-羥基丁酮的濃縮液，下相經(jīng)濃縮后無機(jī)鹽可循環(huán)利用；在由發(fā)酵清液、無機(jī)鹽和親水性有機(jī)溶劑三者組成的體系中，無機(jī)鹽的添加量為體系總質(zhì)量的10~40%，親水性有機(jī)溶劑的添加量為體系總質(zhì)量的10~40%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵液中分離3-羥基丁酮的雙水相萃取方法，其特征在于:所述步驟(1)中，3-羥基丁酮發(fā)酵液為:枯草芽孢桿菌利用葡萄糖為原料經(jīng)發(fā)酵制得的目的產(chǎn)物為3-羥基丁酮發(fā)酵液；或:其他芽孢桿菌或細(xì)菌利用葡萄糖為原料生產(chǎn)的目的產(chǎn)物為3-羥基丁酮發(fā)酵液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵液中分離3-羥基丁酮的雙水相萃取方法，其特征在于:所述步驟(1)中，發(fā)酵液去除菌體所用微濾膜的孔徑為0.1~0.4um，微濾膜選陶瓷材質(zhì)；離心除菌的離心條件為:4000~5000r/min,離心10~15分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵液中分離3-羥基丁酮的雙水相萃取方法，其特征在于:所述步驟(2)中，無機(jī)鹽選自磷酸氫二鉀、硫酸銨；無機(jī)鹽的添加量占總體系質(zhì)量分?jǐn)?shù)的15~30%ο
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵液中分離3-羥基丁酮的雙水相萃取方法，其特征在于:所述步驟(2)中，親水性有機(jī)溶劑選自無水乙醇、異丙醇、乙腈；親水性有機(jī)溶劑的添加量為體系總質(zhì)量的20~25%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或4或5`所述的從發(fā)酵液中分離3-羥基丁酮的雙水相萃取方法，其特征在于:所述步驟(2)中，無機(jī)鹽選磷酸氫二鉀，磷酸氫二鉀的添加量為體系總質(zhì)量的20~25% ;親水性有機(jī)溶劑選無水乙醇，無水乙醇的添加量優(yōu)選為體系總質(zhì)量的25~30%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從發(fā)酵液中分離3-羥基丁酮的雙水相萃取方法，其特征在于:所述步驟(2)中，靜置分相時(shí)間為2~10h。
【文檔編號】C07C45/78GK103524316SQ201310435320
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月23日
【發(fā)明者】劉建軍, 趙祥穎, 田延軍, 張家祥, 范宜曉, 楊麗萍, 韓延雷 申請人:山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院