專利名稱：貓棒束孢粗多糖作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌提取物的抗腫瘤藥物開發(fā)，具體為一種貓棒束孢粗多糖(以下簡(jiǎn)稱IFP)作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
貓棒束孢(Jsaria)是從天 然冬蟲夏草子實(shí)體中經(jīng)菌種分離培養(yǎng)獲得的一種菌株，在分類上屬于半知菌綱、叢梗孢目、棒束孢屬。經(jīng)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所鑒定為Isaria felina (DC. :Fr. ) Fr.,該菌種已被中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏(保藏號(hào)CGMCC NO. 0706)，并取得國(guó)家發(fā)明專利(ZL02103669. I)。DeffieuxGerard 等人(J Antibiot (Tokyo). 1981, 34(10): 1261-1265.)從 Jsaria中提取分離得到環(huán)羧酹酸肽結(jié)構(gòu)的殺蟲劑Isariins B、C和D,并對(duì)Isariins B、C和D的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定(J Antibiot (Tokyo). 1981，34(10) : 1266-1270.)。郭永霞從貓棒束孢菌絲體中分離純化得到具有抗真菌作用的環(huán)縮肽isarfelin,并對(duì)isarfelin進(jìn)行了理化性質(zhì)的分析、結(jié)構(gòu)鑒定，并發(fā)現(xiàn)isarfelin具有抑制細(xì)菌、抵抗真菌的活性(郭永霞關(guān)于貓棒束孢菌抗真菌多肽和巨大口蘑抗真菌蛋白的分離純化及特性的研究[博士論文]北京，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005)。Ikumoto等研究發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草、蛹蟲草及貓棒束孢的浸出液對(duì)離體心房有負(fù)收縮效應(yīng)，同時(shí)對(duì)電刺激回腸的收縮反應(yīng)及人血小板的凝結(jié)有抑制作用(Journal ofthe Pharmaceutical Society of Japan, 1991, 111 (9) 504-509)。專利 ZL02103669. I 公開了貓棒束孢的抗腫瘤活性功能，但是目前并沒有任何研究從貓棒束孢中發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤活性成分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決目前未發(fā)現(xiàn)貓棒束孢中抗腫瘤活性成分的問題，提供了貓棒束孢中的抗腫瘤成分，即貓棒束孢粗多糖作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。貓棒束孢粗多糖，其是由如下步驟制得的取菌絲粉，加入3-5倍菌絲粉重量的蒸懼水，沸水浴提取70-110min, 3000r/min轉(zhuǎn)速下離心4_6min ;于沉淀中繼續(xù)加入3_5倍菌絲粉重量的蒸懼水,沸水浴提取20-40min, 3000r/min轉(zhuǎn)速下離心4_6min ;于沉淀中繼續(xù)加入3-5倍菌絲粉重量的蒸懼水,沸水浴提取20-40min, 3000r/min離心4_6min ;合并三次提取的上清液，水浴濃縮至800-1000mL，得混合液；加入3_4倍混合液體積的95%乙醇(優(yōu)選為混合液體積的3. 75倍)充分混勻，沉淀過夜；取沉淀，于70°C烘干得貓棒束孢粗多糖。上述制得的貓棒束孢粗多糖可應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物中。本發(fā)明采用SPF級(jí)昆明小鼠、SPF級(jí)裸鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)昆明小鼠分別接種小鼠H22肝癌細(xì)胞、小鼠S180肉瘤細(xì)胞、小鼠EAC腹水癌細(xì)胞后分別注入多種劑量的IFP、以及注入蒸餾水(陰性對(duì)照組)、注射用絲裂霉素、鴉膽子油口服乳液作為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IFP與陰性對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明貓棒束孢粗多糖對(duì)H22移植瘤、S180移植瘤有很好的抑制效果并對(duì)腹水癌EAC小鼠有生命延長(zhǎng)作用；對(duì)裸鼠分別接種人HepG2肝癌細(xì)胞、人Hela宮頸癌細(xì)胞后分別注入多種劑量的IFP、以及注入蒸餾水(陰性對(duì)照組)、注射用絲裂霉素、鴉膽子油口服乳液作為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IFP與陰性對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明貓棒束孢粗多糖對(duì)HepG2移植瘤、Hela移植瘤有很好的抑制效果。綜上所述，IFP有顯著的抑制腫瘤的作用，可廣泛適用于制備抗腫瘤藥物中。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :下面對(duì)貓棒束孢粗多糖的抗肝癌作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究
I.材料和方法
1.1動(dòng)物
SPF (specific pathogen free)級(jí)昆明小鼠54只，體重20_22g,雄性，由山西省腫瘤研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室繁殖，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)=SCXK (晉)2007-0001 ;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可 證號(hào)SYXK (晉)2007-0002 οSPF級(jí)BALB/c-nu裸鼠54只，體重16_18g，雄性，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2009-0017 ;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在清潔級(jí)屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK (晉)2007-0002。藥品與試劑
貓棒束孢是從天然冬蟲夏草子實(shí)體中經(jīng)菌種分離后培養(yǎng)得到，其培養(yǎng)方法如下將500ml培養(yǎng)基(蛋白胨O. 6 %，酵母膏I. 2 %，蔗糖2. 4 %，MgSO4O. 05 %，用O. I 0MH2PO4調(diào)整pH為6. 5-7. O)裝于3000mL三角瓶中，牛皮紙封口，125°C高壓滅菌40min，冷卻至室溫，接入菌種，置于180r ^irT1搖床上，于23_27°C條件下旋轉(zhuǎn)發(fā)酵培養(yǎng)72h，收集發(fā)酵液，將發(fā)酵液于2000r · mirf1離心5min,收集菌絲體,將菌絲體于8CTC烘干后粉碎,過100目篩。貓棒束孢粗多糖，其是由如下步驟制得的取300g上述菌絲粉，加入1200ml蒸懼水，沸水浴提取90min, 3000r/min離心5min ;于沉淀中繼續(xù)加入1200ml蒸懼水,沸水浴提取30min, 3000r/min離心5min ;于沉淀中繼續(xù)加入1200ml蒸懼水,沸水浴提取30min,3000r/min離心5min ;合并三次提取的上清液，水浴濃縮至900mL，得混合液；加入3. 75倍混合液體積的95%乙醇，充分混勻，沉淀過夜；取沉淀，于70°C烘干備用。瘤株小鼠H22肝癌細(xì)胞，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；人!1印62肝癌細(xì)胞，由山西大學(xué)生物技術(shù)研究所饋贈(zèng)。注射用絲裂霉素常用的西藥抗癌藥物，由浙江海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)為110601。鴉膽子油口服乳液常用的中藥抗癌藥物，由沈陽(yáng)藥大藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)為1103112。實(shí)驗(yàn)方法
將生長(zhǎng)良好的小鼠H22肝癌組織瘤塊，在無菌條件下加生理鹽水，用消毒的玻璃研磨器制成濃度為I X IOVmL的細(xì)胞懸液，過濾后分別接種于所有昆明小鼠的右腋下皮下，每只昆明小鼠接種O. 2mL瘤液。將生長(zhǎng)良好的人！fepG2肝癌組織瘤塊，在無菌條件下加生理鹽水，用消毒的玻璃研磨器制成濃度為5 X IOVmL的細(xì)胞懸液，過濾后分別接種于所有裸鼠的右腋下皮下，每只裸鼠接種O. 2mL瘤液。
昆明小鼠接種小鼠H22肝癌細(xì)胞24 h后，將其隨機(jī)分為6組，分別為陰性對(duì)照組、絲裂霉素組、鴉膽子油組、IFP高劑量組、IFP中劑量組、IFP低劑量組，每組9只動(dòng)物。陰性對(duì)照組小鼠每天灌胃給予蒸餾水O. 2mL，鴉膽子油組小鼠每天灌胃給予鴉膽子油口服乳液8mL/kg，IFP高劑量組小鼠每天灌胃給予IFP 200 mg/kg, IFP中劑量組小鼠每天灌胃給予IFP 100 mg/kg，IFP低劑量組小鼠每天灌胃給予IFP 50 mg/kg ;絲裂霉素組小鼠腹腔注射絲裂霉素I mg/kg，分別于實(shí)驗(yàn)第2d、第6d各注射一次，共注射2次。灌胃給藥10d，每3天稱量一次小鼠體重，末次給藥24 h后頸椎脫白法處死小鼠，剖取瘤塊并稱重，計(jì)算瘤重、抑瘤率(％)。裸鼠接種人!fepG2肝癌細(xì)胞24 h后，也將其隨機(jī)分為6組，分別為陰性對(duì)照組、絲裂霉素組、鴉膽子油組、IFP高劑量組、IFP中劑量組、IFP低劑量組，每組9只動(dòng)物。灌胃給藥劑量同上，連續(xù)灌胃給藥20d，實(shí)驗(yàn)觀察50d，于實(shí)驗(yàn)第51d稱重并處死動(dòng)物，剝離瘤塊稱濕重，計(jì)算瘤重、抑瘤率(％ )。數(shù)據(jù)處理方法
采用SPSS17. O統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(AN0VA)，兩組間比較采用最小顯著差異法(LSD)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以
z±s表不，/*〈0. 05表不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.I IFP對(duì)小鼠移植性肝癌H22的抑制作用 下表I是各組昆明小鼠的瘤重、抑瘤率
表I IFP對(duì)小鼠移植性肝癌H22的抑制作用
權(quán)利要求
1.貓棒束孢粗多糖作為制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用，其中所述貓棒束孢粗多糖是由如下步驟制得的取貓棒束孢菌絲粉，加入3-5倍菌絲粉重量的蒸餾水，沸水浴提取70-110min，3000r/min轉(zhuǎn)速下離心4_6min ;于沉淀中繼續(xù)加入3_5倍菌絲粉重量的蒸懼水,沸水浴提取20-40min, 3000r/min轉(zhuǎn)速下離心4_6min ;于沉淀中繼續(xù)加人3_5倍菌絲粉重量的蒸懼水，沸水浴提取20-40min，3000r/min離心4_6min ;合并三次提取的上清液，水浴濃縮至800-1000mL，得混合液；加入3_4倍混合液體積的95%こ醇，充分混勻，沉淀過夜；取沉淀，于70°C烘干得貓棒束孢粗多糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及真菌提取物的抗腫瘤藥物開發(fā)，具體為一種貓棒束孢粗多糖在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，解決了目前未發(fā)現(xiàn)貓棒束孢中抗腫瘤活性成分的問題。本發(fā)明采用昆明小鼠、裸鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)昆明小鼠分別接種小鼠H22肝癌細(xì)胞、小鼠S180肉瘤細(xì)胞、小鼠EAC腹水癌細(xì)胞后分別注入多種劑量的IFP，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明IFP對(duì)H22移植瘤、S180移植瘤有很好的抑制效果并對(duì)腹水癌EAC小鼠有生命延長(zhǎng)作用；對(duì)裸鼠分別接種人HepG2肝癌細(xì)胞、人Hela宮頸癌細(xì)胞后分別注入多種劑量的IFP，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明IFP對(duì)HepG2移植瘤、Hela移植瘤有很好的抑制效果。說明IFP有顯著的抑制腫瘤的作用，可廣泛適用于制備腫瘤藥物中。
文檔編號(hào)C08B37/00GK102813669SQ20121029410
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月18日
發(fā)明者楊喜花, 任連生, 張蕻 申請(qǐng)人:山西省腫瘤醫(yī)院