本發(fā)明涉及pcr檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及用于檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒的靶序列、rt-pcr引物，本發(fā)明還涉及利用該靶序列進(jìn)行水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒檢測(cè)的方法和試劑盒。

背景技術(shù)：

玉米粗縮病(maizeroughdwarfdisease,mrdd)是危害玉米生產(chǎn)的世界性病毒病害之一，在我國(guó)玉米產(chǎn)區(qū)發(fā)生嚴(yán)重。2008年到2013年，玉米粗縮病導(dǎo)致產(chǎn)量嚴(yán)重?fù)p失，普遍達(dá)到30％至50％，嚴(yán)重地區(qū)可達(dá)80％以上，甚至絕收。

玉米粗縮病病源主要有四種，均屬于呼腸孤病毒科(reoviridae)斐濟(jì)病毒屬(fijivirus)。在歐洲，病源是玉米粗縮病毒(maizeroughdwarfvirus,mrdv)；南美洲病源是馬德里約柯托病毒(malderíocuartovirus,mrcv)；在亞洲導(dǎo)致玉米粗縮病的病源是水稻黑條矮縮病毒(riceblack-streakeddwarfvirus,rbsdv)或南方水稻黑條矮縮病毒(southernriceblack-streakeddwarfvirus,srbsdv),我國(guó)黃淮海地區(qū)主要病源是rbsdv，廣東、海南以及越南和日本等地區(qū)的病源主要是srbsdv。以上病毒同時(shí)也是水稻黑條矮縮病(riceblack-streakeddwarfdisease,rbsdd)和小麥綠矮病(wheatgreendwarfdisease,wgdd)等病害的主要病源。

玉米粗縮病病源rbsdv、mrdv和mrcv均是以灰飛虱(laodelphaxstriatellus,sbph)為傳播介體以持久性傳播；而近期發(fā)現(xiàn)的srbsdv是以白背飛虱(sogatellafurcifera,wbph)為介體持久性傳播。四種病毒在寄主范圍、血清學(xué)關(guān)系、病毒粒子結(jié)構(gòu)、 介體傳毒方式及植物寄主發(fā)病方式等方面均較為相似，但通過基因序列比對(duì)確定其為兩種不同病毒。

rbsdv完整病毒粒子為等軸的20面球體，直徑約為70-80nm，其基因組由10條線性雙鏈rna(dsrna)組成，10條雙鏈dsrna按在page電泳中遷移率由慢到快分別命名為s1-s10，大小從4.5kb到1.8kb。目前研究表明，基因組共有13個(gè)開放閱讀框(openreadingframe,orf)，s5、s7和s9區(qū)段分別含有兩個(gè)orf，其中s5區(qū)段的兩個(gè)orf部分重疊，其余7條基因組區(qū)段均只有一個(gè)orf。

目前，常用的檢測(cè)植物病毒的方法主要包含：分子方法檢測(cè)，電鏡觀察，血清學(xué)檢測(cè)以及生物學(xué)接種試驗(yàn)等。但以上檢測(cè)方法很難準(zhǔn)確鑒定病原，且操作方法相對(duì)復(fù)雜。

為了提高水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒檢測(cè)的準(zhǔn)確性和便捷性，有必要建立靈敏度更好、特異性更好的檢測(cè)方法來鑒定rbsdv和srbsdv。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供用于檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒的特異、靈敏、快速、簡(jiǎn)便的方法及其應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過對(duì)多年多點(diǎn)水稻黑條矮縮病毒基因核苷酸區(qū)段進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)，確定了保守區(qū)s5區(qū)段序列，其核苷酸序列如seqidno.5所示，該靶序列是檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒的遺傳標(biāo)記物。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，該序列的特異性區(qū)段也可以作為檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒的遺傳標(biāo)記物。同時(shí)，在此區(qū)段內(nèi)篩選到水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒一致性最低的序列。本發(fā)明根據(jù)該保守序列，通過反復(fù)對(duì)比、篩選，設(shè)計(jì)了用于檢測(cè)并區(qū)分水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒遺傳標(biāo)志物的特異性引物對(duì)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選的rbsdv特異性引物對(duì)的序 列為：

rs5-f：acgatcttctcgaccaaacc(seqidno.1)(rbsdvs5中位置：2436-2455)

rs5-r：agcaagagttgaaacacaaccg(seqidno.2)(rbsdvs5中位置：2834-2855)

優(yōu)選的srbsdv特異性引物對(duì)的序列為：

ss5-f：acgatcttctcgaccaaacc(seqidno.3)(srbsdvs5中位置：2439-2458)

ss5-r：agcttatcatcgcgctgtagt(seqidno.4)(srbsdvs5中位置：2821-2841)

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒的特異性引物組合，用于檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒的引物的核苷酸序列如seqidno.1-2所示，用于檢測(cè)南方水稻黑條矮縮病毒的引物的核苷酸序列如seqidno.3-4所示。

本發(fā)明提供了上述檢測(cè)兩種病毒的特異性引物組合在檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述兩種病毒的特異性引物組合在制備檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述兩種病毒的特異性引物對(duì)在防治作物病蟲害中的應(yīng)用。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述作物為玉米。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了含有上述兩種病毒的特異性引物對(duì)的試劑盒。

具體地，該試劑盒基于rt-pcr方法，對(duì)待測(cè)樣本提取基因組rna后以其為模板，利用seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3、seqidno.4所示的特異性引物對(duì)進(jìn)行rt-pcr，檢測(cè)待測(cè)樣本中的水稻黑條矮縮病毒或南方水稻黑條矮縮病毒。

更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了上述試劑盒在防治作物病蟲害中的應(yīng) 用。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述作物為玉米。

所述rt-pcr的反應(yīng)體系為：

反應(yīng)條件為:

所述待測(cè)樣本為玉米、水稻或小麥。

本發(fā)明提供的上述檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒的方法在防治作物病蟲害中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

基于本發(fā)明的上述檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒的方法，根據(jù)擴(kuò)增目的條帶判定結(jié)果，并根據(jù)目的條帶位置判斷所攜帶病毒。在有效擴(kuò)增的情況下，樣品檢測(cè)結(jié)果可信，否則試驗(yàn)需要重復(fù)；在檢測(cè)中有效擴(kuò)增時(shí)，樣本結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：

seqidno.1和seqidno.2引物對(duì)有效擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物420bp左右，而seqidno.3和seqidno.4引物對(duì)無效擴(kuò)增(420bp處無擴(kuò)增)時(shí)，樣本攜帶的是水稻黑條矮縮病毒；seqidno.3和seqidno.4引物對(duì)有效擴(kuò)增(擴(kuò)增產(chǎn)物403bp左右)，而seqidno.1和seqid no.2引物對(duì)無效擴(kuò)增時(shí)(403bp處無擴(kuò)增)，樣本攜帶的是南方水稻黑條矮縮病毒；seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3、seqidno.4引物對(duì)均有效擴(kuò)增時(shí)，樣本同時(shí)攜帶水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒。

對(duì)于自然條件下，同時(shí)攜帶水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒的作物樣本，目前發(fā)明人還沒有發(fā)現(xiàn)。應(yīng)當(dāng)理解，上述方法的判斷標(biāo)準(zhǔn)完全適用于檢測(cè)任何感染水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒的實(shí)際情況。

本發(fā)明根據(jù)水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒基因組保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，可以通過rt-pcr進(jìn)行病原檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度、特異性均優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)，并能夠?qū)崿F(xiàn)同時(shí)檢測(cè)作物同時(shí)感染水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒的情況。本發(fā)明通過水稻黑條矮縮病毒基因組和南方水稻黑條矮縮病毒s5區(qū)段設(shè)計(jì)引物，可以進(jìn)行病原基因組檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果精確。本發(fā)明方法極大的方便了檢測(cè)成本提高了檢測(cè)效率，便于病原的確定，可用于作物此類病蟲害的防治，具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為基于127份水稻黑條矮縮病毒分離物s5區(qū)段核苷酸序列多樣性分析。a圖為rbsdvs5區(qū)段序列結(jié)構(gòu)；b圖為rbsdvs5區(qū)段核苷酸多樣性及保守區(qū)域分析。

圖2為本發(fā)明rbsdv和srbsdv最優(yōu)引物的篩選。a圖為rbsdvs5區(qū)段最優(yōu)引物篩選，泳道m(xù)為markerdl2000；泳道1為rs5-f-1/rs5-r-1引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果；泳道2為rs5-f-2/rs5-r-2引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果；泳道3為rs5-f/rs5-r引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果。b圖為srbsdvs5區(qū)段最優(yōu)引物篩選，泳道m(xù)為markerdl2000；泳道1為ss5-f/ss5-r引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果；泳道2為ss5-f-1/ss5-r-1引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果；泳道3為ss5-f-2/ss5-r-2引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果。

圖3為rbsdv和srbsdv優(yōu)選引物特異性分析。a圖為rs5-f-2/rs5-r-2引物對(duì)特異性分析，泳道m(xù)為markerdl2000；泳道1為玉米矮花葉病發(fā)病明顯的植株；泳道2為玉米粗縮病發(fā)病明顯的植株(采集于我國(guó)黃淮海地區(qū))；泳道3為玉米粗縮病發(fā)病明顯的植株(采集于我國(guó)海南省)。b圖為ss5-f/ss5-r引物對(duì)特異性分析，泳道m(xù)為markerdl2000；泳道1為玉米矮花葉病發(fā)病明顯的植株；泳道2為玉米粗縮病發(fā)病明顯的植株(采集于我國(guó)黃淮海地區(qū))；泳道3為玉米粗縮病發(fā)病明顯的植株(采集于我國(guó)海南省)。

圖4為rbsdv和srbsdv優(yōu)選引物檢測(cè)樣本電泳圖。圖a為rbsdv優(yōu)選引物檢測(cè)樣本電泳圖，其中泳道m(xù)為markerdl2000；泳道r1、r2和r3代表3個(gè)玉米粗縮病發(fā)病明顯的植株(采集于我國(guó)黃淮海地區(qū))；泳道s1、s2和s3代表3個(gè)玉米粗縮病發(fā)病明顯的植株(采集于我國(guó)海南省)。圖b為srbsdv優(yōu)選引物檢測(cè)樣本電泳圖，其中泳道m(xù)為markerdl2000；泳道s1、s2和s3代表3個(gè)玉米粗縮病發(fā)病明顯的植株(采集于我國(guó)海南省)；泳道r1、r2和r3代表3個(gè)玉米粗縮病發(fā)病明顯的植株(采集于我國(guó)黃淮海地區(qū))。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1水稻黑條矮縮病毒保守序列的選擇與特異性引物的設(shè)計(jì)

通過多年多點(diǎn)的水稻黑條矮縮病毒基因核苷酸序列測(cè)序和比對(duì)，確定保守區(qū)s5區(qū)段序列，其核苷酸序列如seqidno.5所示，該靶序列是檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒的遺傳標(biāo)記物。

本發(fā)明于2012-2014年在北京(i)、河北唐山(ii)和保定(iii)、 山東濟(jì)南(iv)和濟(jì)寧(v)、河南鄭州(vi)和信陽(yáng)(ix)、江蘇鹽城(vii)和南京(viii)采集表現(xiàn)典型癥狀的玉米粗縮病和水稻黑條矮縮病樣品共計(jì)127份，采用3對(duì)rbsdv基因組s5特異性引物擴(kuò)增。結(jié)果顯示，rbsdv-s5的2398-2832bp最為保守，且為兩個(gè)orf重疊區(qū)域。比對(duì)所有樣品的s5此區(qū)段，確定與其它樣品s5區(qū)段相似性較高的13iiim-1樣品s5序列2398-2832bp區(qū)域?yàn)楸Ｊ貐^(qū)(seqidno.5)，見圖1。

根據(jù)s5保守序列，通過反復(fù)對(duì)比、篩選，設(shè)計(jì)了用于檢測(cè)該遺傳標(biāo)志物的特異性引物對(duì)。

本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)遵循以下原則：避免引物自身或之間形成4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)，無環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；18-24bp長(zhǎng)；tm值55-65℃，gc含量在40％-60％之間，兩個(gè)引物tm值相差不超過2℃；3’端不出現(xiàn)a，且不出現(xiàn)三個(gè)或三個(gè)以上連續(xù)相同堿基；引物后5個(gè)核苷酸不能有超過2個(gè)g和c；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在400-500bp最佳。

本發(fā)明通過篩選獲得的用于擴(kuò)增水稻黑條矮縮病毒各血清型特異性的保守靶序列的特異性引物對(duì)的序列為：

rs5-f：acgatcttctcgaccaaacc(rbsdvs5中位置：2436-2455)

rs5-r：agcaagagttgaaacacaaccg(rbsdvs5中位置：2834-2855)

本發(fā)明通過篩選獲得的用于擴(kuò)增南方水稻黑條矮縮病毒各血清型特異性的保守靶序列的特異性引物對(duì)的序列為：

ss5-f：acgatcttctcgaccaaacc(srbsdvs5中位置：2439-2458)

ss5-r：agcttatcatcgcgctgtagt(srbsdvs5中位置：2821-2841)

針對(duì)目標(biāo)基因，本實(shí)施例還設(shè)計(jì)了另外2對(duì)引物(見下方)，

針對(duì)目的基因保守序列另外設(shè)計(jì)的引物：

rs5-f-1：acgatcttctcgaccaaacca(第2436-第2456)

rs5-r-1：acacaaccggtcatcacgtt(第2823-第2842)

rs5-f-2：gatcttctcgaccaaaccacg(第2438-第2458)

rs5-r-2：aaacacaaccggtcatcacg(第2825-第2844)

ss5-f-1：tacgatcttctcgaccaaacc(第2438-第2458)

ss5-r-1：gcttatcatcgcgctgtagt(第2821-第2840)

ss5-f-2：atttacgatcttctcgaccaaacc(第2435-第2458)

ss5-r-2：cagttaaaatgaagcttatcatcgc(第2829-第2853)

但上述設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其擴(kuò)增效果均不如rs5-f、rs5-r和ss5-f、ss5-r的檢測(cè)效果，見圖2。因此本實(shí)施例選用上述優(yōu)選的引物為pcr檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒的最佳引物對(duì)。

實(shí)施例2水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒的rt-pcr檢測(cè)方法的特異性評(píng)價(jià)

田間取玉米矮花葉病和玉米粗縮病病癥明顯的植株，提取葉片rna，反轉(zhuǎn)錄后采用實(shí)施例1中的優(yōu)選引物rs5-f、rs5-r和ss5-f、ss5-r進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示玉米矮花葉病病株均呈陰性，而玉米粗縮病病株均呈陽(yáng)性，如圖3所示。說明本發(fā)明實(shí)施例1篩選的水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒的優(yōu)選引物對(duì)特異性良好，能夠特異性檢測(cè)玉米粗縮病病株的病原。

實(shí)施例3本發(fā)明的水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒rt-pcr檢測(cè)玉米粗縮病病原

采用實(shí)施例1中篩選的水稻黑條矮縮病毒和南方水稻黑條矮縮病毒的優(yōu)選檢測(cè)引物rs5-f、rs5-r和ss5-f、ss5-r鑒定玉米粗縮病病原。

分別選擇在我國(guó)黃淮海地區(qū)(r1、r2、r3)和海南省(s1、s2、 s3)采集的玉米粗縮病癥狀典型的植株，采集病葉保存于-80℃冰箱。transzoltmup(transgenbiotech)法提取單株玉米葉片總rna，采用fastquantrtkit(withgdnase)(tiangen)試劑盒反轉(zhuǎn)錄，利用優(yōu)選引物rs5-f/rs5-r和ss5-f/ss5-r分別進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，樣品r1、r2和r3采用rs5-f/rs5-r引物對(duì)擴(kuò)增時(shí)可以檢測(cè)到約420bp大小的目的條帶，而采用ss5-f/ss5-r引物對(duì)擴(kuò)增時(shí)無目的條帶(圖4的a圖)。樣品s1、s2和s3采用ss5-f/ss5-r引物對(duì)擴(kuò)增時(shí)可以檢測(cè)到約403bp大小的目的條帶，而采用rs5-f/rs5-r引物對(duì)擴(kuò)增時(shí)無目的條帶(圖4的b圖)。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。