本發(fā)明涉及重組蛋白的制備方法，特別涉及血栓治療的重組蛋白藥物異源二聚體蛇毒蛋白的制備方法。

背景技術：

心腦血管疾病尤其是血栓引起的腦梗塞和心機梗塞嚴重威脅著人類健康，影響患者的生存質量。這類疾病是目前世界上的第三大致死因素，不僅在急性發(fā)作期給病人的生命帶來極大的威脅，而且由于極易發(fā)生的愈后不良，導致物力、財力的巨大耗費。因此，對這類疾病尋找新的安全有效的藥物迫在眉睫，而蛇毒對凝血系統(tǒng)的作用越來越受到人們的重視，蛇毒中某些成分是治療上述疾病的有效藥物。

尖吻蝮蛇蛇毒抗血小板溶栓素是在中國科大生命學院多年對蛇毒蛋白組分分離、純化和活性研究的基礎上發(fā)現(xiàn)的一種C型凝集素樣蛋白，命名為Agkisacutacin，中文名為抗血小板溶栓素。Agkisacutacin為異源二聚體，兩個亞基表觀分子量非常接近，均在14-15kDa左右。經(jīng)MALDI-TOF MS精確測定了Agkisacucetin的分子量為30kDa。通過氨基酸N端序列測定、LC-MS和Agkisacucetin蛋白的晶體結構等方法，最終得到Agkisacucetin的序列和晶體結構。Agkisacutacin具有抑制血小板聚集的活性，前期的研究為將該蛋白開發(fā)成新型一類抗血栓藥物奠定了重要基礎。

目前Agkisacutacin主要來源是天然蛇毒的提取，天然蛇毒來源有限，純化步驟復雜，且得率較低，因此限制了Agkisacutacin作為抗血栓藥物的科學研究和臨床應用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供重組質粒pPIC9K-A，如圖1所示，其中Agkisacutacin A鏈基因序列如SEQ ID NO.1所示；質粒pUCZ-B，如圖2所示，其中Agkisacutacin B鏈基因序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還提供一種轉化體，含有重組質粒pPIC9K-A、質粒pUCZ-B之一或其組合。

本發(fā)明還提供轉化體，其表達重組異源二聚體蛇毒蛋白，所述異源二聚體蛇毒蛋白由A鏈、B鏈兩條肽鏈組成，其中，A鏈氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，B鏈氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

作為優(yōu)選，所述轉化體為細胞株畢赤酵母菌株。

特別的，在本發(fā)明的實施例部分，提供保藏編號為CCTCC No.M2016358的細胞株，分類命名為巴斯德畢赤酵母GS115。其表達重組異源二聚體蛇毒蛋白，所述異源二聚體蛇毒蛋白由A鏈、B鏈兩條肽鏈組成，A鏈氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，B鏈氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本發(fā)明還提供所述質粒、所述轉化體在制備血栓治療藥物中的用途。

本發(fā)明還提供一種大量表達重組異源二聚體蛇毒蛋白的方法，包含以下幾個步驟：

Batch階段：取權利要求4-6任一項所述的轉化體二級種接入含pH4.0～6.0的基礎鹽培養(yǎng)基中，添加甘油至4％，擴增菌體，溶解氧含量DO急劇上升時，batch階段結束；

轉化期：持續(xù)補充含有10-15ml/L PTM1的50％甘油溶液，流速為10-15ml/h/L，這個過程維持至濕重在190-200g/L；

甲醇誘導階段：當濕重達到190-200g/L時，停止甘油流加，按恒定甲醇流速限制性流加含有12ml/L PTM1的甲醇溶液；攪拌速度800-1200rpm，總共發(fā)酵70-90小時，濕重達400-600g/L；濕重g/L是指每升培養(yǎng)液中含有的菌體重量。

蛋白純化：發(fā)酵結束后，調節(jié)發(fā)酵液pH至8.0，經(jīng)過高速離心、過柱，純化得到重組異源二聚體蛇毒蛋白。

作為優(yōu)選，整個過程溫度為28-34℃。

本發(fā)明還提供所述方法制備的重組蛋白。

本發(fā)明采用全基因合成方式，由已知的Agkisacutacin的蛋白序列和結構形式獲得其編碼基因，發(fā)現(xiàn)甲醇利用型畢赤酵母一個是理想的Agkisacutacin表達系統(tǒng)，通過重組表達獲得大量高純度Agkisacutacin。實驗驗證酵母表達的重組Agkisacutacin為一異源二聚體蛋白，且具有生物學活性。

本發(fā)明首次利用巴斯德畢赤酵母表達Agkisacutacin，并進行了中試規(guī)模的發(fā)酵工藝研究，在高密度發(fā)酵條件下表達量超過10mg/L；通過三步純化，純度達到95％以上。此外本發(fā)明還為Agkisacutacin的生產(chǎn)提供了一種簡單但是穩(wěn)健的發(fā)酵工藝。

生物材料保藏說明

保藏編號為CCTCC No.M2016358的細胞株于2016年6月30日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢市武漢大學，分類命名為巴斯德畢赤酵母GS115(Pichia pastoris GS115)。

附圖說明

圖1為Agkisacutacin A鏈表達載體結構示意圖；

圖2為Agkisacutacin B鏈表達載體結構示意圖；

圖3為Agkisacutacin的表達菌株Western Blot檢測結果；

圖4為Agkisacutacin的高表達菌株Western Blot檢測結果；

圖5為重組Agkisacutacin中試規(guī)模的發(fā)酵表達條件時間曲線；

圖6為重組Agkisacutacin中試規(guī)模的雙鏈、A鏈、B鏈不同誘導時間的表達情況；

圖7示蛋白Agkisacutacin的鑒定；

圖8示蛋白Agkisacutacin的純化；

圖9示重組Agkisacutacin的GP1b結合活性檢測結果。

具體實施方式

本發(fā)明公開了一種異源二聚體蛇毒蛋白的制備方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品、方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發(fā)明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。

下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明：

1.實驗材料

1.1菌株與質粒

P.pastoris菌株GS115、pPIC9K載體購自Invitrogen公司，pUCZ載體(Zeocin抗性)由本室構建。

1.2試劑

Yeast nitrogen base(YNB)購自BD公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清購自Gibco公司；Yeast extract和Trypton購自OXOID公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自Pierce公司；d-Sorbitol、d-biotin、質粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒、DNA聚合酶、T4DNA鏈接酶、限制性內切酶、蛋白marker和PAGE配置相關試劑購自上海生工；PHA和Endoglycosidase H(Endo H)購自Sigma-Aldrich公司；EZ-ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自Biological Industries公司；其他化學試劑購自國藥集團。含硅泡敵購自江蘇賽歐信越消泡劑有限公司；抗Agkisacutacin抗體1B9來源于兆科公司。

1.3儀器

電子分析天平和pH計購自梅特勒-托利多公司；漩渦振蕩儀購自Scientific Industries公司；電泳儀，垂直電泳槽、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)購自天能公司；半干轉膜儀、電轉儀購自Bio-Rad公司；化學發(fā)光檢測儀購自UVITEC公司；高壓滅菌鍋購自Hirayama公司；臺式冷凍離心機(Centrifuge 5810R、Centrifuge 5415R)購自eppendorf公司；超凈工作臺、搖床、恒溫培養(yǎng)箱購自上海智誠公司；PCR儀購自德國Biometra公司；酶標儀(BLX-800)購自Bio-Tek公司；微量移液器購自法國Gilson公司；細胞培養(yǎng)箱購自Themo公司；AKTA explorer、Labscale TFF System和Pellicon XL(10kD)購自Millipore公司；115Benchtop Fermentor購自New Brunswick Scientific公司，大滅菌鍋；Flex Stand system和0.45μm microfiltration cartridge購自GE healthcare；LTQ linear IT MS購自Thermo；EttanTM MDLC HPLC system購自GE healthcare；

1.4引物

1.AgkiA-Fw-Xho1:TCTCTCGAGAAAAGAGATGTCGATTGTCTCCCTGGTTGGTC

2.AgkiA-Rv-Not1-ng:ATATGCGGCCGCTTATGGCGGGGACTTGCAGACGAAAG

3.AgkiB-Fw-EcoR1:CTGAATTCGGTTTCTGTTGTCCCTTGCGTTGTTCG

4.AgkiB-Rv-Not1-ng:ATATGCGGCCGCTTATAGCTTGAACTTGCAGACGAAATAG

2.實驗方法

2.1Agkisacutacin A鏈表達載體構建

一、具有EcoR1與Not1酶切位點的A鏈目的基因的擴增

全基因合成A鏈DNA序列，在引物AgkiA-Fw-Xho1和AgkiA-Rv-Not1-ng的引導下進行PCR擴增，PCR反應條件為：先94℃2分鐘；然后94℃30秒，55℃40秒，72℃30秒，共32個循環(huán)；最后72℃10分鐘。反應結束后，對PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約396bp的條帶，與預期結果相符。用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收目的條帶。

二、重組Agkisacutacin A鏈的畢赤酵母表達載體的構建

用限制性內切酶EcoR1和Not1對上步獲得的PCR產(chǎn)物進行雙酶切，再將酶切片段與經(jīng)相同酶雙酶切的質粒pPIC9K用T4DNA連接酶進行連接，將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性重組子，提質粒，酶切鑒定，在將鑒定后的陽性克隆命名為pPIC9K-A，并送上海生工測序，測序結果顯示插入pPIC9K的EcoR1和Not1的識別位點間的DNA序列與預期結果完全一致。

2.2Agkisacutacin B鏈表達載體構建

一、具有EcoR1與Not1酶切位點的B鏈目的基因的擴增

全基因合成B鏈DNA序列，在引物AgkiB-Fw-EcoR1和AgkiB-Rv-Not1-ng的引導下進行PCR擴增，PCR反應條件為：先94℃2分鐘；然后94℃30秒，55℃40秒，72℃30秒，共32個循環(huán)；最后72℃10分鐘。反應結束后，對PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約381bp的條帶，與預期結果相符。用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收目的條帶。

二、重組Agkisacutacin B鏈的畢赤酵母表達載體的構建

用限制性內切酶EcoR1和Not1對上步獲得的PCR產(chǎn)物進行雙酶切，再將酶切片段與經(jīng)相同酶雙酶切的質粒pPIC9K用T4DNA連接酶進行連接，將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性重組子，提質粒，酶切鑒定，在將鑒定后的陽性克隆命名為pPIC9K-B，并送上海生工測序，測序結果與預期結果完全一致。將該克隆質粒使用BamH1和Not1進行雙酶切，回收小片段，將回收的小片段與經(jīng)相同酶雙切的質粒pUCZ用T4DNA連接酶進行連接，將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性重組子，提質粒，酶切鑒定，在將鑒定后的陽性克隆命名為pUCZ-B，并送上海生工測序，測序結果與預期結果完全一致。

2.3重組Agkisacutacin表達克隆的篩選

將畢赤酵母菌株GS115在YPD平板劃線。兩天后，將長出的單克隆挑到YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。兩天后，酵母生長為乳白色，將此一級種接入YPD液體培養(yǎng)基中，此為二級種。使用此二級種制備酵母感受態(tài)，向其中電轉化入已經(jīng)用Sal1酶線性化的pPIC9K-A質粒，涂MD平板。48-72小時后，將平板上長出的單克隆挑入MGY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，兩天后，將該培養(yǎng)物1500g離心，棄上清，向其中加入pH5.0的BMMY培養(yǎng)基，誘導72小時，在此過程中，每24小時補充一次100％的甲醇，使BMMY培養(yǎng)基中甲醇濃度維持在0.5％。誘導結束之后，12000g離心，收集上清，SDS-PAGE檢測A鏈蛋白是否表達，篩選出表達A鏈的單克隆。

將此表達A鏈蛋白的GS115單克隆在MD板劃線。兩天后，將長出的單克隆挑到MGY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。兩天后，酵母生長為乳白色，將此一級種接入YPD液體培養(yǎng)基中，此為二級種。使用此二級種制備酵母感受態(tài)，向其中電轉化入已經(jīng)用Spe1酶線性化的pUCZ-B質粒，涂添加抗生素Zeocin的MD平板。48-72小時后，將平板上長出的單克隆挑入添加抗生素Zeocin的MGY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，兩天后，將該培養(yǎng)物1500g離心，棄上清，向其中加入pH5.0的BMMY培養(yǎng)基，誘導72小時，在此過程中，每24小時補充一次100％的甲醇，使BMMY培養(yǎng)基中甲醇濃度維持在0.5％。誘導結束之后，12000g離心，收集上清，使用抗Agkisacutacin單克隆抗體進行Western Blot檢測雙鏈蛋白是否表達，篩選出表達雙鏈的單克隆畢赤酵母GS115，其保藏編號為CCTCC No.M2016358，于2016年6月30日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，分類命名為巴斯德畢赤酵母GS115(Pichia pastoris GS115)。

2.4重組Agkisacutacin的發(fā)酵表達

(1)一級種：從凍存的工作菌種庫接種到4ml加入Zeocin的MGY培養(yǎng)基(MGY+Z)，30℃，250rpm培養(yǎng)36-48h至OD₆₀₀＝2-6，此為發(fā)酵一級種；

(2)二級種：接1ml從1級種到200ml pH5.0BMGY中,30℃，250rpm培養(yǎng)12-18h，至OD₆₀₀＝2-6，此為發(fā)酵二級種；

(3)發(fā)酵準備：發(fā)酵罐組裝及相關試劑準備、滅菌等工作；

(4)Batch階段：將二級種接入含4L pH5.0的基礎鹽培養(yǎng)基的14L發(fā)酵罐中，使用含有4％甘油的基礎鹽培養(yǎng)基(pH 5.0)在batch階段擴增菌體，培養(yǎng)溫度30℃。等到DO急劇上升時，batch階段結束。

(5)轉化期：當DO開始急速上升時意味著原有培養(yǎng)基中甘油耗盡，需要持續(xù)補充含有12ml/L PTM1的50％甘油溶液，流速為12ml/h/L，這個過程維持4h至濕重在190g/L附近；

(6)甲醇誘導階段：當濕重達到190g/L附近時，停止甘油流加，溶解氧會迅速上升，隨后開始按恒定甲醇流速限制性流加含有12ml/L PTM1的甲醇溶液。溫度控制在30℃；攪拌速度1000rpm左右，總共發(fā)酵80小時左右，濕重達500g/L左右。

2.5重組Agkisacutacin的純化

(1)固液分離：發(fā)酵結束之后，使用NaOH緩緩地將發(fā)酵液pH調節(jié)到8.0，10000g,20min離心，收集上清液；

(2)樣品的澄清：使用Flex Stand system0.22μm過濾澄清。

(3)蛋白捕獲：離子交換柱捕獲發(fā)酵液中的重組Agkisacutacin。使用Flexstand超濾/過濾系統(tǒng)將發(fā)酵液透析除鹽，除鹽后的樣品流過CM FF柱，使用30％的buffer B洗脫樣品。

(4)精細純化：將30％Elution中的部分樣品，通過Q HP進一步純化，梯度洗脫，連續(xù)收集各峰樣品，通過SDS-PAGE檢測重組Agkisacutacin純度。

(5)保存：用PBS凍存蛋白備用。

2.6重組Agkisacutacin的活性檢測

(1)天然提取的Agkisacutacin可以結合GP1b位點，我們進行了重組Agkisacutacin與重組GPⅠb結合能力的檢測實驗。

(2)天然提取的Agkisacutacin可以抗血小板凝集，我們進行了重組Agkisacutacin抑制血小板凝集的實驗。

3實驗結果

3.1Agkisacutacin表達載體的構建，如圖1、圖2所示。

Agkisacutacin A鏈全長132個氨基酸，我們將A鏈的編碼序列連接到畢赤酵母α-Factor信號肽3’末端，克隆到pPIC9K酵母表達載體中。這樣通過甲醇誘導AOXⅠ啟動子驅動其下游蛋白的表達。

Agkisacutacin B鏈全長127個氨基酸，我們將B鏈的編碼序列連接到畢赤酵母α-Factor信號肽3’末端，克隆到pUCZ酵母表達載體中。這樣通過甲醇誘導AOXⅠ啟動子驅動其下游蛋白的表達。

3.2Agkisacutacin表達菌株的篩選

經(jīng)過多次篩選之后，得到表達Agkisacutacin的克隆，Western Blot檢測結果如圖3所示。

對其中的1號克隆進行復篩，得到7個表達克隆，使用Western Blotting檢測這些克隆中Agkisacutacin表達情況，均有效地表達出重組Agkisacutacin，見圖4。

3.3重組Agkisacutacin中試規(guī)模的發(fā)酵表達

恒定甲醇流速限制性流加甲醇進行表達菌分批補料培養(yǎng)(fed-batch cultivation)。首先使用含有4％甘油的基礎鹽培養(yǎng)基(pH 5.0)在batch階段擴增菌體，培養(yǎng)溫度30℃。等到DO急劇上升時，batch階段結束，菌體濕重達到134.7g/L。隨后進入轉換期即甘油流加期，經(jīng)過約4個小時的生長菌體濕重進一步增加，達到193.6g/L。此時停止流加甘油，菌體呼吸活力下降，DO迅速上升；隨后開始進行甲醇誘導，菌體呼吸活力恢復，DO開始逐漸下降。在甲醇誘導階段，因為菌體對甲醇有一個適應階段(2-4小時)，因此需要在這段時間內逐步提高甲醇濃度，避免甲醇過量積累對菌體產(chǎn)生毒性。整個發(fā)酵過程非常穩(wěn)定，各個參數(shù)都穩(wěn)定在設定范圍之內。發(fā)酵結束之后，OD₆₀₀超過300，菌體濕重達到511.5g/L。檢測結果表明整個發(fā)酵過程中，菌體的死亡率一直維持較低的水平，甲醇濃度也穩(wěn)定在極低水平，維持菌體的限制性生長，見圖5、圖6。盡管菌體濕重在誘導過程中一直在增加，但是蛋白的表達量在培養(yǎng)80小時(或誘導60小時)就基本達到平衡，不再累計。因此在此時結束發(fā)酵比較適合。

3.4Agkisacutacin純化與鑒定

發(fā)酵結束之后，調節(jié)發(fā)酵液pH至8.0，經(jīng)過高速離心和Flexstand0.22um過濾澄清，用BCA測定發(fā)酵液中總蛋白含量為1.6g/L，并通過SDS-PAGE估算rAgkisacutacin的濃度超過100mg/L。由于本工程中心目前尚無rAgkisacutacin檢測的ELISA試劑盒，因此暫時無法準確定量。

由于rAgkisacutacin沒有攜帶任何tag，且我們工程中心沒有rAgkisacutacin抗體親和層析柱，因此我們嘗試使用離子交換柱捕獲發(fā)酵液中的rAgkisacutacin。使用Flexstand超濾/過濾系統(tǒng)將發(fā)酵液透析除鹽，除鹽后的樣品流過CM FF柱，使用10％和30％的buffer B洗脫樣品(前期已使用1ml小型離子交換柱初步摸索過純化條件)，從檢測結果可知，rAgkisacutacin主要在30％的Elution中(通過還原條件下+DTT的SDS-PAGE中15kDa位置是否有兩條緊密相連的條帶，來確定該樣品中是否含有rAgkisacutacin，通過非還原條件下SDS-PAGE看蛋白純度)。10％的Elution也含有少量rAgkisacutacin，且A鏈含量比B鏈高，因此10％的Elution中應該有少量AA同源二聚體(圖7A)。將30％Elution中的部分樣品，通過Q HP進一步純化，梯度洗脫出現(xiàn)5個峰，其中兩個峰連續(xù)收集了2-3管樣品(P1和P2)，通過觀察還原條件下SDS-PAGE中15kDa位置的兩條帶發(fā)現(xiàn)，rAgkisacutacin主要在P2峰中，特別是P2-2樣品，雜質最少；P3峰中A鏈含量比B鏈高，因此會有AA同源二聚體污染；P1、P4、P5不含A、B鏈(圖7B)。

由于P2-2樣品主要含有兩條帶，且位置相差較大，因此我們采用分子篩進行純化。與預期一致，這兩條帶可以很好的分離開來，經(jīng)檢測確認分子篩中P2為我們所需的目的蛋白rAgkisacutacin，非還原條件一下為一條均勻的帶，還原條件下為兩條含量基本一致的帶(圖8，P1’和P2’分別表示P1和P2的峰尖)。目前尚未對上述分子篩中P2和P2’進行純度鑒定，目測應該可以達到90％的純度。經(jīng)初步估算，從1L發(fā)酵液中，大約可以獲得純化樣品10mg。

3.5Agkisacutacin活性測定

對純化產(chǎn)物進行了GPⅠb結合活性檢測和抗血小板凝集活性檢測兩個方面的實驗。GPⅠb結合活性檢測結果表明，重組Agkisacutacin可以與重組GPⅠb很好的結合，估算相對親和力常數(shù)為10^-7M(如圖9)?？寡“迥钚杂烧卓乒具M行檢測，實驗結果表明，當?shù)鞍琢窟_到2ug時，在檢測系統(tǒng)中可以100％抑制血小板聚集；當?shù)鞍琢繛?ug時無抑制活性。上述實驗均定性地表明，酵母來源的重組Agkisacutacin具有生物學活性和生理功能。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。