本發(fā)明屬于具有應(yīng)用潛力的一種生物防治作用的致病桿菌SN84菌株，該菌株及代謝產(chǎn)物對(duì)番茄灰霉具有較好的抑菌活性。

背景技術(shù)：

番茄灰霉病是番茄生產(chǎn)中常見(jiàn)且危害較重的病害，由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea )侵染引起，發(fā)生非常廣泛?；移咸焰叩募闹鞣秶鷱V泛，可危害番茄、辣椒、茄子、黃瓜等多種作物；該病害除危害田間的作物外，還可危害運(yùn)輸和儲(chǔ)藏期間的水果和蔬菜，造成進(jìn)一步的經(jīng)濟(jì)損失。由于對(duì)灰葡萄孢的抗性資源很少，生產(chǎn)中主要依靠化學(xué)防治的方法，常用的化學(xué)殺菌劑包括苯并咪唑類(lèi)、N-苯基氨基甲酸酯類(lèi)、二甲酰亞胺類(lèi)和苯胺基嘧啶類(lèi)。由于大面積、長(zhǎng)時(shí)間的使用單一種類(lèi)的殺菌劑和不合理的施藥技術(shù)，導(dǎo)致灰葡萄孢對(duì)某些常規(guī)的殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性和農(nóng)藥殘留，并且愈加嚴(yán)重，導(dǎo)致了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，隨著對(duì)食品安全的關(guān)注，生產(chǎn)中亟需開(kāi)發(fā)高效且低毒的殺菌劑防治病害。

近年來(lái)，利用生物防治的方法對(duì)番茄灰霉病進(jìn)行控制得到了較多的研究，通過(guò)篩選獲得地衣芽孢桿菌、木霉菌和芽孢桿菌對(duì)灰葡萄孢的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用；植物精油、抗真菌蛋白、石榴皮提取物、丁香提取物等多種物質(zhì)對(duì)灰葡萄孢有一定的抑制作用。但是存在的普遍問(wèn)題是抑制效果較差，大多數(shù)的研究處于實(shí)驗(yàn)室階段，投入生產(chǎn)中的產(chǎn)品較少。利用生物防治病害的主要缺點(diǎn)是防治效果較差。生防相關(guān)研究主要局限在實(shí)驗(yàn)室研究，在生產(chǎn)中缺乏應(yīng)用。

辣椒疫霉（Phytophthora capsici）和大豆疫霉(Phytophthora sojae)屬鞭毛菌亞門(mén)（Mastigomycotina）卵菌綱（Oomycetes）病原微生物，在分類(lèi)、生理生化等方面同真菌具有較大差別，常用的殺菌劑對(duì)病害的防治效果較差。

辣椒疫病是由辣椒疫霉菌侵染引起的一種病害。該病于 1918 年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)，迄今已在世界各地的辣椒種植區(qū)普遍發(fā)生，已成為當(dāng)今世界各地辣椒種植區(qū)的主要病害之一。辣椒疫霉的寄主范圍廣，除辣椒外，還可侵染茄科的番茄、茄子和葫蘆科的黃瓜、西瓜、甜瓜、南瓜等。另有文獻(xiàn)報(bào)道，該菌還可侵染可可樹(shù)、澳洲堅(jiān)果屬山龍眼（Macasamia）及一些豆科植物。

辣椒疫霉可經(jīng)雨水、土壤、氣流等多種途徑傳播，危害多種作物。辣椒發(fā)病時(shí)可造成莖桿壞死、葉部枯萎、果實(shí)腐爛、整株萎蔫死亡，導(dǎo)致田間大面積死秧。我國(guó)最早在上世紀(jì)50年代在江蘇發(fā)現(xiàn)辣椒疫病，目前該病已危及我國(guó)的青海、新疆、上海、浙江、北京、云南、遼寧、甘肅、陜西、貴州、四川、廣東等許多省區(qū)。并且呈逐年加重趨勢(shì)，給辣椒的生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失。為此，國(guó)家將選育抗疫病辣椒品種列入“八五”攻關(guān)項(xiàng)目，組織多方力量，加大研究力度。由于辣椒疫病是一種土傳病害，利用化學(xué)藥劑對(duì)其進(jìn)行防治，效果甚微，且容易造成土壤和環(huán)境污染。因此，利用生物防治病害凸顯出其優(yōu)勢(shì)。

大豆疫霉根腐病是大豆的毀滅性病害。美國(guó)最早發(fā)現(xiàn)此病，受害也最為嚴(yán)重。大豆疫霉根腐病在大豆的整個(gè)生育期內(nèi)均可發(fā)生。病原菌可侵染植株的根、莖、葉和部分豆莢，在感病品種上造成的損失達(dá) 25～50%，環(huán)境條件適宜個(gè)別高感品種產(chǎn)量損失達(dá)100%。被害植株種子的蛋白質(zhì)含量明顯降低。我國(guó)每年進(jìn)口的大豆數(shù)量在數(shù)千萬(wàn)噸，大豆疫霉隨進(jìn)口大豆傳入的風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越大。1991 年以前我國(guó)尚未報(bào)道有大豆疫霉根腐病分布。1991 年沈崇堯等首次報(bào)道在我國(guó)東北地區(qū)發(fā)現(xiàn)大豆疫霉。我國(guó) 1986 年將大豆疫霉根腐病列為對(duì)外植物檢疫對(duì)象，1992 年被列為“進(jìn)境植物檢疫危險(xiǎn)性病、蟲(chóng)、雜草名錄”中第一類(lèi)病害，1995 年大豆疫霉根腐病又被列為國(guó)內(nèi)植物檢疫對(duì)象，確定的分布范圍只在黑龍江省。1996 年李寶英等報(bào)道了大豆疫霉在黑龍江省三江平原的危害情況，引起了國(guó)家農(nóng)業(yè)部、動(dòng)植物檢疫局、黑龍江省政府等有關(guān)部門(mén)的高度重視。大豆疫霉根腐病在我國(guó)也有逐漸加重趨勢(shì)，1994 年發(fā)生面積為 10 萬(wàn)畝，1995年為30 萬(wàn)畝，1996 年達(dá)到 100 萬(wàn)畝，平均每年以 3 倍的速度擴(kuò)展。大豆疫霉根腐病是否會(huì)在中國(guó)主要大豆產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，如何有效控制其危害和傳播，將是中國(guó)大豆生產(chǎn)面臨的重要課題。

植物病害生物防治是利用有益微生物和微生物代謝產(chǎn)物對(duì)農(nóng)作物病害進(jìn)行有效防治的技術(shù)與方法。昆蟲(chóng)病原線(xiàn)蟲(chóng)殺死寄主以后，腸道中共生的致病桿菌能夠分泌多種具有殺菌活性的次生代謝產(chǎn)物，保護(hù)死亡的昆蟲(chóng)免遭細(xì)菌和真菌的侵染。因此，昆蟲(chóng)病原線(xiàn)蟲(chóng)共生菌是是極具潛力的活性代謝產(chǎn)物開(kāi)發(fā)靶標(biāo)。

本發(fā)明通過(guò)在我國(guó)東北三省不同地區(qū)誘捕土壤中的昆蟲(chóng)病原線(xiàn)蟲(chóng)，分離得到昆蟲(chóng)病原線(xiàn)蟲(chóng)腸道中的共生菌，對(duì)共生菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)試發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)不同病原菌的抑制作用。獲得的來(lái)自致病桿菌SN84的發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉、辣椒疫霉及大豆疫霉具有良好的控制效果，在平板抑菌試驗(yàn)中能有有效抑制菌絲的生長(zhǎng)，在番茄灰霉病的盆栽試驗(yàn)中有效減輕植株的發(fā)病，結(jié)果顯示該菌株具有較好的應(yīng)用潛力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是通過(guò)分離昆蟲(chóng)病原線(xiàn)蟲(chóng)共生菌和抑菌實(shí)驗(yàn)，獲得代謝產(chǎn)物具有抑菌活性的致病桿菌菌株SN84，在平板抑菌試驗(yàn)和盆栽藥效試驗(yàn)中均具有較好的防治效果，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。為防治番茄灰霉病、辣椒疫霉菌病和大豆疫霉菌病提供一種高效、特異性強(qiáng)的生物防治方法。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：

一株具有抑菌活性的細(xì)菌，其特征在于該細(xì)菌菌株為菌株SN84（Xenorhabdus budapestensis），該菌株保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為cctcc M2015214。

一種具有抑菌活性的細(xì)菌的代謝物，其特征在于該代謝物是由菌株SN84經(jīng)液體發(fā)酵制備的所得。

上述具有抑菌活性的細(xì)菌的代謝物，其特征在于代謝物制備過(guò)程如下：先于NBTA平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天；然后將SN84的單個(gè)菌落接種到試管LB培養(yǎng)基中，28℃，180 rpm搖床中培養(yǎng)24 h，獲得試管種；再將試管種以9%的接菌量接種到液體A培養(yǎng)基中，28℃，180 rpm搖床中培養(yǎng)72 h；將發(fā)酵液在12000 rpm，4℃的條件下離心10 min，最后用0.22μm的濾菌膜過(guò)濾即得。

上述具有抑菌活性的細(xì)菌的代謝物，其特征在于代謝物制備中采用的LB液體培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨 10g/L、酵母提取物 5 g/L、NaCl 10 g/L，余下為蒸餾水，pH為7；A液體培養(yǎng)基配方為：葡萄糖 6.13 g/L、蛋白胨 21.29 g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L、（NH₄）₂SO₄ 2.46 g/L、KH₂PO₄ 0.86 g/L、K₂HPO₄·3H₂O 1.45 g/L、Na₂SO₄ 1.72 g/L余下為蒸餾水，pH為7.2-7.4。

一種具有抑菌活性的細(xì)菌的代謝物的應(yīng)用，其特征在于，將發(fā)酵液分別按0%、2%、4%、6%、8%、10%的比例加入PDA培養(yǎng)基中后接入番茄灰霉菌，抑制番茄灰霉菌的菌絲生長(zhǎng)。

一種具有抑菌活性的細(xì)菌的代謝物的應(yīng)用，其特征在于，將發(fā)酵液分別按0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的比例加入V8培養(yǎng)基中后接入辣椒疫霉或大豆疫霉，抑制辣椒疫霉或大豆疫霉的菌絲生長(zhǎng)。

一種具有抑菌活性的細(xì)菌的代謝物的應(yīng)用，其特征在于，將發(fā)酵液分別按0%、2%、4%、6%、8%、10%的比例噴灑于番茄幼苗葉片上，防治番茄灰霉病。

本發(fā)明的積極效果：抑菌活性的致病桿菌SN84代謝產(chǎn)物可抑制番茄灰霉、辣椒疫霉和大豆疫霉的菌絲生長(zhǎng)，通過(guò)向番茄幼苗噴灑的方式，提高幼苗的抗病性，從而保證作物產(chǎn)量。在平板中顯著抑制番茄灰霉、辣椒疫霉和大豆疫霉的菌絲生長(zhǎng)；在盆栽試驗(yàn)中抑制番茄灰霉病的發(fā)生，使作物健康生長(zhǎng)。

S菌株Xenorhabdus sp. SN84，已于2015年4月9日保藏在中國(guó)武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為cctcc M2015214。

附圖說(shuō)明

圖1是向馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基中分別加入不同比例的發(fā)酵液制成含藥平板，在28℃的條件下培養(yǎng)7-10天后的抑菌效果。

圖2是向V8培養(yǎng)基中分別加入不同比例的發(fā)酵液制成含藥平板，在28℃的條件下培養(yǎng)7-10天后的抑菌效果。

圖3是向V8培養(yǎng)基中分別加入不同比例的發(fā)酵液制成含藥平板，在28℃的條件下培養(yǎng)7-10天后的抑菌效果。

圖4是發(fā)酵液稀釋2%，4%，6%，8%，10%后噴灑番茄植株葉面，24 h后接種病原菌，培養(yǎng)7-15天后的防治效果。

具體實(shí)施方式

首先對(duì)SN84菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，然后對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物進(jìn)行抑菌活性試驗(yàn)，確定其對(duì)番茄灰霉菌的作用。

實(shí)施例1：菌株SN84的培養(yǎng)

將保存的SN84菌株劃線(xiàn)于平板NBTA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為NBTA培養(yǎng)基，即牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、瓊脂15 g/L、NaCl 5 g/L、TTC 0.04 g/L、BTB 0.025 g/L、蒸餾水1 L,pH為7.2-7.4。28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。

實(shí)施例2：

將SN84的單個(gè)菌落接種到試管LB培養(yǎng)基中（每管裝5 mL），LB培養(yǎng)基配方：即胰蛋白胨 10 g/L、酵母提取物 5 g/L、NaCl 10 g/L，蒸餾水1L，pH為7。28℃，180 rpm搖床中培養(yǎng)24 h，獲得試管種。

再將試管種接種到250 mL三角瓶（每瓶裝40 mL）液體A培養(yǎng)基中， A培養(yǎng)基配方：即葡萄糖 6.13 g/L、蛋白胨 21.29 g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L、（NH₄）₂SO₄ 2.46 g/L、KH₂PO₄0.86 g/L、K₂HPO₄·3H₂O 1.45 g/L、Na₂SO₄ 1.72 g/L、蒸餾水1 L，pH為7.2-7.4。28℃，180 rpm搖床中培養(yǎng)72 h。

將發(fā)酵液在12000 rpm，4℃的條件下離心10 min，最后用0.22μm的濾菌膜過(guò)濾后配成不同的倍數(shù)進(jìn)行抑菌藥效試驗(yàn)。

實(shí)施例3：平板抑菌活性試驗(yàn)（見(jiàn)圖1）

將發(fā)酵液分別以0%、2%、4%、6%、8%、10%的（mL/mL）比例加入40-45℃的PDA培養(yǎng)基中后定量加入到培養(yǎng)皿中，制成含藥平板（PDA培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g；葡萄糖20 g；瓊脂17 g;蒸餾水1000 mL）。將培養(yǎng)7天的番茄灰霉菌塊倒扣于含藥平板中，培養(yǎng)條件為28℃。培養(yǎng)7-10天后測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑制率和EC₅₀。

（對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑）-（生長(zhǎng)組菌落直徑-菌餅直徑）

抑制率（%）=--------------------------------------------------------×100%

（對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑）

菌落直徑為十字交叉法測(cè)量；EC₅₀使用EXCEL作圖獲得的公式計(jì)算得到。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，隨著濃度的升高抑菌效果明顯增強(qiáng)，且經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，穩(wěn)定性良好。

實(shí)施例4：平板抑菌活性試驗(yàn)（見(jiàn)圖2）

將發(fā)酵液分別以0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的（mL/mL）比例加入40-45℃的V8培養(yǎng)基中后定量加入到培養(yǎng)皿中，制成含藥平板（V8培養(yǎng)基配方：進(jìn)口V8果汁163 mL；碳酸鈣1.63 g；瓊脂1.5 g/100 mL;蒸餾水1630 mL）。將培養(yǎng)7天的辣椒疫霉菌菌塊倒扣于含藥平板中，培養(yǎng)條件為28℃。培養(yǎng)7-10天后測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑制率和EC₅₀。

（對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑）-（生長(zhǎng)組菌落直徑-菌餅直徑）

抑制率（%）=--------------------------------------------------------×100%

（對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑）

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，隨著濃度的升高抑菌效果明顯增強(qiáng)，且經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)穩(wěn)定性良好。

實(shí)施例5：平板抑菌活性試驗(yàn)（見(jiàn)圖3）

將發(fā)酵液分別以0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的（mL/mL）比例加入40-45℃的V8培養(yǎng)基中后定量加入到培養(yǎng)皿中，制成含藥平板（V8培養(yǎng)基配方：進(jìn)口V8果汁163 mL；碳酸鈣1.63 g；瓊脂1.5 g/100 mL;蒸餾水1630 mL）。將培養(yǎng)7天的辣椒疫霉菌菌塊倒扣于含藥平板中，培養(yǎng)條件為28℃。培養(yǎng)7-10天后測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑制率和EC₅₀。

（對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑）-（生長(zhǎng)組菌落直徑-菌餅直徑）

抑制率（%）=--------------------------------------------------------×100%

（對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑）

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，隨著濃度的升高抑菌效果明顯增強(qiáng)，且經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)穩(wěn)定性良好。

實(shí)施例6：盆栽抑菌活性實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)圖4）

將發(fā)酵液分別以0%、2%、4%、6%、8%、10%的比例噴灑于番茄幼苗葉片，24 h后接種培養(yǎng)7天的番茄灰霉菌，接種后的植物在溫室中保濕培養(yǎng)，10-12天后調(diào)查發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病程度。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，隨著稀釋濃度的降低，發(fā)病程度明顯降低，且經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，效果穩(wěn)定。