本發(fā)明涉及一種別嘌醇衍生物式（Ⅰ）及其在制備抗腫瘤藥物中的用途，尤其涉及一種別嘌醇衍生物式（Ⅰ）在肝癌、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、白血病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：癌癥為生命科學(xué)領(lǐng)域重大議題，惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的生存質(zhì)量成為人類健康的第一殺手。多年來人類一直在不斷的進(jìn)行抗腫瘤藥物的研究，尋找新型高效、低毒的抗腫瘤藥物一直是國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥研發(fā)的熱點(diǎn)。世界各國(guó)對(duì)抗腫瘤藥物的篩選都非常重視，投入了大量的人力、物力、財(cái)力，每年都有大量的化合物（化學(xué)合成、天然產(chǎn)物和微生物發(fā)酵產(chǎn)物）經(jīng)過抗腫瘤藥物篩選。小分子化合物在腫瘤研發(fā)中具有重要地位。每年都有大量的小分子化合物實(shí)體被設(shè)計(jì)出來并進(jìn)行不同適應(yīng)癥藥物的活性篩選，但是由于設(shè)計(jì)化合物的初始目的和設(shè)計(jì)者研究興趣的不同，很多化合物的開發(fā)并不全面，很多優(yōu)秀的藥理藥效功能不能得到開發(fā)，另一方面，由于新設(shè)計(jì)的化合物一般都以化合物專利的形式進(jìn)行保護(hù)，更加廣泛地用途開發(fā)對(duì)于非專利權(quán)人存在專利壁壘，商業(yè)價(jià)值低。申請(qǐng)?zhí)枮?00980139583.3，發(fā)明名稱為吡唑并[3，4]嘧啶-4-基衍生物及其治療糖尿病和肥胖癥的用途的專利中公開了本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)式還公開了化合物的結(jié)構(gòu)確證數(shù)據(jù)及其在糖尿病和肥胖癥方面的用途。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種別嘌醇衍生物式（Ⅰ）及其在制備抗腫瘤藥物中的用途，尤其涉及一種別嘌醇衍生物式（Ⅰ）在肝癌、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、白血病中的應(yīng)用。別嘌醇衍生物式（Ⅰ）（Ⅰ）表示的化合物、其鹽或其溶劑化合物。進(jìn)一步地，式（Ⅰ）在制備抗腫瘤藥物中的用途。進(jìn)一步地，所述腫瘤為惡性腫瘤，所述惡性腫瘤為實(shí)體瘤或非實(shí)體瘤。優(yōu)選地，所述實(shí)體瘤為肝癌、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌、卵巢癌、乳腺癌，所述非實(shí)體瘤為白血病。進(jìn)一步地，式（Ⅰ）在制備腫瘤并發(fā)血小板減少藥物中的用途。進(jìn)一步地，式（Ⅰ）在制備治療Bel-7402細(xì)胞引起的脾臟腫大藥物中的用途。進(jìn)一步地，式（Ⅰ）與卡培他濱聯(lián)合應(yīng)用。本發(fā)明沒有對(duì)別嘌醇衍生物式（Ⅰ）或包含別嘌醇衍生物式（Ⅰ）的組合物的施用方式進(jìn)行特別限制，代表性的施用方式包括（但并不限于）：口服、腸胃外（靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下）、和局部給藥。用于口服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑。在這些固體劑型中，別嘌醇衍生物式（Ⅰ）與至少一種常規(guī)惰性賦形劑（或載體）混合，如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，或與下述成分混合：（a）填料或增容劑，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；（b）粘合劑，例如羥甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠；（c）保濕劑，例如甘油；（d）崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些復(fù)合硅酸鹽、碳酸鈉；（e）緩溶劑，例如石蠟；（f）吸收加速劑，例如季胺化合物；（g）潤(rùn)濕劑，例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；（h）吸附劑，例如高嶺土；（i）潤(rùn)滑劑，例如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉。膠囊劑、片劑和丸劑中，劑型也可包含緩沖劑。其中，胃腸道給藥制劑是目前最為常見的用藥形式，且實(shí)驗(yàn)操作方便，因此，本發(fā)明具體實(shí)施方式中采用灌胃給藥進(jìn)行別嘌醇衍生物式（Ⅰ）的藥效試驗(yàn)，但這并不表示，別嘌醇衍生物式（Ⅰ）抗腫瘤的用藥形式僅限于胃腸道給藥，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)別嘌醇衍生物式（Ⅰ）的物理化學(xué)性質(zhì)，結(jié)合現(xiàn)代制劑技術(shù)和病患的實(shí)際需要，將其制備成注射劑、頭皮吸收制劑、植入制劑等多種制劑，從而擴(kuò)大其給藥途徑，并提高藥物靶向性或有效避免不必要的毒副作用。用于口服給藥的液體劑型包括藥學(xué)上可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿或酊劑。除了活性化合物外，液體劑型可包含本領(lǐng)域中常規(guī)采用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑，增溶劑和乳化劑，例知乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特別是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油或這些物質(zhì)的混合物等。除了這些惰性稀釋劑外，組合物也可包含助劑，如潤(rùn)濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑和香料。除了活性化合物外，懸浮液可包含懸浮劑，例如乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、甲醇鋁和瓊脂或這些物質(zhì)的混合物等。用于腸胃外注射的組合物可包含生理上可接受的無菌含水或無水溶液、分散液、懸浮液或乳液，和用于重新溶解成無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末。適宜的含水和非水載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、多元醇及其適宜的混合物。用于局部給藥的本發(fā)明化合物的劑型包括軟膏劑、散劑、貼劑、噴射劑和吸入劑?；钚猿煞衷跓o菌條件下與生理上可接受的載體及任何防腐劑、緩沖劑，或必要時(shí)可能需要的推進(jìn)劑一起混合。本發(fā)明化合物可以單獨(dú)給藥，或者與其他藥學(xué)上可接受的其他藥物聯(lián)合給藥。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其他多種形式的修改、替換或變更。具體實(shí)施方式本發(fā)明具體實(shí)施方式中所使用別嘌醇衍生物式（Ⅰ）結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果與中國(guó)專利（申請(qǐng)?zhí)枮?00980139583.3）公開一致。HPLC測(cè)定純度在95％以上。實(shí)施例1：MTT（噻唑藍(lán)）法測(cè)定別嘌醇衍生物式（Ⅰ）對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制作用。一、細(xì)胞株人肺癌細(xì)胞A549，人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，人肝癌細(xì)胞Bel-7402，人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞U251，人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460，人胃腺癌細(xì)胞BGC-823，人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901，人卵巢腺癌細(xì)胞SK-OV-3，人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，人慢性髓系白血病細(xì)胞K562。二、主要溶液配制：1.PBS緩沖液：NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO41.44g、KH2PO40.24g，調(diào)ph7.4，定容1L。2.胰蛋白酶溶液：0.25%的胰蛋白酶+0.02%EDTA，用PBS緩沖液配制，0.22μm濾膜過濾除菌，4℃?zhèn)溆谩?.RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液：（1）10.4g/包RPMI1640培養(yǎng)粉溶至三蒸水中，磁力攪拌20min；（2）加2gNaHCO3，繼續(xù)攪拌10min；（3）加青霉素溶液（2×105U/mL）0.5mL，鏈霉素溶液（2×105U/mL）0.5mL；（4）加100ml滅活胎牛血清；（5）加1mol/LHCl，調(diào)PH至7.2，定容1L；（6）過濾除菌。4.受試藥物梯度溶液：（1）別嘌醇衍生物式（Ⅰ）梯度溶液：別嘌醇衍生物式（Ⅰ）用少量DMSO溶解后（最終DMSO含量在0.1%以內(nèi)），用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液配置成100μg/ml，對(duì)半稀釋配置成8個(gè)濃度梯度，即：128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml，用前配制。（2）順鉑梯度溶液：順鉑注射液用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液配置成100μg/ml，對(duì)半稀釋配置成8個(gè)濃度梯度，即128，64，32，16，8，4，2，1μg/ml，用前配制。三、實(shí)驗(yàn)分組：待測(cè)藥物組（參見實(shí)驗(yàn)步驟部分）陽性對(duì)照藥物組（與藥物試驗(yàn)組相比，加入濃度梯度的待測(cè)藥物改為加入濃度梯度的順鉑）對(duì)照組（與藥物試驗(yàn)組相比，加入濃度梯度的待測(cè)藥物改為加入不含藥物的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液）空白組（與對(duì)照組相比，不加細(xì)胞）四、實(shí)驗(yàn)步驟：1.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化，RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞懸液濃度為6×104個(gè)/mL。在96孔培養(yǎng)板中每孔加細(xì)胞懸液100μL，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，細(xì)胞貼壁。2.移走RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，加入濃度梯度的待測(cè)藥物的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液100μL，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行孔。將加藥后的96孔板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。3.96孔板離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2~3遍后，再加入含0.5%MTT的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液100μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。4.移走上清，每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使formazan結(jié)晶充分溶解。5.在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的光密度（OD值）。6.平行孔OD值以mean±SD表示，計(jì)算抑制率公式：[(OD對(duì)照組-OD空白組)-(OD藥物實(shí)驗(yàn)組-OD空白組)]/(OD對(duì)照組-OD空白組)*100%。7.采用GraphPadPrism5數(shù)據(jù)處理軟件，通過繪制量效曲線計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果別嘌醇衍生物式（Ⅰ）對(duì)10種人腫瘤細(xì)胞株均有很好的體外抑制作用，IC50（見表1）均在11μg/ml之內(nèi)。與陽性藥順鉑相比較，對(duì)A549、U251、SGC-7901、SK-OV-3、MCF-7、K562抑制尤為敏感，對(duì)SMMC-7721、Bel-7402、NCI-H460和BGC-823抑制效果弱于順鉑。MTT法同樣測(cè)定別嘌醇衍生物式（Ⅰ）吡啶替換為苯環(huán)的化合物對(duì)A549、K562、U251、Bel-7402、NCI-H460的抑制作用，結(jié)果顯示敏感性遠(yuǎn)低于別嘌醇衍生物式（Ⅰ）。表1式（Ⅰ）和順鉑對(duì)10種人腫瘤細(xì)胞IC50值實(shí)施例2：Bel-7402肝癌移植瘤小鼠模型研究一、建立人肝癌裸鼠異體移植癌模型SPF級(jí)Balb/c裸鼠，雄性，4周齡，取經(jīng)人Bel-7402肝癌細(xì)胞裸鼠移植成瘤，再經(jīng)裸鼠傳代2代以上的瘤塊，剪成約2*2*2mm，采用套管針接種于裸鼠腋部皮下，建立人肝癌裸鼠異體移植癌模型。二、給藥方案用游標(biāo)卡尺測(cè)量每個(gè)動(dòng)物瘤的長(zhǎng)和寬，按公式：V=1/2*ab2計(jì)算瘤體積，待瘤體積長(zhǎng)至約100mm3開始給藥，所有動(dòng)物按瘤體積隨機(jī)分為模型組、陽性藥卡培他濱組（400mg/kg）、式（Ⅰ）高（100mg/kg）、中（50mg/kg）、低（25mg/kg）劑量組，聯(lián)合用藥組（卡培他濱100mg/kg和式（Ⅰ）25mg/kg），每組8只，各組灌胃給藥，劑量均為l0ml/kg，1次/d，連續(xù)給藥14d。三、檢測(cè)指標(biāo)及數(shù)據(jù)分析1.一般指標(biāo)觀察給藥后動(dòng)物行為、反應(yīng)、飲食及死亡情況，稱量動(dòng)物體重。所有組別在給藥前1天（d0）和第16天取血前（d16）稱量體重。2.外周血細(xì)胞檢測(cè)第16天摘眼球取血，取0.2ml于0.5mlEP管（先加20μLEDTA-2K）中，上下顛倒混勾，血球儀計(jì)算外周血細(xì)胞情況，包括白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血小板（PLT）數(shù)目。3.臟器系數(shù)摘眼球取血后取肝臟、腎臟、脾臟稱重，按以下公式計(jì)算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)(%)=臟器重量/體重*100%。體重指第16天取血前體重。4.瘤重及抑瘤率摘眼球取血后，剝?nèi)×鰤K，分析天平稱瘤重，按以下公式計(jì)算抑瘤率。抑瘤率%=（模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/模型組平均瘤重*100%。5.數(shù)據(jù)分析采用GraphPadPrism5數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。四、檢測(cè)結(jié)果1.一般指標(biāo)所有組別給藥后小鼠未出現(xiàn)死亡，小鼠行為、反應(yīng)、飲食方面亦未發(fā)現(xiàn)明顯異常。各組別與模型組比較體重均未出現(xiàn)顯著性差異（P>0.05）。不同組別Bel-7402肝癌移植瘤小鼠體重情況見表2。表2不同組別Bel-7402肝癌移植瘤小鼠體重情況（n=8）注：*與模型組比較P<0.05**與模型組比較P<0.012.外周血細(xì)胞檢測(cè)與模型組比較，其他各組別WBC和RBC計(jì)數(shù)無顯著性差異，式（Ⅰ）高、中劑量組和聯(lián)合用藥組PLT計(jì)數(shù)顯著高于模型組。說明式（Ⅰ）高中低劑量組和聯(lián)合用藥組不影響WBC和RBC，式（Ⅰ）高、中劑量組和聯(lián)合用藥組能夠引起PLT數(shù)量的升高。由于模型組PLT數(shù)量顯著低于正常值，所以PLT數(shù)量的升高為有益效果。Bel-7402肝癌移植瘤小鼠外周血情況見表3。表3不同組別Bel-7402肝癌移植瘤小鼠外周血情況（n=8）注：*與模型組比較P<0.05**與模型組比較P<0.01***與模型組比較P<0.0013.臟器系數(shù)與模型組比較，其他各組別肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)無顯著性差異，式（Ⅰ）高劑量組和聯(lián)合用藥組脾臟系數(shù)顯著低于模型組。說明式（Ⅰ）高、中、低劑量組和聯(lián)合用藥組不影響肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)，式（Ⅰ）高劑量組和聯(lián)合用藥組能夠引起脾臟系數(shù)降低。不同組別Bel-7402肝癌移植瘤小鼠臟器系數(shù)見表4。表4不同組別Bel-7402肝癌移植瘤小鼠臟器系數(shù)（n=8）組別肝臟系數(shù)腎臟系數(shù)脾臟系數(shù)模型組5.92±0.721.61±0.210.77±0.10卡培他濱組6.03±0.281.53±0.170.72±0.21式（Ⅰ）高劑量組5.94±0.351.64±0.20.47±0.08**式（Ⅰ）中劑量組5.96±0.681.66±0.140.60±0.08式（Ⅰ）低劑量組5.86±0.621.64±0.150.73±0.19聯(lián)合用藥組6.35±0.631.57±0.190.51±0.07*注：*與模型組比較P<0.05**與模型組比較P<0.014.瘤重及抑瘤率與模型組比較，除式（Ⅰ）低劑量組外，其他各組別瘤重均顯著性降低，說明抑瘤效果顯著。式（Ⅰ）高劑量組抑瘤率高于卡培他濱組，聯(lián)合用藥組抑瘤率與卡培他濱組相當(dāng)。不同組別Bel-7402肝癌移植瘤小鼠瘤重及抑瘤率見表5。表5不同組別Bel-7402肝癌移植瘤小鼠瘤重及抑瘤率（n=8）組別瘤重（g）抑瘤率（%）模型組1.25±0.21—卡培他濱組0.70±0.22***44.0式（Ⅰ）高劑量組0.57±0.24***54.4式（Ⅰ）中劑量組0.87±0.29*30.4式（Ⅰ）低劑量組0.92±0.2026.4聯(lián)合用藥組0.67±0.17***46.4注：*與模型組比較P<0.05**與模型組比較P<0.01***與模型組比較P<0.001據(jù)研究表明，裸鼠移植腫瘤模型與臨床治療的藥物治療效果有明顯的相關(guān)性，可以較好的預(yù)報(bào)藥物的臨床療效。由此可以推知，式（Ⅰ）可以作為抗腫瘤藥物應(yīng)用。聯(lián)合用藥組采用低劑量的式（Ⅰ）和卡培他濱聯(lián)合應(yīng)用抑瘤率高于卡培他濱組和式（Ⅰ）低劑量組說明式（Ⅰ）聯(lián)合卡培他濱作為抗腫瘤藥物應(yīng)用具有更優(yōu)的療效、或者等同療效下可以降低卡培他濱用量。此外，式（Ⅰ）高、中劑量組明顯升高血小板數(shù)量說明可應(yīng)用于制備腫瘤并發(fā)血小板減少藥物中。當(dāng)前第1頁1 2 3