本發(fā)明屬化學(xué)與生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有熒光性能的蛋白質(zhì)染色劑，以及該蛋白質(zhì)染色劑的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

有機(jī)小分子熒光探針廣泛的應(yīng)用于環(huán)境科學(xué)、生命科學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域，并日益成為現(xiàn)代生命科學(xué)及疾病診斷等領(lǐng)域不可缺少的研究手段，因此，開發(fā)具有實用價值的功能性熒光染料分子倍受關(guān)注。以有機(jī)熒光團(tuán)為基礎(chǔ)的分子熒光探針具有靈敏度高、操作簡便、重現(xiàn)性好、膜透性好、原位檢測等眾多優(yōu)點(diǎn)。而且，熒光染料常用作熒光探針，在標(biāo)記生物分子或微粒的生物工程與醫(yī)療檢測領(lǐng)域具有重要應(yīng)用。目前，許多的應(yīng)用是利用熒光染料作為檢測工具，其需要熒光染料與蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸及其他的生物分子共價結(jié)合形成染料標(biāo)記的配體。

十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)是Shapiro于1967年建立的，經(jīng)過不斷的改進(jìn)、完善，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析。由于SDS覆蓋蛋白質(zhì)分子，使蛋白質(zhì)能夠根據(jù)分子大小帶有相應(yīng)的負(fù)電荷，使得蛋白質(zhì)的電泳遷移率不受其原有電荷影響，而只與相對分子質(zhì)量有關(guān)。因此通過SDS-PAGE可分離蛋白并測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量和蛋白質(zhì)純度。在采用SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)特性時，考馬斯亮藍(lán)、銀染等是應(yīng)用最為廣泛的蛋白染色劑，但是它們都需要進(jìn)行單獨(dú)的染色和脫色過程，步驟繁瑣，操作要求高，且銀染稍有不慎會造成很深的背景，影響結(jié)果的清晰度，最嚴(yán)重的是，有的銀染膠脫色困難；考馬斯亮藍(lán)染色雖然染色背景低，但靈敏度低且消耗時間長。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種穩(wěn)定性好、固色性強(qiáng)的熒光蛋白質(zhì)染色劑，并為該染色劑提供一種制備方法和應(yīng)用。

解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是該熒光蛋白質(zhì)染色劑的結(jié)構(gòu)式如下：

上述熒光蛋白染色劑的制備方法如下：

1、在0℃、攪拌條件下，將干燥的環(huán)己酮和濃硫酸混合，然后加入4-二乙氨基酮酸，待4-二乙氨基酮酸完全溶解后，升溫至85～95℃，恒溫反應(yīng)1.5～2小時，冷卻至常溫，將反應(yīng)液倒入冰中，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70％的高氯酸水溶液，過濾并用冰水洗滌，所得固體真空干燥。

2、在0℃、攪拌條件下，將POCl₃和N,N-二甲基甲酰胺按體積比為1:2.5～3.5混合；將步驟1真空干燥后的固體完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺后，滴加到N,N-二甲基甲酰胺和POCl₃的混合液中，滴加完后升溫至85～95℃，恒溫反應(yīng)3～4小時，冷卻至常溫，將反應(yīng)液倒入蒸餾水中，分離純化產(chǎn)物，得到熒光蛋白染色劑。

上述步驟1中，優(yōu)選4-二乙氨基酮酸與環(huán)己酮的摩爾比為1:1.5～2.5，干燥的環(huán)己酮和濃硫酸的體積比為1:10～15。

上述步驟2中，優(yōu)選步驟1真空干燥后的固體與POCl₃的摩爾比為1:1～1.5。

上述熒光蛋白染色劑在蛋白質(zhì)染色中的用途，染色方法為常規(guī)蛋白質(zhì)染色方法。

本發(fā)明的有益效果如下：

1、本發(fā)明染色劑的水溶液具有強(qiáng)烈的熒光，且該染色劑含有醛基(—CHO)，能與蛋白質(zhì)上的氨基(—NH₂)反應(yīng)，形成共價鍵，利于在染色時與客體產(chǎn)生相互作用，染色牢固，不易脫色，提高了染色與熒光檢測效果，提高了靈敏度，有利于熒光或裸眼識別與檢測。同時，本發(fā)明染色劑具有色澤鮮艷、色譜齊全、優(yōu)異耐洗牢度、價格相對便宜、應(yīng)用工藝簡便的特點(diǎn)。

2、本發(fā)明染色劑可以在蛋白質(zhì)的預(yù)處理過程中與蛋白質(zhì)結(jié)合進(jìn)行染色，然后進(jìn)行SDS-PAGE分離，分離后即可直接進(jìn)行蛋白質(zhì)的分析與檢測，與傳統(tǒng)的考馬斯亮藍(lán)及銀染方法相比較，SDS-PAGE分離后不需要進(jìn)行單獨(dú)的染色和脫色過程，具有使用方便、操作步驟少、節(jié)約時間、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明熒光蛋白質(zhì)染色劑的熒光光譜圖。

圖2是牛血清白蛋白的染色圖。

圖3是溶菌酶的染色圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于這些實施例。

實施例1

1、將35mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98％的濃硫酸加入到干燥的圓底燒瓶中，再向圓底燒瓶中逐滴加入3.3mL(31.85mmol)干燥的環(huán)己酮，并將其冷卻到0℃，然后在劇烈攪拌的情況下，向圓底燒瓶中分批加入總質(zhì)量為5.0136g(16mmol)的4-二乙氨基酮酸，待4-二乙氨基酮酸完全溶解后，在90℃水浴鍋中加熱反應(yīng)1.5小時，反應(yīng)完后反應(yīng)液顏色呈黑紅色，將反應(yīng)液冷卻至常溫后傾入到150g冰中，再加入3.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70％的高氯酸水溶液，過濾并且用100mL冰水洗滌，所得固體在真空烘箱中45℃烘干。所得干燥產(chǎn)物的MS(ESI+)m/z:實測值376.1909[M+H]⁺，理論值[C₂₄H₂₆NO₃]⁺:376.1907。

2、將1.5mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)加入到圓底燒瓶中，在冰水浴中冷卻到0℃，在劇烈攪拌的情況下，將0.56mL(6mmol)POCl₃逐滴緩慢加到圓底燒瓶中；將1.875g(5mmol)步驟1真空干燥后的固體用10mL DMF完全溶解后，緩慢加入到DMF和POCl₃的混合液中，在90℃水浴鍋中加熱反應(yīng)3小時，此時反應(yīng)液顏色為紅棕色；將反應(yīng)液冷卻至常溫后傾入到水中，用二氯甲烷萃取并旋蒸后，在真空烘箱中45℃烘干，用石油醚與乙酸乙酯、甲醇的體積比為9:3:0.4的混合液為展開劑進(jìn)行柱色譜分離提純，得到熒光蛋白染色劑0.8859g，其產(chǎn)率為47.3％。

所得產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)為：MS(ESI+)m/z:實測值404.1858[M+H]⁺,理論值[C₂₅H₂₅NO₄]⁺404.1856；¹H NMR(400MHz,CDCl₃,d/ppm)δ:10.50-10.17(m,1H),7.73-7.32(m,2H),7.30-7.12(m,1H),6.56(d,J＝9.3Hz,1H),6.35(d,J＝3.0Hz,1H),6.26(dd,J＝9.2,2.8Hz,1H),3.81-3.12(m,4H),2.61-1.36(m,5H),1.26(dd,J＝20.4,12.8Hz,3H),1.16(t,J＝7.4Hz,3H)。

將所得染色劑完全溶解于蒸餾水中，采用RF-5301型熒光分光光度計進(jìn)行表征，結(jié)果見圖1。由圖可見，此染色劑的激發(fā)波長為476nm，發(fā)射波長為564nm。

實施例2

實施例1制備的熒光蛋白質(zhì)染色劑在牛血清白蛋白染色中的用途，具體方法如下：

樣品的預(yù)處理：將熒光蛋白質(zhì)染色劑完全溶解無水乙醇中，再加入蒸餾水，配制成1mg/mL的熒光蛋白質(zhì)染色劑溶液；將50μL 1mg/mL的熒光蛋白質(zhì)染色劑溶液和20μL 1mg/mL牛血清白蛋白水溶液加入25μL pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中，并加入10μL甘油，充分混合后，在57℃下加熱1小時，在3000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10min。

電泳分離：取15μL離心后的上清液加入聚丙烯酰胺凝膠(分離膠7.5％，濃縮膠4％)的泳道中，下槽中加入1000mL電泳緩沖液(3.0g Tris、14.4g甘氨酸、剩余為蒸餾水)，在濃縮膠部分施加100V的恒壓，當(dāng)鮮紅色的條帶跑至分離膠部分時，電壓升至150V，直到條帶跑至凝膠下邊緣1cm處時，停止電泳，在凝膠成像儀上拍照，結(jié)果見圖2。由圖可見，本發(fā)明熒光蛋白質(zhì)染色劑能夠?qū)εＱ灏椎鞍走M(jìn)行染色。

實施例3

實施例1制備的熒光蛋白質(zhì)染色劑在溶菌酶染色中的用途，具體方法如下：

樣品的預(yù)處理：將熒光蛋白質(zhì)染色劑完全溶解無水乙醇中，再加入蒸餾水，配制成1mg/mL的熒光蛋白質(zhì)染色劑溶液；將50μL 1mg/mL的熒光蛋白質(zhì)染色劑溶液和20μL 1mg/mL溶菌酶水溶液加入25μL pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中，并加入10μL甘油，充分混合后，在57℃下加熱1小時，使溶菌酶充分變性，在3000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10min。

電泳分離：取15μL離心后的上清液加入聚丙烯酰胺凝膠(分離膠16.5％，夾層膠10％，濃縮膠4％)的泳道中，下槽中加入1000mL電泳緩沖液(3.0g Tris、14.4g甘氨酸、剩余為蒸餾水)，在溫度為4℃、電流為25mA的條件下進(jìn)行電泳，直到條帶跑至凝膠下邊緣1cm處時，停止電泳，在凝膠成像儀上拍照，結(jié)果見圖3。由圖可見，本發(fā)明熒光蛋白質(zhì)染色劑能夠?qū)θ芫高M(jìn)行染色。