本發(fā)明涉及一種用于人類脂肪干細(xì)胞體外長期培養(yǎng)的聚合物涂層的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)由于其多能性以及免疫調(diào)節(jié)的能力在再生醫(yī)學(xué)中越來越受到重視，但它們?cè)隗w外長期培養(yǎng)擴(kuò)增并保持其性能以用于臨床治療仍是一個(gè)挑戰(zhàn)，因此建立確定的安全培養(yǎng)系統(tǒng)來擴(kuò)增細(xì)胞以用于臨床治療至關(guān)重要。盡管標(biāo)準(zhǔn)的TCP培養(yǎng)板足以支持MSCs從最初的異質(zhì)組織分離物中分離和附著，但它不能夠確保這些干細(xì)胞在體外長期培養(yǎng)生長后的多能特性。事實(shí)上，已經(jīng)有研究表明MSCs在TCP上長期培養(yǎng)可能會(huì)降低其向成骨和成脂細(xì)胞分化的能力。另外，使用動(dòng)物衍生基質(zhì)如明膠、膠原蛋白或纖連蛋白作為培養(yǎng)基質(zhì)也有不足，可能存在很多不確定因素，如存在批次差異，有引起病原體轉(zhuǎn)移感染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，為了保持MSCs完整的臨床應(yīng)用潛力，開發(fā)一種組成確定的合成基材對(duì)于MSCs的體外長期培養(yǎng)是迫切需要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：基于上述問題，本發(fā)明提供一種用于人類脂肪干細(xì)胞體外長期培養(yǎng)的聚合物涂層的制備方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的一個(gè)技術(shù)方案是：一種用于人類脂肪干細(xì)胞體外長期培養(yǎng)的聚合物涂層的制備方法，包括以下步驟：

a、蓋玻片的處理：

用等離子表面清洗機(jī)對(duì)蓋玻片正反兩面進(jìn)行處理，然后將處理后的蓋玻片浸泡于的改性溶液中，放置一段時(shí)間，取出，溶劑淋洗，自然風(fēng)干，備用；

b、聚合物涂層的制備：

將單體、交聯(lián)劑、紫外光引發(fā)劑和溶劑按比例混合均勻，用移液器吸取聚合物溶液滴加在PET膜上，再將步驟a得到的蓋玻片蓋在液滴上，輕輕擠壓排出空氣，紫外聚合，得到聚合物涂層；

步驟b中單體為：甲基丙烯酸羥乙酯A、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨溶液E、甲基丙烯酸環(huán)己酯L、甲基丙烯酸-2-(二乙氨基)乙酯K，聚合物涂層為：E1K1L1、E3K1L2、E3A1L2，數(shù)字為各單體之間的質(zhì)量比。

進(jìn)一步地，步驟a中等離子表面清洗機(jī)功率500w，時(shí)間120s；蓋玻片的規(guī)格為φ30mm；改性溶液包括乙腈、三乙胺和3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，乙腈、三乙胺和3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的體積比為60～61：0.4～0.42：0.85～0.87。

進(jìn)一步地，步驟a中處理后的蓋玻片浸泡于的改性溶液中，在恒溫振蕩器震蕩24h后，取出蓋玻片，用丙酮清洗2～3次，自然風(fēng)干，保存在-25℃冰箱中待用。

進(jìn)一步地，步驟b中交聯(lián)劑為N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺，紫外光引發(fā)劑為1-羥環(huán)己基苯酮，溶劑為1-甲基-2-吡咯烷酮，單體固含量為50％，交聯(lián)劑和紫外光引發(fā)劑分別占單體總質(zhì)量的10％和5％，步驟b中聚合物溶液為10μL。

進(jìn)一步地，步驟b中聚合物涂層具體制備方法為：用365nm紫外光照射30min后，將PET薄膜剝離，得到復(fù)合有聚合物涂層的載玻片，將載玻片放置在40℃烘箱中12h，用丙酮和乙醇各沖洗兩次，自然風(fēng)干。

用于人類脂肪干細(xì)胞體外長期培養(yǎng)的聚合物涂層的應(yīng)用，包括：

c、人類脂肪干細(xì)胞在聚合物涂層上的長期培養(yǎng)：

收集人類脂肪干細(xì)胞消化并計(jì)數(shù)，接種到聚合物涂層表面進(jìn)行長期體外培養(yǎng)；

d、誘導(dǎo)人類脂肪干細(xì)胞向成脂、成骨、成軟骨細(xì)胞的分化：

待c中的人類脂肪干細(xì)胞生長至80％融合時(shí)，分別更換成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，以加入L-DMEM培養(yǎng)基組作為陰性對(duì)照組于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

e、對(duì)誘導(dǎo)后的三種成體細(xì)胞分別進(jìn)行染色定性：

成脂、成骨、成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)一段時(shí)間后分別進(jìn)行油紅O染色、茜素紅染色、阿利新藍(lán)染色，然后進(jìn)行拍照觀察。

進(jìn)一步地，c中聚合物涂層表面進(jìn)行長期體外培養(yǎng)的具體操作為：收集第2代人類脂肪干細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10⁵/mL，接種于載玻片的聚合物涂層上，載玻片置于6孔板中，每孔加2.5mL細(xì)胞懸液，用一個(gè)沒有聚合物涂層的TC板作為對(duì)照組；每3天換一次培養(yǎng)液，待對(duì)照組的細(xì)胞長到90％融合時(shí)，將所有實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的細(xì)胞分別脫壁計(jì)數(shù)，仍按1×10⁵/mL的濃度分別接種于對(duì)應(yīng)的聚合物涂層表面進(jìn)行傳代長期培養(yǎng)。

進(jìn)一步地，d中三種誘導(dǎo)培養(yǎng)液為：成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液：含10％FBS的H-DMEM、0.5mmol/L的3-異丁基甲基黃嘌呤、10μmol/L胰島素、1μmol/L地塞米松和200μmol/L吲哚美辛；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液：含10％FBS的H-DMEM、10mmol/L的β-甘油磷酸鈉、10^-7mol/L地塞米松、50μmol/L抗壞血酸；成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液：含10％FBS的H-DMEM、10^-7mol/L地塞米松、37.5μg/mL抗壞血酸、40μg/mL脯氨酸、100μg/mL丙酮酸鈉、50mg/mL ITS、100ng/mL TGF-β3。

進(jìn)一步地，d中人類脂肪干細(xì)胞于37℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3d換液1次。

進(jìn)一步地，e中三種誘導(dǎo)后的成體細(xì)胞染色具體操作為：成脂誘導(dǎo)3周后進(jìn)行油紅O染色：細(xì)胞進(jìn)行染色之前，先用10％的甲醛溶液固定30min后用PBS沖洗兩次，用0.1μg/mL DAPI染色20min后用PBS沖洗兩次，再用60％的異丙醇溶液浸洗5min，然后再加入油紅O染色液室溫染色30min，最后用60％異丙醇水溶液清洗2-3次后用顯微鏡進(jìn)行拍照觀察；成骨誘導(dǎo)4周后進(jìn)行茜素紅染色：吸棄培養(yǎng)液，先用PBS清洗一次，再10％的甲醛溶液固定30min，后用PBS沖洗兩次，然后用2％的茜素紅水溶液染色20min，最后用PBS緩沖液清洗2-3次后進(jìn)行拍照觀察；成軟骨誘導(dǎo)4周后進(jìn)行阿利新藍(lán)染色：細(xì)胞進(jìn)行染色之前，先用10％的甲醛溶液固定30min，再用PBS沖洗兩次，加Alcian酸化液浸泡3min，然后加Alcian染色液染色15-30min，最后用去離子水沖洗2-3次后進(jìn)行拍照觀察。

本發(fā)明的有益效果是：基于丙烯酸酯類/丙烯酰胺類的聚合物涂層具有良好的光學(xué)透明度以及生物相容性，有利于細(xì)胞培養(yǎng)與觀察，聚合物涂層不僅可以促進(jìn)人類脂肪干細(xì)胞的生長保持其增殖能力，而且還能保持其干細(xì)胞特性，這些新的聚合物為人類脂肪干細(xì)胞用于研究、工業(yè)化擴(kuò)增和臨床應(yīng)用的長期培養(yǎng)提供了一種高效、安全的、化學(xué)組成可控的合成基材。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。

圖1為實(shí)施例2的聚合物涂層E3K1L2的紅外譜圖；

圖2為3個(gè)實(shí)施例的聚合物涂層的熱失重曲線；

圖3為3個(gè)實(shí)施例的聚合物涂層培養(yǎng)的人類脂肪干細(xì)胞分化成成脂細(xì)胞的分化率對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)在結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以下實(shí)施例旨在說明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步限定。

實(shí)施例1

稱取0.1g甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨溶液(E)、0.1g甲基丙烯酸-2-(二乙氨基)乙酯(K)、0.1g甲基丙烯酸環(huán)己酯(L)加入0.3g 1-甲基-2-吡咯烷酮中，添加0.015g1-羥環(huán)己基苯酮和0.03g N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺配成聚合物溶液，用移液器吸取聚合物溶液滴加在PET膜上，再將蓋玻片蓋在液滴上，輕輕擠壓排出空氣。用365nm紫外光照射30min后，剝離PET薄膜，將載玻片放置在40℃烘箱中12h，最后用丙酮和乙醇各沖洗兩次，自然風(fēng)干，得到聚合物涂層E1K1L1。

將人類脂肪干細(xì)胞按密度為1×10⁵/mL接種于聚合物涂層上進(jìn)行長期培養(yǎng)。收集第2代人類脂肪干細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10⁵/mL，接種于聚合物涂層上，聚合物涂層置于6孔板中(0.5％的瓊脂糖溶液處理過)，每孔加2.5mL細(xì)胞懸液，用一個(gè)沒有聚合物涂層的TC板作為對(duì)照組。每3天換一次培養(yǎng)液，待對(duì)照組的細(xì)胞長到90％融合時(shí)，將所有實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的細(xì)胞分別脫壁計(jì)數(shù)，仍按1×10⁵/mL的濃度分別接種于對(duì)應(yīng)的聚合物涂層表面進(jìn)行傳代長期培養(yǎng)。

待細(xì)胞生長至80％融合時(shí)，分別更換成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，并分別用油紅O、茜素紅、阿利新藍(lán)染色定性。

三種誘導(dǎo)培養(yǎng)液為：成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液：含10％FBS的H-DMEM、0.5mmol/L的3-異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)、10μmol/L胰島素、1μmol/L地塞米松和200μmol/L吲哚美辛。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液：含10％FBS的H-DMEM、10mmol/L的β-甘油磷酸鈉、10^-7mol/L地塞米松、50μmol/L抗壞血酸。成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液：含10％FBS的H-DMEM、10^-7mol/L地塞米松、37.5μg/mL抗壞血酸、40μg/mL脯氨酸、100μg/mL丙酮酸鈉、50mg/mL ITS、100ng/mL TGF-β3。

成脂誘導(dǎo)3周后進(jìn)行油紅O染色：細(xì)胞進(jìn)行染色之前，先用10％的甲醛溶液固定30min后用PBS沖洗兩次，用DAPI(0.1μg/mL)染色20min后用PBS沖洗兩次，再用60％的異丙醇溶液浸洗5min，然后再加入油紅O染色液(0.5％油紅O異丙醇溶液/水＝3/2)室溫染色30min，最后用60％異丙醇水溶液清洗2-3次后用顯微鏡進(jìn)行拍照觀察。成骨誘導(dǎo)4周后進(jìn)行茜素紅染色：吸棄培養(yǎng)液，先用PBS清洗一次，再10％的甲醛溶液固定30min，后用PBS沖洗兩次，然后用2％的茜素紅水溶液(PH4.2)染色20min，最后用PBS緩沖液清洗2-3次后進(jìn)行拍照觀察。成軟骨誘導(dǎo)4周后進(jìn)行阿利新藍(lán)染色：細(xì)胞進(jìn)行染色之前，先用10％的甲醛溶液固定30min，再用PBS沖洗兩次，加Alcian酸化液浸泡3min，然后加Alcian染色液染色15-30min，最后用去離子水沖洗2-3次后進(jìn)行拍照觀察。

實(shí)施例2

稱取0.15g甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨溶液(E)、0.05g甲基丙烯酸-2-(二乙氨基)乙酯(K)、0.1g甲基丙烯酸環(huán)己酯(L)加入0.3g 1-甲基-2-吡咯烷酮中，添加0.015g1-羥環(huán)己基苯酮和0.03g N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺配成聚合物溶液，用移液器吸取聚合物溶液滴加在PET膜上，再將蓋玻片蓋在液滴上，輕輕擠壓排出空氣。用365nm紫外光照射30min后，剝離PET薄膜，將載玻片放置在40℃烘箱中12h，最后用丙酮和乙醇各沖洗兩次，自然風(fēng)干，得到聚合物涂層E3K1L2。

按實(shí)施例1步驟培養(yǎng)人類脂肪干細(xì)胞并誘導(dǎo)、染色定性。

實(shí)施例3

稱取0.15g甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨溶液(E)、0.05g甲基丙烯酸羥乙酯(A)、0.1g甲基丙烯酸環(huán)己酯(L)加入0.3g 1-甲基-2-吡咯烷酮中，添加0.015g1-羥環(huán)己基苯酮和0.03g N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺配成聚合物溶液，用移液器吸取聚合物溶液滴加在PET膜上，再將蓋玻片蓋在液滴上，輕輕擠壓排出空氣。用365nm紫外光照射30min后，剝離PET薄膜，將載玻片放置在40℃烘箱中12h，最后用丙酮和乙醇各沖洗兩次，自然風(fēng)干，得到聚合物涂層E3A1L2。

按實(shí)施例1步驟培養(yǎng)人類脂肪干細(xì)胞并誘導(dǎo)、染色定性。

圖1為實(shí)施例2的聚合物圖層E3K1L2的紅外譜圖，光聚合反應(yīng)前混合單體C＝C雙鍵在1630cm^-1及650～730cm^-1處的強(qiáng)吸收峰沒有在聚合物紅外譜圖中出現(xiàn)，說明三種單體發(fā)生了共聚反應(yīng)。其他實(shí)施例的聚合物與此類似。

圖2為3種聚合物的熱失重曲線，從圖中可以看出，3種聚合物的熱失重過程相近，聚合物的初始熱分解溫度均在200℃左右，熱穩(wěn)定性比較好，作為生物材料可以用于高溫滅菌處理。

圖3為3種聚合物涂層培養(yǎng)的人類脂肪干細(xì)胞分化成成脂細(xì)胞的分化率。

實(shí)施例1～3中不同聚合物涂層培養(yǎng)的人類脂肪干細(xì)胞其誘導(dǎo)分化率有差異，由圖3可知，聚合物涂層配比E1K1L1、E3A1L2和E3K1L2培養(yǎng)的人類脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成脂細(xì)胞的分化率明顯高于對(duì)照組(TCP)，尤其是E3K1L2分化率為65％左右，高于在TCP表面培養(yǎng)的細(xì)胞的分化率55％。具有作為一種新型的醫(yī)用生物材料的應(yīng)用前景。

以上述依據(jù)本發(fā)明的理想實(shí)施例為啟示，通過上述的說明內(nèi)容，相關(guān)工作人員完全可以在不偏離本項(xiàng)發(fā)明技術(shù)思想的范圍內(nèi)，進(jìn)行多樣的變更以及修改。本項(xiàng)發(fā)明的技術(shù)性范圍并不局限于說明書上的內(nèi)容，必須要根據(jù)權(quán)利要求范圍來確定其技術(shù)性范圍。