技術領域：
本發(fā)明涉及微生物檢測
技術領域：
，具體說是涉及一種快速、可視化并且可實時定量檢測流感病毒的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增試劑盒及其應用。
背景技術：
：流感病毒可引起人、禽、豬、馬、蝙蝠等多種動物感染和發(fā)病，是人流感、禽流感、豬流感、馬流感等人與動物疫病的病原。流感病毒對外界抵抗力不強。動物流感病毒通常不感染人，人流感病毒通常不感染動物，但是豬比較例外，豬既可以感染人流感病毒，也可以感染禽流感病毒，但它們主要感染的還是豬流感病毒。少數(shù)動物流感病毒適應人后，可以引起人流感大流行。豬流感是一種急性、傳染性呼吸道疾病，其特征為疾病突發(fā)，高熱，精神沉郁，食欲廢絕，呼吸困難，陣發(fā)性咳嗽。禽流感病毒（AIV）屬甲型流感病毒，引起禽類的一種從呼吸系統(tǒng)到嚴重全身敗血癥等多種癥狀的傳染病。禽流感容易在鳥類間流行，過去在民間稱為“雞瘟”，國際獸疫局將其定為甲類傳染病。禽流感1994年、1997年、1999年和2003年分別在澳大利亞、意大利、中國香港、荷蘭等地暴發(fā)，2005年則主要在東南亞和歐洲暴發(fā)。近年來，隨著集約化養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，流感對養(yǎng)殖業(yè)構成了較大的威脅。此外，高致病性禽流感在人流感和禽流感之間發(fā)揮著關鍵性作用，具有重大的公共衛(wèi)生意義，自1918年首次報道以來，流感一直受到人們的廣泛關注。目前，流感病毒的檢測技術主要有常規(guī)方法和分子生物學方法。常規(guī)方法是病毒的分離鑒定，其結果準確可靠，但常規(guī)鑒定方法存在操作復雜，需要復雜的儀器設備，所需時間長的缺點，不利于流感的快速診斷。分子生物學的方法是通過逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）方法檢測流感病毒的特異性基因，雖然RT-PCR方法較常規(guī)方法快速準確，但需要昂貴的儀器設備，成本較高，在結果判定上需要進行瓊脂糖凝膠電泳，容易造成實驗室污染導致出現(xiàn)假陽性結果。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種為快速、準確并且實時檢測流感病毒的方法，提供一種快速、可視化并且可實時定量檢測流感病毒的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增試劑盒。為實現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的技術方案為：一種流感病毒逆轉錄環(huán)介導等溫擴增試劑盒，該試劑盒包括RT-LAMP引物、2×反應緩沖液、酶混合物EM、熒光目視檢測試劑、超純水和流感病毒RNA模板，所述的RT-LAMP引物包括外引物F3與B3、內引物FIP與BIP；其中引物的序列分別為：F3TCTGGAGGGGTGAAAATGGAB3GTGCAACTGATCCCCTCAGFIPGCCCTCTGGGCAGCTGTTTGCGAAGGACAAGGGTTGCTTABIPAAGTCGAAACCCAGGAAACGCTAATGAGTGCTGACCGTGC；所述的2×反應緩沖液包括Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。以上所述的流感病毒RNA模板是使用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取的流感病毒RNA。以上所述的熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素熒光試劑，熒光試劑在反應前加入。以上所述的2×反應緩沖液包括Tris-HCL35-50mM、KCL15-35mM、MgSO415-20mM、(NH4)2SO415-25mM、Tween200.4-0.8℅、Betaine1.5-3.0M和dNTPs2.5-4mM，其配制方法在pH為8.7條件下，將上述溶劑混合均勻獲得。一種流感病毒逆轉錄環(huán)介導等溫擴增試劑盒的應用，用于檢測流感病毒以及疑似流感病變組織是否感染流感病毒，具體檢測步驟包括：（1）RT-LAMP引物的設計與合成（2）流感病毒RNA模板的提?。?）RT-LAMP反應體系建立（4）RT-LAMP檢測方法。以上所述的RT-LAMP反應體系建立以25μl計，2×反應緩沖液12.5μLEM1μLFIP40pmolBIP40pmolF35pmolB35pmol流感病毒RNA5μL超純水補足25μL。以上所述的RT-LAMP檢測方法是采用特異性檢測、敏感性檢測和熒光可視化檢測的方法。以上所述的RT-LAMP檢測方法采用LoopampLA-320C實時濁度儀進行密閉全程監(jiān)控，反應溫度為63℃、反應在20-25分鐘間出現(xiàn)擴增。本發(fā)明的實質性特點和顯著的進步是：1）特異性強本發(fā)明的RT-LAMP檢測方法特異性檢測出流感病毒，而所檢測的陰性對照病毒、陰性對照支原體和水對照均無陽性結果出來，與RT-PCR檢測結果一致。且操作簡便、快速獲得檢測結果、無需昂貴復雜的儀器，普通RT-PCR法需先進行反轉錄（RT），然后再以RT產物為模板進行PCR反應，使用了兩個反應程序，而RT-LAMP方法可在一個反應管內同時完成兩個反應程序，一個小時即可完成擴增。2）靈敏度高提取的流感病毒RNA原始濃度為6.8ng/μL，普通RT-PCR檢測試劑盒的檢測限約為6.8×10-2ng/μL，而使用本發(fā)明檢測方法，檢測限約為6.8×10-3ng/μL，敏感性是普通RT-PCR方法的10倍。3）迅速獲得結果普通的RT-PCR整個過程在24小時左右才能得出結果，目前多數(shù)建立的RT-LAMP反應方法在反應結束后，須采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像來判定結果，從病毒基因組DNA/RNA提取到獲取試驗結果，需要5-6小時左右。本發(fā)明提供的RT-LAMP檢測方法反應在20分鐘左右出現(xiàn)擴增，60分鐘內即可完成擴增，且結果判讀方式簡便：依據反應管濁度值的變化情況即可判讀結果，擴增反應結束即可獲得試驗結果，不需要再進行瓊脂糖凝膠電泳紫外線顯像分析或者反應結束后加入熒光染料來判讀結果，從病毒基因組DNA/RNA提取到獲得最終結果可在2-3小時內完成。4）不造成污染目前RT-LAMP方法用于直接觀察的熒光染料為反應后加入，而本發(fā)明的熒光染料是在反應前加入的鈣黃綠素商用染料（非syber-green），檢測過程不需要開蓋，能有效避免氣溶膠污染實驗環(huán)境。此外，本發(fā)明的RT-LAMP檢測方法在結果判定上，直接通過濁度儀檢測反應管的濁度值來判定結果，可不進行熒光染料法檢測結果或者進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，不需要開蓋，能有效避免污染。5）可實時定量本發(fā)明利用Tubidimeterreal-timeLA-320C濁度儀來實時分析RT-LAMP反應過程，不同的標準樣品的濃度對應的濁度值的時間繪制成的標準曲線，代入標準曲線方程，即可求出各時間的流感病毒拷貝數(shù)，達到定量檢測產物的目的。附圖說明圖1是本發(fā)明RT-LAMP方法特異性檢測結果；其中試驗病毒有豬流感病毒（SIV）和禽流感病毒（AIV）；對照毒株有：豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、圓環(huán)病毒2型(PCV2)、巴氏桿菌(Pm)、副豬嗜血桿菌(HPS)、豬支原體（MH），滅菌超純水作為陰性對照（Negative）。結果顯示，只有流感病毒反應管出現(xiàn)濁度的上升曲線，6個對照反應管和陰性對照反應管均無擴增。圖2是使用本發(fā)明RT-LAMP方法進行的流感病毒敏感性檢測結果，圖3是普通RT-PCR檢測方法進行的流感病毒敏感性檢測結果；其中1：6.8ng/μL；2：6.8×10-1ng/μL；3：6.8×10-2ng/μL；4：6.8×10-3ng/μL；5：6.8×10-4ng/μL；6：6.8×10-5ng/μL；7：6.8×10-6ng/μL；8：6.8×10-7ng/μL。流感病毒原始RNA的起始濃度為6.8ng/μL，經10倍倍比連續(xù)稀釋后，進行RT-LAMP和RT-PCR擴增，結果顯示本發(fā)明的RT-LAMP法檢測限約為6.8×10-3ng/μL，而RT-PCR檢測限約為6.8×10-2ng/μL。圖4是加入熒光染料后肉眼觀察結果：左管為以流感病毒基因組RNA為模板的反應情況，為陽性結果，右管為陰性對照的反應情況，為陰性結果。圖5是本發(fā)明定量檢測流感病毒的標準曲線：利用不同的標準樣品的濃度對應的濁度值對時間繪制成的標準曲線，代入標準曲線方程，即可進行定量。具體實施方式1、材料的準備豬流感病毒（SIV）、禽流感病毒（AIV）由廣西大學動物科學技術學院饋贈，對照毒株包括豬瘟病毒、豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型，對照細菌包括巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌、豬支原體，為市售疫苗毒株，或為廣西獸醫(yī)研究所分離鑒定和保存。LAMP法RNA擴增試劑盒購自北京藍譜生物科技有限公司，貨號SLP246，病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司，貨號CW0548。2、RT-LAMP引物的設計與合成根據GenBank中的流感病毒編碼非結構蛋白NP1的基因序列，利用RT-LAMP法引物輔助設計軟件PrimerExplorerV4軟件設計一套RT-LAMP引物，其中F3、B3為外引物，F(xiàn)IP、BIP為內引物，其中F3TCTGGAGGGGTGAAAATGGAB3GTGCAACTGATCCCCTCAGFIPGCCCTCTGGGCAGCTGTTTGCGAAGGACAAGGGTTGCTTABIPAAGTCGAAACCCAGGAAACGCTAATGAGTGCTGACCGTGC；3、病毒DNA/RNA提取或細菌基因組DNA提取使用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，提取流感病毒RNA以及對照病毒毒株的病毒基因組DNA/RNA，或者疑似流感病變組織的RNA，使用細菌基因組提取試劑盒（北京康為試劑，貨號CW0552）提取對照菌株的基因組DNA。4、RT-LAMP反應體系建立按照試劑盒說明書，按25μl體系配置：2×反應緩沖液12.5μLEM1μLFIP40pmolBIP40pmolF35pmolB35pmol流感病毒RNA5μL超純水補足25μL。RT-LAMP反應在以實時濁度儀(LA-320C，日本榮研公司)進行密閉全程監(jiān)控的形式監(jiān)測本方法的檢出情況，濁度儀實時監(jiān)控擴增情況，可繪制標準曲線，通過獲得未知樣品達到0.1濁度值對應的時間值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)，反應溫度為63℃。5、RT-LAMP檢測方法1）特異性檢測使用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒分別提取流感病毒、豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒2型的基因組DNA/RNA。使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌、豬支原體的基因組DNA，作為RT-LAMP反應的模板，同時進行各毒株和菌株的RT-LAMP擴增，同時以水作為陰性對照，檢驗RT-LAMP方法的特異性。2）敏感性檢測測定流感病毒RNA的起始濃度，用RNA-FreeWater連續(xù)10倍倍比稀釋成8個稀釋度，以各RNA稀釋度作為模板，同時進行RT-LAMP擴增和RT-PCR擴增，對比兩種檢測方法的敏感性。3）熒光可視化檢測根據濁度儀監(jiān)控優(yōu)化的條件，在反應前加入鈣黃綠素商用染料，63℃下反應60分鐘后，在紫外燈下觀察，不采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像，避免開蓋跑電泳觀察造成的氣溶膠污染實驗室。實施例1RT-LAMP檢測方法的特異性結果結果如圖1所示，流感病毒反應管在20分鐘左右出現(xiàn)濁度的上升曲線，為陽性結果，6株對照毒株反應管和陰性對照反應管曲線均無擴增情況出現(xiàn)，為陰性結果。實施例2RT-LAMP檢測方法的敏感性結果流感病毒原始RNA的起始濃度為6.8ng/μL，經10倍倍比連續(xù)稀釋后，進行RT-LAMP和RT-PCR擴增，結果如圖2和圖3所示，結果顯示本發(fā)明的RT-LAMP法檢測限約為6.8×10-3ng/μL，而普通RT-PCR法檢測限為6.8×10-2ng/μL。實施例3RT-LAMP檢測方法的熒光可視化檢測結果根據濁度儀監(jiān)控優(yōu)化的條件，反應前加入熒光染料，63℃反應60分鐘后，在紫外燈下觀察，圖4為觀察結果，左管為以流感病毒為模板的反應情況，為陽性結果，右管為陰性對照，為陰性結果。試驗結果表明，本發(fā)明建立的RT-LAMP方法方便基層使用，只需使用試劑盒配合本方法設計的RT-LAMP引物，加入樣品后，用低廉的水浴鍋來保持63℃60分鐘，即可快速觀察結果，且無需開蓋，避免了污染。實施例4RT-LAMP檢測流感病毒定量標準曲線的繪制以流感病毒RNA為模板，用RNA-FreeWater進行連續(xù)10倍倍比稀釋，各稀釋度溶液作為標準樣品，進行RT-LAMP擴增。設置對照：濃度為0.68×101ng/μL、0.68×100ng/μL、0.68×10-1ng/μL、0.68×10-2ng/μL標準樣品各一個，因為標準樣品濃度的負對數(shù)值與其擴增濁度值為0.1的時間值成線性關系，可以將濁度儀捕捉到的值與時間（如表1）做成標準曲線，獲得標準曲線方程，y=0.3014x-8.1342，如圖5所示。從標準曲線方程來看相關系數(shù)R2為0.9945，呈良好的線性關系。以時間為X值，可求出Y值即濃度的負次方數(shù)，則濃度為10-y，再乘以基數(shù)0.68，即為0.68×10-yng/μL。如某試驗樣品達到濁度值為0.1的時間為30分鐘時，帶入所建立的標準曲線方程，求出Y等于0.9078，則濃度為10-0.9078，再乘以基數(shù)0.68，即為該樣品的濃度0.68×10-0.9078ng/μL，從而達到定量的效果。表1時間（min）23.926.929.933.9標準值（-LOG）-1012<110>廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所<120>一種流感病毒逆轉錄環(huán)介導等溫擴增試劑盒及其應用<160>4<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1TCTGGAGGGGTGAAAATGGA<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>2GTGCAACTGATCCCCTCAG<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>3GCCCTCTGGGCAGCTGTTTGCGAAGGACAAGGGTTGCTTA<210>4<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>4AAGTCGAAACCCAGGAAACGCTAATGAGTGCTGACCGTGC當前第1頁1 2 3