技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體說是涉及一種快速、可視化并且可實時定量檢測霍亂弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：弧菌屬(Vibrio)中霍亂弧菌(V.cholerae)可引起一種烈性腸道傳染病，發(fā)病急、傳染性強(qiáng)、病死率高，屬于國際檢疫傳染病。人類在自然情況下是霍亂弧菌的唯一易感者，主要通過污染的水源或飲食物經(jīng)口傳染。在一定條件下，霍亂弧菌進(jìn)入小腸后，依靠鞭毛的運動，穿過粘膜表面的粘液層，可能藉菌毛作用粘附于腸壁上皮細(xì)胞上，在腸粘膜表面迅速繁殖，經(jīng)過短暫的潛伏期后便急驟發(fā)病。該菌不侵入腸上皮細(xì)胞和腸腺，也不侵入血流，僅在局部繁殖和產(chǎn)生霍亂腸毒素，此毒素作用于粘膜上皮細(xì)胞與腸腺使腸液過度分泌，從而患者出現(xiàn)上吐下瀉，瀉出物呈"米泔水樣"并含大量弧菌，此為本病典型的特征。居住擁擠，衛(wèi)生狀況差，特別是公用水源是造成暴發(fā)流行的重要因素。人與人之間的直接傳播不常見。在正常胃酸條件下，如以水為載體，需飲入大于1010個細(xì)菌方能引起感染；如以食物作為載體，由于食物高強(qiáng)度的緩沖能力，感染劑量可減少到102~104個細(xì)菌。任何能降低胃中酸度的藥物或其他原因，都可使人對霍亂弧菌感染的敏感性增加。對霍亂弧菌進(jìn)行快速檢測，有利于臨床上快速做出治療應(yīng)對措施，對食品進(jìn)行霍亂弧菌檢測，切除傳染源，對保障公共衛(wèi)生安全有重大意義。目前，霍亂弧菌的檢測技術(shù)主要有常規(guī)方法和分子生物學(xué)方法。常規(guī)方法是通過對細(xì)菌的表型特征和生化指標(biāo)進(jìn)行鑒定。從樣品中分離病原菌需要耗費大量的時間和相對苛刻的操作環(huán)境條件，且分離率低。鑒定霍亂弧菌的生化指標(biāo)主要包括：革蘭氏染色、氧化酶實驗、過氧化氧酶實驗、V-P反應(yīng)(福格斯-普利斯考爾)產(chǎn)物實驗，生化試驗通常耗時24-72小時。目前也有PCR檢測方法報道。通常以霍亂腸毒素(choleraenterotoxin，CT)基因ctx的保守序列作為靶基因。然而，一些非產(chǎn)毒株(如環(huán)境來源的菌株)有可能通過基因水平轉(zhuǎn)移獲得毒力基因成為產(chǎn)毒株，若僅檢測ctx基因容易造成漏檢。此外，霍亂弧菌的其他重要基因，如毒力協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛A基因(tcpA)、o抗原基因(rfb)、外膜蛋白基因(omp)以及毒力表達(dá)調(diào)控基因(toxR)等也被選用為PCR的靶基因。雖然PCR方法較常規(guī)方法快速準(zhǔn)確，但需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，成本較高，不適合基層和現(xiàn)場檢測，此外，在結(jié)果判定上需要先進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，再使用紫外透射儀照射進(jìn)行判定，且通過肉眼判定具有人為主觀因素，還容易造成實驗室污染。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種為基層簡便、快捷準(zhǔn)確地檢測霍亂弧菌的方法，公開一種快速、實時定量的定量檢測霍亂弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑盒。為實現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的技術(shù)方案為：一種霍亂弧菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑盒，該試劑盒包括LAMP引物、2×反應(yīng)緩沖液、BstDNA聚合酶、熒光目視檢測試劑、超純水和霍亂弧菌DNA模板；所述的LAMP引物包括外引物F3與B3和內(nèi)引物是FIP與BIP；其中引物的序列分別為：F3CTGAAACCTTTGTTGCCGCB3GCCCATAGAAAGAGTCGCTGFIPGGCAGGATGGTAACCCCTGAGTAAAGATCCAGGCCAAGTTCGBIPTTACCGATGAAGAAGTCGCCGCTTGGCTTCAACCACTTCAGT；所述的2×反應(yīng)緩沖液包括Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。以上所述的霍亂弧菌DNA模板是使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取的霍亂弧菌DNA。以上所述的熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素?zé)晒庠噭?，熒光試劑在反?yīng)前加入。以上所述的2×反應(yīng)緩沖液包括Tris-HCL35-55mM、KCL18-32mM、MgSO415-25mM、(NH4)2SO422-28mM、Tween200.3-0.6℅、Betaine1.5-3M和dNTPs3-4.5mM，其配制方法在pH為9.0條件下，將上述溶劑混合均勻獲得。一種霍亂弧菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑盒的應(yīng)用，用于快速檢測樣品中是否存在霍亂弧菌污染，以及對疑似霍亂弧菌進(jìn)行鑒定，具體檢測步驟包括：（1）LAMP引物的設(shè)計與合成（2）霍亂弧菌DNA模板的提?。?）LAMP反應(yīng)體系建立（4）LAMP檢測方法。以上所述的LAMP反應(yīng)體系建立LAMP反應(yīng)體系以25μl計，2×反應(yīng)緩沖液12.5μLBstDNA聚合酶1μLFIP40pmolBIP40pmolF35pmolB35pmol霍亂弧菌DNA2μL超純水補足25μL。以上所述的LAMP檢測方法是采用特異性檢測、敏感性檢測和熒光可視化檢測的方法。以上所述的LAMP檢測方法采用LoopampLA-320C實時濁度儀進(jìn)行密閉全程監(jiān)控，反應(yīng)溫度為63℃、反應(yīng)在35-40分鐘出現(xiàn)擴(kuò)增。本發(fā)明的實質(zhì)性特點和顯著進(jìn)步是：1）特異性強(qiáng)所檢測的陰性對照細(xì)菌和水對照均無陽性結(jié)果出來，與PCR檢測結(jié)果一致。且操作簡便、快速獲得檢測結(jié)果、無需昂貴復(fù)雜的儀器。2）靈敏度高普通的PCR檢測方法的靈敏度為2.05×10-1ng/μL數(shù)量級，而使用本發(fā)明檢測方法，檢測限約為2.05×10-2ng/μL，是普通PCR的10倍左右。3）迅速得出結(jié)果普通的PCR整個過程在24小時左右才能得出結(jié)果，目前多數(shù)建立的LAMP反應(yīng)方法在反應(yīng)結(jié)束后，須采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像來判定結(jié)果，從細(xì)菌基因組DNA提取到獲取試驗結(jié)果，需要4-5小時左右。本發(fā)明提供的LAMP檢測方法反應(yīng)在35-40分鐘間出現(xiàn)擴(kuò)增，60分鐘內(nèi)即可完成擴(kuò)增，且結(jié)果判定方式簡便—擴(kuò)增結(jié)束即可判斷結(jié)果，不需要再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析，從基因組DNA提取到獲得最終結(jié)果可在2-3小時內(nèi)完成。4）不造成污染目前LAMP方法用于直接觀察的熒光染料為反應(yīng)后加入，但顯色法只能是反應(yīng)結(jié)束后開蓋加入熒光染料進(jìn)行顯色反應(yīng)，觀察是否有顯色來判讀試驗結(jié)果，或者通過跑電泳的方法進(jìn)行結(jié)果判定，無法區(qū)分特異性擴(kuò)增與非特異性擴(kuò)增，因此增加了假陽性診斷結(jié)果的幾率；而且對于弱陽性反應(yīng)，通過人為肉眼判讀的方式很可能誤判為陰性；通過電泳的方法來判讀結(jié)果的方式，增加了試驗成本、耗時間且容易造成實驗室污染。而本發(fā)明的LAMP熒光檢測方法，熒光染料是在反應(yīng)前加入，不需要開蓋，能有效避免氣溶膠污染。此外，本發(fā)明的LAMP檢測方法在結(jié)果判定上，可以直接通過濁度儀檢測反應(yīng)管的濁度值來判定結(jié)果，可不進(jìn)行熒光染料法檢測結(jié)果或者進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。5）可實時定量本發(fā)明利用Tubidimeterreal-timeLA-320濁度儀來實時分析LAMP反應(yīng)的結(jié)果，不同的標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度對應(yīng)的濁度值的時間繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，代人標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可進(jìn)行定量檢測。附圖說明圖1是本發(fā)明LAMP方法特異性檢測結(jié)果，其中A1、霍亂弧菌1；A2、霍亂弧菌2；A3、嗜水氣單胞菌；A4、維氏氣單胞菌；A5、鮰愛德華氏單胞菌；A6、哈氏孤菌；A7、創(chuàng)傷孤菌；A8、水對照；結(jié)果顯示2株霍亂弧菌反應(yīng)管出現(xiàn)濁度的上升曲線，為陽性結(jié)果，5株陰性對照菌反應(yīng)管和水對照反應(yīng)均無擴(kuò)增。圖2和圖3分別是本發(fā)明LAMP方法及傳統(tǒng)PCR方法的敏感性檢測結(jié)果；其中1：2.05×101ng/Μl；2：2.05×100ng/μL；3：2.05×10-1ng/μL；4：2.05×10-2ng/μL；5：2.05×10-3ng/μL；6：2.05×10-4ng/μL；7：2.05×10-5ng/μL；8：2.05×10-6ng/μL；9：2.05×10-7ng/μL?；魜y弧菌模板DNA的起始濃度為2.05×101ng/μL，經(jīng)10倍倍比稀釋后進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示LAMP法檢測限約為2.05×10-2ng/μL，而PCR法檢測限為2.05×10-1ng/μL。圖4是加入熒光染料后肉眼觀察結(jié)果：右管為以霍亂弧菌基因組DNA為模板的反應(yīng)情況，為陽性結(jié)果，左管為陰性對照的反應(yīng)情況，為陰性結(jié)果。圖5是本發(fā)明定量檢測霍亂弧菌LAMP方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線：利用不同的標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度對應(yīng)的濁度值對時間繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可進(jìn)行定量檢測。具體實施方式1、材料的準(zhǔn)備霍亂弧菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、鮰愛德華氏單胞菌、哈氏孤菌、創(chuàng)傷孤菌，為廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)所分離鑒定和保存。LAMP法DNA擴(kuò)增試劑盒購自北京藍(lán)譜生物科技有限公司，貨號SLP204，細(xì)菌基因組提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號CW0522。2、LAMP引物的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank中的霍亂弧菌Mdh序列，利用LAMP法引物輔助設(shè)計軟件PrimerExplorerV4軟件設(shè)計一套LAMP引物，其中F3、B3為外引物，F(xiàn)IP、BIP為內(nèi)引物，其中F3、B3為霍亂弧菌PCR檢測引物，其中F3CTGAAACCTTTGTTGCCGCB3GCCCATAGAAAGAGTCGCTGFIPGGCAGGATGGTAACCCCTGAGTAAAGATCCAGGCCAAGTTCGBIPTTACCGATGAAGAAGTCGCCGCTTGGCTTCAACCACTTCAGT；3、細(xì)菌基因組DNA提取使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取受試細(xì)菌的基因組DNA。4、LAMP反應(yīng)體系建立按照試劑盒說明書，按25μl體系配置：2×反應(yīng)緩沖液12.5μLBstDNA聚合酶1μLFIP40pmolBIP40pmolF35pmolB35pmol霍亂弧菌DNA2μL超純水補足25μL。LAMP反應(yīng)在以實時濁度儀(LA-320C，日本榮研公司)進(jìn)行密閉全程監(jiān)控的形式監(jiān)測本方法的檢出情況，濁度儀實時監(jiān)控擴(kuò)增情況，可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過獲得未知樣品達(dá)到0.1濁度值對應(yīng)的時間值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)，反應(yīng)溫度以試劑盒推薦的63℃做為反應(yīng)溫度。5、LAMP檢測方法1）特異性檢測分別提取霍亂弧菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、鮰愛德華氏單胞菌、哈氏孤菌、創(chuàng)傷孤菌的基因組DNA作為LAMP反應(yīng)的模板，檢驗LAMP方法的特異性。2）敏感性檢測以提取的霍亂弧菌基因組DNA為模板，測定其濃度，用RNA-FreeWater連續(xù)10倍倍比稀釋成8個稀釋度，取各稀釋度2μL作為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增和PCR擴(kuò)增，對比兩種檢測方法的敏感性。3）熒光可視化檢測根據(jù)濁度儀監(jiān)控優(yōu)化的條件，加入熒光染料，熒光染料在反應(yīng)前加入，加入的染料為鈣黃綠素商用染料，63℃下反應(yīng)60分鐘后，在紫外燈下觀察，不采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像，避免開蓋跑電泳觀察造成的氣溶膠污染。實施例1LAMP檢測方法的特異性結(jié)果對2株霍亂弧菌、5株陰性對照菌和水對照進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，霍亂弧菌反應(yīng)管在33分鐘左右出現(xiàn)濁度的上升曲線，為陽性結(jié)果，5株陰性對照菌反應(yīng)管和水對照反應(yīng)管曲線均無擴(kuò)增情況出現(xiàn)，為陰性結(jié)果。實施例2LAMP檢測方法的敏感性結(jié)果霍亂弧菌DNA模板起始濃度為2.05×101ng/μL，經(jīng)10倍倍比稀釋后進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2和圖3所示，結(jié)果顯示LAMP法檢測限約為2.05×10-2ng/μL，而PCR法檢測限為2.05×10-1ng/μL。實施例3LAMP檢測方法的熒光可視化檢測結(jié)果根據(jù)濁度儀監(jiān)控優(yōu)化的條件，反應(yīng)器加入熒光染料，63℃反應(yīng)60分鐘后，在紫外燈下觀察，圖4為觀察結(jié)果，左管為陰性對照，右管為以霍亂弧菌為模板的反應(yīng)情況，表明建立的方法可以方便基層使用，只需使用試劑盒配合本方法設(shè)計的LAMP引物，加入樣品后，用低廉的水浴鍋來保持63℃60分鐘，即可快速觀察結(jié)果，且無需開蓋，避免了污染。實施例4霍亂弧菌定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制設(shè)置對照：濃度為2.05×101ng/μL、2:2.05×100ng/μL、2.05×10-1ng/μL、4:2.05×10-2ng/μL的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個，因為標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度的負(fù)對數(shù)值與其擴(kuò)增濁度值為0.1的時間值成線性關(guān)系，所以可以將濁度儀捕捉到的值與時間（如表1）做成標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，y=0.1772x-6.9253，如圖5所示。從標(biāo)準(zhǔn)曲線方程來看相關(guān)系數(shù)R2=0.9924，呈良好的線性關(guān)系。以時間為X值，可求出Y值即濃度的負(fù)次方數(shù)，則濃度為10-y，再乘以基數(shù)2.05，即為2.05×10-yng/μL。如某試驗樣品達(dá)到濁度值為0.1的時間為35分鐘時，帶入所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求出Y等于-0.7233，則濃度為100.7233，再乘以基數(shù)2.05，即為該樣品的濃度2.05×100.7233ng/μL，從而達(dá)到定量的效果。表1時間(min)33.938.943.950.9標(biāo)準(zhǔn)值（-LOG）-1012<110>廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所<120>一種霍亂弧菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用<160>4<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>1CTGAAACCTTTGTTGCCGC<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2GCCCATAGAAAGAGTCGCTG<210>3<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>3GGCAGGATGGTAACCCCTGAGTAAAGATCCAGGCCAAGTTCG<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>4TTACCGATGAAGAAGTCGCCGCTTGGCTTCAACCACTTCAGT當(dāng)前第1頁1 2 3