1.一種霍亂弧菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒,其特征在于,該試劑盒包括LAMP引物、2×反應(yīng)緩沖液、Bst DNA聚合酶、熒光目視檢測(cè)試劑、超純水和霍亂弧菌DNA模板;所述的LAMP引物包括外引物F3與B3和內(nèi)引物是FIP與BIP;其中以外引物F3和B3作為PCR診斷引物;
其中引物的序列分別為:
F3 CTGAAACCTTTGTTGCCGC
B3 GCCCATAGAAAGAGTCGCTG
FIP GGCAGGATGGTAACCCCTGAGTAAAGATCCAGGCCAAGTTCG
BIP TTACCGATGAAGAAGTCGCCGCTTGGCTTCAACCACTTCAGT;
所述的2×反應(yīng)緩沖液包括Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的霍亂弧菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒,其特征在于,所述的霍亂弧菌DNA模板取自細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的霍亂弧菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒,其特征在于,所述的熒光目視檢測(cè)試劑采用鈣黃綠素?zé)晒庠噭瑹晒庠噭┰诜磻?yīng)前加入。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的霍亂弧菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒,其特征在于,所述的2×反應(yīng)緩沖液包括Tris-HCL 35-55mM、KCL 18-32mM、MgSO4 15-25mM、(NH4)2SO4 22-28mM、Tween20 0.3-0.6℅、Betaine 1.5-3 M 和dNTPs3-4.5mM。
5.一種霍亂弧菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒的應(yīng)用,其特征在于,具體操作步驟包括:
(1)LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成
(2)霍亂弧菌DNA模板的提取
(3)LAMP反應(yīng)體系建立
(4)LAMP檢測(cè)方法。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的霍亂弧菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒的應(yīng)用,其特征在于,所述的LAMP反應(yīng)體系建立LAMP反應(yīng)體系以25μL計(jì),
2×反應(yīng)緩沖液 12.5 μL
Bst DNA聚合酶 1 μL
FIP 40 pmol
BIP 40 pmol
F3 5 pmol
B3 5 pmol
霍亂弧菌DNA 2 μL
超純水 補(bǔ)足25 μL。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的霍亂弧菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒的應(yīng)用,其特征在于,所述的LAMP檢測(cè)方法是采用特異性檢測(cè)、敏感性檢測(cè)和熒光可視化檢測(cè)的方法。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的霍亂弧菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒的應(yīng)用,其特征在于,所述的LAMP檢測(cè)方法采用實(shí)時(shí)濁度儀進(jìn)行密閉全程監(jiān)控。