本發(fā)明涉及一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)啟動(dòng)子，特別是涉及一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)啟動(dòng)子及其制造和使用方法。

背景技術(shù)：

哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子序列在質(zhì)粒和病毒載體中具有重要應(yīng)用，廣泛用在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的基因表達(dá)方面。在蛋白表達(dá)、質(zhì)粒構(gòu)建、病毒構(gòu)建、目的基因表達(dá)和傳遞、基因治療等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用。目前普遍使用的基因表達(dá)載體包括質(zhì)粒載體和病毒載體所使用的啟動(dòng)子序列多為病毒性啟動(dòng)子，如CMV，這些載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)量比較高，但是屬于瞬時(shí)表達(dá)，表達(dá)時(shí)間較短。針對(duì)這些問(wèn)題，科學(xué)家開發(fā)了一些哺乳動(dòng)物源性的啟動(dòng)子，例如人血清白蛋白Human Serum Albumin啟動(dòng)子序列，這些真核動(dòng)物源性的啟動(dòng)子序列明顯延長(zhǎng)了外源載體在細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)時(shí)間，但是他們也有兩個(gè)缺點(diǎn)，第一、表達(dá)量明顯比病毒性啟動(dòng)子載體低，第二、這一類的啟動(dòng)子序列直接從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制下來(lái)，一般比較長(zhǎng)，應(yīng)用在一些病毒載體中會(huì)受到局限性，例如AAV載體最多只能容納4.7KB的外源DNA片段，過(guò)長(zhǎng)的啟動(dòng)子序列限制了目的基因的長(zhǎng)度和，降低了AAV載體的應(yīng)用廣度。針對(duì)病毒和哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子的局限性，我們利用生物信息學(xué)手段，通過(guò)大量的計(jì)算模擬、細(xì)胞和動(dòng)物篩選，獲得了一個(gè)表達(dá)量高、表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)的啟動(dòng)子序列。該序列可以作為質(zhì)粒載體的啟動(dòng)子，應(yīng)用于外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、動(dòng)物成體、和人體的表達(dá)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)啟動(dòng)子及其制造和使用方法，其獲得一個(gè)能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中長(zhǎng)效、高量表達(dá)外源基因的且包含較少堿基數(shù)目的啟動(dòng)子序列，其長(zhǎng)度為226bp。本啟動(dòng)子可以為基于質(zhì)粒載體的基因治療提供一個(gè)優(yōu)質(zhì)的啟動(dòng)子，大大提高現(xiàn)有質(zhì)粒的表達(dá)效率。

本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案來(lái)解決上述技術(shù)問(wèn)題的：一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)啟動(dòng)子，其特征在于，其采用夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中長(zhǎng)效、高量表達(dá)外源基因的且包含較少堿基數(shù)目的核酸序列。

本發(fā)明還提供一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)啟動(dòng)子的制造和使用方法，其特征在于，所述長(zhǎng)效哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)啟動(dòng)子核酸序列的制造和使用方法包括以下步驟：

步驟一，通過(guò)化學(xué)合成的方式合成引物一：5’-ACGGGGTACCTCACTCTTGGCACGGGGAAT-3’；引物二：5’-GGAAGATCTCATTGACGTCAATCAAAATGTCGTAACAACTCC-3’ ；

步驟二，通過(guò)PCR反應(yīng)，獲得哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)啟動(dòng)子序列；

步驟三，通過(guò)限制性酶切位點(diǎn)：BglII 和Kpn1，上述哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)啟動(dòng)子序列插入包含有ori、卡納抗性基因、sv40、sv40 polyA、多酶切位點(diǎn)序列的質(zhì)粒骨架中，得到質(zhì)粒；

步驟四，轉(zhuǎn)染入E.Coli大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序；

步驟五，將新獲得的質(zhì)粒插入SEAP和IL10目的基因，通過(guò)CsCL密度梯度離心法提取純凈質(zhì)粒；

步驟六，將10ug質(zhì)粒融入生理鹽水中，通過(guò)液動(dòng)基因傳遞方式導(dǎo)入昆明小鼠的肝臟中；

步驟七，在第12小時(shí)、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天、42天、56天、90天，通過(guò)小鼠尾靜脈取血，提取血漿；

步驟八，通過(guò)堿性磷酸酶試劑盒，檢測(cè)血液中的SEAP含量。

優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)啟動(dòng)子序列適合于所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的質(zhì)粒和病毒載體。

優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)啟動(dòng)子為人源序列。

優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)啟動(dòng)子為短轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：一，本啟動(dòng)子 (pHep/L1)適合于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的質(zhì)粒和病毒載體，對(duì)于體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染、動(dòng)物體內(nèi)外源基因表達(dá)、人體內(nèi)的基因治療都有重要應(yīng)用；二，該啟動(dòng)子 (pHep/L1)為人源序列，適合于針對(duì)人類疾病的基因治療；三，該啟動(dòng)子 (pHep/L1)為短轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包含較少的堿基數(shù)量，有利于作為病毒載體的啟動(dòng)子序列；四，該啟動(dòng)子具有較高的組織特異性，適合于肝臟的靶點(diǎn)基因表達(dá)；五，該啟動(dòng)子能有效延長(zhǎng)外源基因的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)量。

附圖說(shuō)明

圖1表示新啟動(dòng)子序列和CMV啟動(dòng)子引導(dǎo)的小鼠IL10 基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)曲線圖。

圖2表示新啟動(dòng)子序列和CMV啟動(dòng)子引導(dǎo)的SEAP基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)曲線圖。

圖3為啟動(dòng)子序列插入包含有ori、卡納抗性基因、sv40、sv40 polyA、多酶切位點(diǎn)序列的質(zhì)粒骨架的示意圖。

圖4為本發(fā)明涉及到的核酸序列圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖給出本發(fā)明較佳實(shí)施例，以詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。

本發(fā)明哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)啟動(dòng)子，其特征在于，其采用夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中長(zhǎng)效、高量表達(dá)外源基因的且包含較少堿基數(shù)目的核酸序列，涉及到的啟動(dòng)子序列如下：cattgacgtcaat caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg accgatccag cctccgcggc cgggaacggt gcattggaac gcggattccc cgtgccaagagtga（如圖4所示）。

本發(fā)明哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)啟動(dòng)子的制造和使用方法包括以下步驟：

步驟一，通過(guò)化學(xué)合成的方式合成引物一：5’-ACGGGGTACCTCACTCTTGGCACGGGGAAT-3’；引物二：5’-GGAAGATCTCATTGACGTCAATCAAAATGTCGTAACAACTCC-3’ ；

步驟二，通過(guò)PCR（聚合酶鏈反應(yīng)，Polymerase Chain Reaction）反應(yīng)，獲得啟動(dòng)子序列；

步驟三，通過(guò)限制性酶切位點(diǎn)：BglII 和Kpn1，上述啟動(dòng)子序列插入包含有ori、卡納抗性基因、sv40、sv40 polyA、多酶切位點(diǎn)序列的質(zhì)粒骨架（圖3）中，得到 pHep/L1質(zhì)粒；

步驟四，轉(zhuǎn)染入E.Coli大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序。

步驟五，將新獲得的質(zhì)粒插入SEAP和IL10目的基因，通過(guò)CsCL密度梯度離心法提取純凈質(zhì)粒；

步驟六，將10ug質(zhì)粒融入生理鹽水中，通過(guò)液動(dòng)基因傳遞方式導(dǎo)入昆明（KM）小鼠的肝臟中；

步驟七，在第12小時(shí)、1天、2天、3天、5天、7天、14天、21天、28天、42天、56天、90天，通過(guò)小鼠尾靜脈取血，提取血漿；

步驟八，通過(guò)堿性磷酸酶試劑盒，檢測(cè)血液中的SEAP含量。

本發(fā)明搜索能夠在人和動(dòng)物肝臟中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，并篩選這些轉(zhuǎn)錄因子的特異性結(jié)合位點(diǎn)，建立轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)庫(kù)。將這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)序列通過(guò)化學(xué)合成的方式合成，插入包含有ori、卡納抗性基因、sv40、sv40 polyA、多酶切位點(diǎn)序列的載體骨架中，構(gòu)建成新的表達(dá)載體。然后將SEAP、IL10等目的基因插入該載體的多酶切位點(diǎn)，通過(guò)液動(dòng)基因傳遞的方式導(dǎo)入昆明（KM）小鼠體內(nèi)，在不同時(shí)間點(diǎn)取血，然后利用商業(yè)化試劑盒檢測(cè)SEAP、IL10等外源基因在血液中的濃度，測(cè)定其表達(dá)量和表達(dá)時(shí)間。

圖1表示新啟動(dòng)子序列和CMV啟動(dòng)子引導(dǎo)的小鼠IL10 基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)曲線。新啟動(dòng)子的表達(dá)時(shí)間比CMV啟動(dòng)子延長(zhǎng)了2個(gè)月，長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)量提高了1000倍。

圖2表示新啟動(dòng)子序列和CMV啟動(dòng)子引導(dǎo)的SEAP基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)曲線。新啟動(dòng)子的表達(dá)時(shí)間比CMV啟動(dòng)子延長(zhǎng)了2個(gè)月，長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)量提高了1000倍。

以上所述的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的解決的技術(shù)問(wèn)題、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。