背景技術(shù)：

腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展離不開新生血管的營養(yǎng)供給，而新生血管的生長離不開各種細(xì)胞因子及其受體的相互作用?，F(xiàn)有研究表明，血管內(nèi)皮生長因子/血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGF/VEGFR)信號通路對于新生血管的生成具有關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用。VEGFR2作為VEGF的主要受體，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、存活、遷移和通透性的改變。

人血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor2，也稱為VEGFR2或KDR、Flk-1，本文稱作“VEGFR2”)是230kDa的跨膜糖蛋白，屬于受體酪氨酸激酶超家族，是血管生長因子(VEGF)的主要功能受體，主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中，VEGF刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增加血管通透性和新血管生成的作用主要通過結(jié)合和激活VEGFR2來實(shí)現(xiàn)，同時(shí)VEGFR2在一些腫瘤細(xì)胞表面也有表達(dá)。靶向VEGFR2藥物主要有兩類：一類是直接作用于受體細(xì)胞內(nèi)區(qū)段以防止信號傳導(dǎo)的合成的酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，主要包括Sunitinib、Ceritinib等；另一類是阻斷配體結(jié)合到受體胞外功能域的單克隆抗體(mAb)，包括雷莫盧單抗(Ramucirumab)等。

干擾素(interferon，IFN)是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)(主要是糖蛋白)，它具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤活性，同時(shí)還可增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用，是目前主要的抗腫瘤生物制品之一。但是干擾素因半衰期短、系統(tǒng)性毒副作用強(qiáng)等缺點(diǎn)限制了其在臨床上的應(yīng)用。借助基因重組技術(shù)將干擾素與靶向VEGFR2的全長抗體偶聯(lián)，既可以延長干擾素體內(nèi)半衰期，同時(shí)可以借助抗體的靶向作用將干擾素富集于腫瘤及腫瘤新生血管部位，降低其系統(tǒng)毒副作用，令其更有效地發(fā)揮抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用。本課題組已經(jīng)基于該原理表達(dá)出這種具有抗血管生成活性和抗腫瘤活性的融合抗體anti-VEGFR2-，即JZA01。

雖然野生型干擾素有很強(qiáng)的生物學(xué)功能，但由于其與受體親和力低，它發(fā)揮作用受到一定限制。干擾素α的受體有IFNAR1和IFNAR2，它們位于干擾素分子對立的兩側(cè)，幾乎不相互影響。與IFNAR1的親和力主要決定抗增殖能力；與IFNAR2的親和力主要決定抗病毒能力。干擾素與兩個(gè)受體的聯(lián)合親和力，是與IFNAR1和IFNAR2的單獨(dú)親和力的乘積；且干擾素與兩個(gè)受體形成的三聚體復(fù)合物的穩(wěn)定性與介導(dǎo)的抗增殖能力成正比。干擾素與IFNAR1是低親和力的，提高該親和力可以明顯增強(qiáng)干擾素的抗增殖能力。通過對野生型干擾素進(jìn)行YNS突變(突變位點(diǎn)：H57Y、E58N、Q61S)，它與IFNAR1的親和力可以提高60倍，與IFNAR2的親和力與突變前相當(dāng)；抗增殖能力可以提高150倍，抗病毒能力提高3.5倍。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的

本發(fā)明提供一種具有潛在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)價(jià)值的全人源抗人VEGFR2的融合抗體。本發(fā)明蛋白的特征為特異性結(jié)合人VEGFR2胞外區(qū)，偶聯(lián)的IFNα突變體其抗病毒、抑增殖及免疫調(diào)節(jié)功能強(qiáng)于野生型IFNα，在體外能夠抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的增殖及部分腫瘤細(xì)胞的增殖，且效果強(qiáng)于JZA01。

技術(shù)方案

一種全人源的抗VEGFR2的融合抗體，其特征在于：以抗VEGFR2的全長抗體JZB00和IFNα突變體蛋白為基礎(chǔ)，通過基因重組技術(shù)以柔性肽將兩者連接。

其中一條鏈由抗VEGFR2的全長抗體的重鏈與IFNα突變體蛋白以柔性肽連接組成，其氨基酸序列為SEQ NO.1；另一條為抗VEGFR2的全長抗體的輕鏈，其氨基酸序列為SEQ NO.2。

一種分離的核酸，其特征在于該核酸編碼上述的融合抗體。

一種表達(dá)載體，含有上述的核酸(該遺傳資源取自人，自行采集于中國藥科大學(xué)1518實(shí)驗(yàn)室)。

一種重組宿主細(xì)胞，含上述的表達(dá)載體。

上述任一項(xiàng)的抗體或抗體片段的應(yīng)用，選擇性地與VEGFR2結(jié)合或抑制VEGFR2與VEGFR2配體的結(jié)合或中和VEGFR2。

上述任一項(xiàng)的抗體片段，選自單鏈抗體、Fab、單鏈Fv、雙抗體和三抗體。

上述任一項(xiàng)的抗體或抗體片段的偶聯(lián)物。

上述任一項(xiàng)的抗體或抗體片段的突變體。

靶向VEGFR2融合抗體在腫瘤治療方面的應(yīng)用。

發(fā)明進(jìn)一步說明：

本發(fā)明中全人源抗VEGFR2融合抗體重鏈由抗VEGFR2的全長抗體的重鏈與IFNα突變體以柔性肽(GGGGS)連接，輕鏈為抗VEGFR2的全長抗體的輕鏈。IFNα經(jīng)YNS突變后，與IFNAR1的親和力可以提高60倍，與IFNAR2的親和力與突變前相當(dāng)；抗增殖能力可以提高150倍，抗病毒能力提高3.5倍，因此在抗腫瘤及抗病毒方面比IFNα更體現(xiàn)出優(yōu)勢，從而導(dǎo)致JZA02的抗腫瘤及抗病毒效果優(yōu)于JZA01。

含有本發(fā)明血管內(nèi)皮生長因子受體2融合抗體基因的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增本發(fā)明融合抗體基因的任意片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種可以表達(dá)和純化上述抗血管內(nèi)皮生長因子受體2抗體的方法。

Western Blot鑒定分離純化得到的JZA02；檢測融合抗體加對人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC及部分腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用。

本發(fā)明得到的抗血管內(nèi)皮生長因子受體2與人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC表面血管內(nèi)皮生長因子受體2具有高特異性結(jié)合，體外抑制HUVEC及部分腫瘤細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明得到的融合抗體可以明顯抑制HUVEC及部分腫瘤細(xì)胞的生長，且抑制效果強(qiáng)于JZA01。本發(fā)明為治療和診斷以血管內(nèi)皮生長因子受體2抗原的表達(dá)，特別是過量表達(dá)為特征的疾病提供了基于抗體的療法，相關(guān)疾病包括但不限于自身免疫病和癌癥。

附圖說明

圖1是JZA02結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2JZA02-H chain質(zhì)粒大量提取的核酸凝膠電泳圖。

圖3顯示SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳圖，描述發(fā)酵表達(dá)的JZA01和JZA02分別通過ProteinA親和層析柱進(jìn)行分離純化的結(jié)果。Lane1為JZA01，Lane2為JZA02。

圖4展示利用Western Blot鑒定純化后的JZA02。圖A、圖B分別為用HRP偶聯(lián)的羊抗人Fc段的抗體檢測，得到的JZA01、JZA02、JZA00的非還原(NR)與還原(R)電泳，其中Lane1、2、3、4分別為JZA01、JZA02、JZA02、JZA00。圖C、圖D分別為用兔抗人κ鏈的抗體為一抗，HRP偶聯(lián)的羊抗兔二抗得到的JZA01、JZA02、JZA00的非還原(NR)與還原(R)電泳，其中Lane1、2、3、4分別為JZA01、JZA02、JZA02、JZA00。

圖E、圖F分別為用鼠抗人IFNα的抗體為一抗，HRP偶聯(lián)的羊抗鼠二抗得到的JZA01、JZA02、JZA00的非還原(NR)與還原(R)電泳，其中Lane1、2、3、4分別為JZA01、JZA02、JZA02、JZA00。

圖5是一曲線圖，描述JZA01和JZA02對HUVEC細(xì)胞的生長抑制作用。

圖6是一曲線圖，描述JZA01和JZA02對HCT-116和SW620這兩種腫瘤細(xì)胞在常氧條件下的生長抑制作用。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例中涉及的百分比，其中固定試劑為重量體積百分比，液體試劑為體積百分比。

實(shí)施例1全人源抗VEGFR2融合抗體基因的構(gòu)建

本課題組已成功得到了抗VEGFR2融合抗體JZA01的重組質(zhì)粒。JZA01為在抗體Fc段的C端通過G₄S Linker偶聯(lián)了IFNα的融合抗體，在其重鏈表達(dá)質(zhì)粒中，表達(dá)IFNα部分的兩端含有酶切位點(diǎn)BamHI和PmeI?；诖耍韧ㄟ^對質(zhì)粒的雙酶切獲得表達(dá)IFNα的序列，然后，以獲得的IFNα為模板，設(shè)計(jì)突變引物，利用overlap PCR獲得IFNαmut，再通過兩端的酶切位點(diǎn)替換JZA01-H chain的野生型IFNα部分，得到了表達(dá)載體JZA02-H chain。將得到的突變體表達(dá)載體以及共有的輕鏈L chain大量提取，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。

實(shí)施例2抗VEGFR2融合抗體的表達(dá)、純化及SDS鑒定

輕重鏈瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，通過加壓篩選和兩次有限稀釋法挑選穩(wěn)定高產(chǎn)的單克隆細(xì)胞株。將穩(wěn)定高產(chǎn)細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清，6000rpm，4℃離心30min后用0.22μm濾膜過濾，ProteinA親和層析柱純化，洗脫液洗脫蛋白。純化得到的JZA02與JZA01分別與非還原型SDS-PAGE上樣緩沖液以4∶1(20μl∶5μl)的比例在Eppendorf管中混合，100℃水浴放置5min后3000rpm離心5min，蛋白樣品制備好后待用。配置10％的SDS-PAGE膠，進(jìn)行電泳，80mA恒流30min、120min恒流30min后停止電泳。卸下膠板，剝離膠放入染色液中，室溫染色1～2h；加入脫色液，置于80rpm脫色搖床上，每20min更換一次脫色液(10ml冰乙酸；45ml乙醇；45ml蒸餾水)至完全脫凈。凝膠成像儀(Tanon 1600B)拍照。

實(shí)施例3抗VEGFR2融合抗體的Western Blot鑒定

純化得到的JZA01、JZA02、JZA00進(jìn)行SDS-PAGE電泳，80V恒壓30min、120V恒壓30min、轉(zhuǎn)印2h，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜(購自Millipore)轉(zhuǎn)印結(jié)束，將膜在5％MTBS(含有5％脫脂牛奶的TBS)中室溫封閉2h；用5％MTBS按1∶2000稀釋一抗(A&B圖為HRP偶聯(lián)的羊抗人Fc段的抗體，無二抗；C&D圖為兔抗人κ鏈的抗體；E&F圖為鼠抗人IFNα的抗體)(購自abcam)，室溫孵育1.5h，TBST洗滌三遍，TBS洗滌3遍，每次10min；用5％MTBS按1∶5000稀釋二抗(C&D圖為HRP偶聯(lián)的羊抗兔的二抗；E&F圖為羊抗鼠的二抗)(購自聯(lián)科生物)，室溫孵育1.5h，TBST洗滌三遍，TBS洗滌3遍，每次10min；用DAB顯色，結(jié)果如圖3所示。

實(shí)施例4抗VEGFR2融合抗體對HUVEC及部分腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用

將細(xì)胞制備成3×10⁴cells/ml細(xì)胞懸液，接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μl/孔，在37℃ 5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。共一個(gè)對照組和兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組。用2％胎牛血清培養(yǎng)基配制藥物，共有JZA01和JZA02兩組，每組設(shè)置0.01nM，0.1nM，1nM，10nM，100nM，200nM共6個(gè)濃度。將培養(yǎng)的細(xì)胞棄去上清，按照分組加入藥物，每孔100μl，每組藥物每個(gè)濃度設(shè)置三個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)72h，每孔加入11μl的MTT，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心傾去上清，每孔加入150μl DMSO，在酶標(biāo)儀570nm/630nm波長處測定光吸收值(OD值)，計(jì)算藥物對細(xì)胞增殖的抑制率。JZA01和JZA02的生物活性由細(xì)胞生長的抑制率評價(jià)。抑制率＝(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100％。