本發(fā)明涉及生物可降解高分子領(lǐng)域，特別涉及一種生物可降解超分子聚乳酸微球的制備方法。

背景技術(shù)：

納米顆粒或微球作為一種藥物載體材料，在藥物的控制釋放領(lǐng)域得到了廣泛的研究和應(yīng)用。微球載體能夠克服現(xiàn)有藥物制劑的一些弊端，利用自身的微小粒徑和藥物的高度分散，改善難溶性藥物的水溶性和溶出速率，提高藥物的生物利用率。

制備聚合物微納米顆?；蛭⑶虻膫鹘y(tǒng)方法有噴霧干燥、乳液溶劑揮發(fā)和凝聚的方法，這些方法存在明顯的不足之處，例如有毒溶劑或助劑的使用難以從微球中完全去除，影響微球的生物相容性，難以調(diào)控微球的尺寸和尺寸分布等。為了克服傳統(tǒng)方法的不足，文獻(xiàn)上已報(bào)導(dǎo)采用沉淀和溶劑揮發(fā)的方法來制備生物可降解的聚合物微納米微球。據(jù)文獻(xiàn)(Chen X等，Biomacromolecules 2005,6,2843-2850)報(bào)導(dǎo)，將立構(gòu)多嵌段的聚乳酸(PLA)溶解在良溶劑中，然后再在非溶劑中置換，制備了花型和圓盤形的聚合物顆粒，顆粒的粒徑分布較均勻，在幾十納米到幾微米之間。論文(Zhou Z等，Macromol.Mater.Eng.2016,301,274-278)通過改變?nèi)軇┑念愋?、聚合物溶液的濃度和干燥方法，制備了花瓣形的PLA納米片，該方法可很好調(diào)控材料的孔隙率和機(jī)械性能。

PLA可基于生物質(zhì)資源制備，具有許多優(yōu)異的性能，比如生物可降解性、生物相容性和環(huán)境友好性。由于PLA的單體具有旋光異構(gòu)性，故PLA有兩種對映異構(gòu)體，即聚左旋乳酸(PLLA)和聚右旋乳酸(PDLA)，其中PLLA更為常見。PLLA的熔點(diǎn)為170℃，結(jié)晶速率較慢。當(dāng)PLLA和PDLA共混時(shí)，可形成立構(gòu)復(fù)合結(jié)晶，熔點(diǎn)高達(dá)230℃，比單獨(dú)的PLLA或PDLA的同質(zhì)結(jié)晶高約50℃。此外，對PLA末端官能化能調(diào)控聚合物的結(jié)晶，從而改善聚合物的熱性能和形貌。論文(Biela T等，Macromolecules 2015,48,2994-3004)在PLA的末端用2-脲基-4[1H]-嘧啶酮(UPy)或尿嘧啶修飾，將PLLA和PDLA等比例共混，用N-甲基吡咯烷酮溶解，甲醇沉淀，制備了球形顆粒。當(dāng)利用UPy雙端修飾時(shí)，用三氯甲烷溶解，甲醇沉淀，得到纖維狀的形貌結(jié)構(gòu)。因此，將PLA的立構(gòu)復(fù)合結(jié)晶和端基修飾結(jié)合，可以得到不同結(jié)構(gòu)和性能的微納米材料。

但是，大多數(shù)傳統(tǒng)沉淀和溶劑揮發(fā)的方法只能得到球形顆粒。在制備載藥微球時(shí)，傳統(tǒng)制備方法需要加入乳化劑。論文(Teng等，J.Appl.Polym.Sci.2015,132,42213-42219)在制備裝載利福平藥物的星型聚乳酸微球時(shí)，加入了2.5％的聚乙烯醇作為乳化劑，最終通過沉淀和洗滌的方法移除聚乙烯醇乳化劑。論文(Zhang等，Polym.Bull.2012,68,27-36)在制備牛血清蛋白裝載的星型聚(乙交酯-co-丙交酯)無規(guī)共聚物微球時(shí)，也用聚乙烯醇作為乳化劑。但是乳化劑的使用使得難以從微球中完全去除，從而限制了生物可降解顆粒的廣泛應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種生物可降解超分子聚乳酸微球的制備方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是：

提供一種生物可降解超分子聚乳酸微球的制備方法，是將2-脲基-4-[1H]-嘧啶酮(UPy)端基修飾的聚乳酸溶解于良溶劑中，在攪拌條件下逐滴加入不良溶劑；持續(xù)攪拌24小時(shí)后，離心洗滌、收集固體沉淀；真空干燥后，得到生物可降解超分子聚乳酸微球；所述良溶劑是二氯甲烷、氯仿或四氫呋喃中的任意一種；不良溶劑是乙醇或甲醇。

本發(fā)明中，將2-脲基-4-[1H]-嘧啶酮(UPy)端基修飾的聚乳酸溶解于良溶劑中時(shí)，使聚乳酸溶液的濃度為1mg/mL。

本發(fā)明中，所述不良溶劑在溶劑總用量中所占的體積分?jǐn)?shù)為20％～90％。

本發(fā)明中，所述干燥是指在60℃下干燥6h。

本發(fā)明中，所述2-脲基-4-[1H]-嘧啶酮(UPy)端基修飾的聚乳酸的分子形式呈線性或三臂星形，其具體結(jié)構(gòu)式為：

線性聚乳酸：

三臂星形聚乳酸：

上述式中，

其中，n為40～890。

本發(fā)明中，所述聚乳酸的分子量在3～64kDa之間，是聚左旋乳酸、聚右旋乳酸或者兩者的混合物。

發(fā)明原理描述：

在溶劑置換中，結(jié)晶可以誘導(dǎo)不同微納米組裝結(jié)構(gòu)的形成，微納米組裝體的結(jié)構(gòu)與成核形式、結(jié)晶速率、結(jié)晶結(jié)構(gòu)有關(guān)。PLA有兩種結(jié)晶形式，兩種結(jié)晶的比例可通過混合比例調(diào)控，所以可利用兩種結(jié)晶形式不同的成核速率、結(jié)晶增長速率、鏈堆積形式制備不同形貌的生物可降解顆粒。另外，當(dāng)鏈段中引入可形成非共價(jià)鍵的超分子基團(tuán)時(shí)，可增加鏈間相互作用力和鏈纏結(jié)程度，從而改變?nèi)芤航Y(jié)晶中自組裝顆粒的大小和形貌。

本發(fā)明通過沉淀和溶劑揮發(fā)的方法制備PLA微球，在溶劑置換的過程中，通過液液相分離和聚合物結(jié)晶相結(jié)合的方式，可以得到不同形貌的聚乳酸微球，而且，通過控制不同立體異構(gòu)聚乳酸的共混，可以實(shí)現(xiàn)不同形貌的微球之間的轉(zhuǎn)變，顯著區(qū)別于傳統(tǒng)沉淀和溶劑揮發(fā)制備方法所能得到的球形顆粒。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明所述的PLA微球采用沉淀和溶劑揮發(fā)的方法制備，簡單易行，可實(shí)施性高。

(2)本發(fā)明利用液液相分離和聚合物結(jié)晶相結(jié)合的方法來調(diào)控聚合物微球的形貌，同時(shí)調(diào)控其結(jié)構(gòu)與性能，擴(kuò)大應(yīng)用范圍。

(3)本發(fā)明采用UPy的四重氫鍵來構(gòu)筑超分子聚合物，四重氫鍵作用力強(qiáng)，調(diào)控不同鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)PLA的鏈纏結(jié)程度，從而得到不同形貌的PLA微球。

(3)本發(fā)明所制備的材料的原料均來自生物質(zhì)可再生資源，使用后可完全降解，綠色環(huán)保，同時(shí)具有良好的生物相容性。

(4)本發(fā)明采用藥物和聚合物共沉淀的方法制備載藥顆粒，可以有效的避免乳化劑使用，從而使得聚合物納米顆?；蛭⑶蚓哂懈鼮閺V泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為實(shí)施例2制備的PLA顆粒的形貌特征。

圖2為實(shí)施例3制備的PLA顆粒的形貌特征。

圖3為實(shí)施例8制備的PLA顆粒的形貌特征。

圖4為實(shí)施例9制備的PLA顆粒的形貌特征。

圖5為對比例1制備的PLA顆粒的形貌特征。

圖6為對比例2制備的PLA顆粒的形貌特征。

圖7為實(shí)施例2、3和對比例1超分子PLA顆粒在磷酸緩沖液中的載藥釋放曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)的技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

本發(fā)明制備所使用試劑與藥品如下：L-丙交酯和D-丙交酯購自普拉克公司；L-丙交酯和D-丙交酯在乙酸乙酯中重結(jié)晶純化，備用；1,6-己二醇、三羥甲基丙烷和辛酸亞錫購自Sigma-Aldrich公司；1,6-二異氰酸酯購自萬華化學(xué)公司；2-氨基-4-羥基-6-甲基嘧啶和氮甲基吡咯烷酮購自J&K公司。

本發(fā)明所述異氰酸根末端官能化的2-脲基-4[1H]嘧啶酮(UPy-NCO)的結(jié)構(gòu)式為：

參照文獻(xiàn)(Meijer E W等，Science 1997,278,1601-1604)方法制備，具體步驟如下：將2-氨基-4-羥基-6-甲基嘧啶(10.0g)加入至500ml三口燒瓶中，65℃下抽真空0.5h，充氬氣保護(hù)，加入95.0g六亞甲基二異氰酸酯和3.2g氮甲基吡咯烷酮為催化劑，其中HDI摩爾數(shù)為2-氨基-4-羥基-6-甲基嘧啶摩爾數(shù)的7倍，催化劑含量為總反應(yīng)物質(zhì)量的3％。100℃下反應(yīng)16h后，將產(chǎn)物溶于三氯甲烷中，滴入體積比為6:1的正庚烷與異丙醚的混合液中(共700ml)，沉淀，過濾。將白色固體產(chǎn)物置于50℃真空烘箱中干燥10h，備用。

羥基末端官能化的線性和三臂星形PLLA和PDLA參照文獻(xiàn)(Pan P等，Cryst.GrowthDes.2016,16,1502-1511)方法制備，設(shè)計(jì)分子量為8kg/mol的三端羥基封端的三臂星形PLLA的具體制備步驟如下：將20g L-丙交酯、0.335g三羥甲基丙烷和0.12g辛酸亞錫干燥后加入燒瓶中，氬氣保護(hù)，在130℃條件下反應(yīng)5h，得到PLLA產(chǎn)品。將得到的粗產(chǎn)物于三氯甲烷中溶解，在無水乙醚和正己烷等體積混合的沉淀劑中沉淀除去未反應(yīng)的丙交酯，過濾，干燥得到聚合物。通過改變引發(fā)劑與丙交酯的質(zhì)量比，制備了具有不同分子量的聚合物。聚合物的分子量由核磁共振氫譜測定。本發(fā)明所使用雙端羥基封端的線性和三端羥基封端的三臂星形PLLA、PDLA的制備條件與分子量列于表1。表1：雙端羥基封端的線性和三端羥基封端的三臂星形PLLA、PDLA的制備條件與分子量

注：聚合物名稱中，2L、2D、3L、3D分別代表雙端羥基封端的線性PLLA、PDLA及三端羥基封端的三臂星形PLLA、PDLA，后綴數(shù)字表示聚合物從核磁所計(jì)算的分子量。

1)UPy端官能化PLLA和PDLA的制備

參照(Pan P等，Cryst.Growth Des.2016,16,1502-1511)方法，進(jìn)一步制備了UPy端基官能化的線性和三臂星形的PLLA和PDLA，具體方法為：將羥基末端官能化的線性或三臂星形PLLA或PDLA、異氰酸根末端官能化的UPy-NCO、辛酸亞錫和甲苯置于希丁克管中，氬氣保護(hù)下，在110℃反應(yīng)12小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機(jī)溶劑，然后加入至二氯甲烷中溶解，過濾。在室溫下使溶劑揮發(fā)，得到的固體物質(zhì)即為UPy端官能化的PLLA或PDLA。其中，UPy-NCO的摩爾量是羥基末端官能化的線性或三臂星形PLA的3倍，辛酸亞錫占總質(zhì)量的0.6％，甲苯質(zhì)量為PLLA或PDLA質(zhì)量的30倍。

NMR測試：利用核磁共振(Bruker公司，400MHz)測試聚合物的¹H NMR譜圖，進(jìn)而計(jì)算其數(shù)均分子量(M_n)。測試溫度為室溫，溶劑為氘代氯仿，化學(xué)位移(δ)由溶劑峰校正。分子量計(jì)算說明：對于PLA，通過比較端羥基相鄰的叔碳上的氫(δ＝4.3ppm)與主鏈中叔碳上的氫(δ＝5.1ppm)的峰面積比計(jì)算聚合度和分子量。

2)超分子PLA微球的制備

實(shí)施例1～9

在實(shí)施例1～9中，將UPy端基官能化的線性或三臂星形PLLA、PDLA按一定質(zhì)量比溶于二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃等良溶劑中，使聚合物溶液的濃度為1mg/mL。攪拌混合2h后，逐滴加入乙醇、甲醇等不良溶劑中，攪拌，不良溶劑所占的體積分?jǐn)?shù)為20％～90％，4h后滴完。然后攪拌24h后，離心洗滌，收集固體沉淀。將固體沉淀60℃下真空干燥6h后，得到生物可降解的超分子PLA微球。

在對比例1和2中，以羥基末端官能化的線性或三臂星形PLLA、PDLA或兩者的混合物為原料，利用相同的方法制備PLA顆粒。實(shí)施例1～9和對比例1～2中PLLA、PDLA配比、溶劑中不良溶劑所占體積分?jǐn)?shù)列于表2中。

形貌表征：采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM)表征。將干燥的聚乳酸顆粒粘附在導(dǎo)電碳膠上使用CorlzeisD Utral55型FESEM以5keV加速電壓進(jìn)行觀察。

PLA顆粒的載藥和藥物緩釋實(shí)驗(yàn)以抗癌藥物利福平為例，將10mg的利福平、100mg的UPy端基官能化的PLLA、PDLA混合物共同溶解于二氯甲烷中，聚合物的初始濃度為1mg/mL；2h后，逐滴加入無水乙醇，攪拌；乙醇所占的體積分?jǐn)?shù)為70％，4h后滴完。攪拌24h后，離心、洗滌，干燥后，得到生物可降解的聚乳酸載藥顆粒。

取2.5mg的PLA載藥顆粒溶于10mL的N，N-二甲基甲酰胺溶劑中，用紫外-可見光分光光度計(jì)測定溶液在340nm波長處的吸光度，基于標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算顆粒的載藥量。

PLA顆粒的酶降解實(shí)驗(yàn)：將2.0mg蛋白酶K、1.0mg疊氮化鈉和一定量用濾紙包好的PLA顆粒加入至10mL磷酸緩沖溶液(pH＝7.4,50mM)中，然后置于37℃的恒溫?fù)u床上使其緩慢降解，一定的時(shí)間間隔后，將PLA顆粒冷凍干燥，根據(jù)PLA顆粒的重量損失，從而計(jì)算降解率。

熱性能測試：使用DSC測試，氮?dú)鈿夥?。樣品?0℃/min從室溫升溫至180℃或者230℃。熱性能參數(shù)的計(jì)算方法如下：120℃至160℃間的吸熱峰為PLLA、PDLA同質(zhì)結(jié)晶的熔融峰，峰值溫度為同質(zhì)結(jié)晶的熔點(diǎn)，積分面積為同質(zhì)結(jié)晶熔融焓(ΔH_m,hc)。180℃至220℃間吸熱峰為PLLA/PDLA立體復(fù)合結(jié)晶的熔融峰，積分面積為立體復(fù)合結(jié)晶焓(ΔH_m,sc)。立體復(fù)合結(jié)晶的相對分?jǐn)?shù)(f_SC)由公式f_SC＝ΔH_m,sc/(ΔH_m,sc+ΔH_m,hc)計(jì)算得到。

表2為實(shí)施例1～9和對比例1～2中PLA顆粒的制備條件、形貌、粒徑、載藥量、降解率和熱性能參數(shù)。

表2：實(shí)施例1～9和對比例1～2中PLA顆粒的制備條件、形貌、粒徑、載藥量、降解率和熱性能參數(shù)

由表2和圖1可知，在實(shí)施例2中，超分子PLA顆粒為花瓣形形貌。而對比例1中的顆粒形貌不規(guī)整，說明超分子基團(tuán)的存在可促進(jìn)鏈纏結(jié)，從而形成蓬松的花瓣型結(jié)構(gòu)。實(shí)施例4也不能形成花瓣形結(jié)構(gòu)，主要是由于線形PLA的鏈纏結(jié)密度沒有三臂星形PLA鏈纏結(jié)密度高。當(dāng)PLLA和PDLA的共混質(zhì)量比為50/50時(shí)(如實(shí)施例3、5和對比例2)，均呈現(xiàn)出球形特征，主要是由于立體復(fù)合結(jié)晶的形成導(dǎo)致結(jié)晶速率加快，鏈堆積緊密，降低液液微相分離的尺寸，從而形成尺寸較小的球形顆粒。對比實(shí)施例1、2、6，改變良溶劑和劣溶劑的類型以及良溶劑所占的體積分?jǐn)?shù)，均能得到花瓣形結(jié)構(gòu)，表明良溶劑和劣溶劑的不同選擇不會(huì)影響顆粒的形成。

對比實(shí)施例3和對比例2，由圖1可知，實(shí)施例3的球形粒子尺寸較大，表面光滑度降低，主要是UPy超分子端基的存在增大了鏈纏結(jié)，容易形成較大的顆粒。實(shí)施例4表現(xiàn)為片狀結(jié)構(gòu)，不能形成花瓣形結(jié)構(gòu)。實(shí)施例6的形貌特征表明高分子量的PLA也能形成花瓣形結(jié)構(gòu)，但實(shí)施例7的結(jié)果表明高分子量的PLLA和PDLA等質(zhì)量共混時(shí)，不能形成球形粒子。

由表2可知，實(shí)施例8、9中改變了超分子PLLA和PDLA的共混比例，對比實(shí)施例2、8、9可知，通過改變超分子PLLA和PDLA的混合比例，可以實(shí)現(xiàn)聚合物顆粒從花瓣形到球形形貌的轉(zhuǎn)變。說明立構(gòu)復(fù)合結(jié)晶作用的增強(qiáng)，分子鏈的堆積更為緊密，同時(shí)結(jié)晶速率加快，更易形成球形顆粒。

PLA顆粒對包裹在顆粒內(nèi)的藥物具有緩釋效果。取2mg載藥PLA顆粒分散在5mLPBS緩沖溶液(pH＝7.4，50mM)中，待溶液分散均勻，將溶液轉(zhuǎn)移至透析袋中(截留分子量為3500)，對10mL PBS緩沖溶液(pH＝7.4，50mM)進(jìn)行透析。透析袋外的緩沖溶液經(jīng)一定的時(shí)間間隔進(jìn)行更換，同時(shí)利用紫外分光光度計(jì)測試緩沖溶液中的利福平濃度，進(jìn)而計(jì)算累計(jì)釋放量。圖2為實(shí)施例2～3和對比例1中PLA載藥顆粒的藥物釋放曲線。由圖2可知，對比實(shí)施例2、3的結(jié)果，隨著PLLA和PDLA共混比例趨向于50/50時(shí)，立構(gòu)復(fù)合結(jié)晶的含量升高，聚合物和藥物分子之間的作用增強(qiáng)，鏈堆積更為緊密，所以PLA顆粒的藥物裝載量逐漸增大，釋放的速率逐漸減慢。同時(shí)表3也說明了這一結(jié)果，對比實(shí)施例2、3、8、9可知，隨著PLLA和PDLA共混比例趨向于1/1時(shí)，PLA顆粒的藥物裝載量從0.34％增加至4.11％，降解率從41％降至25％。因此，UPy端基官能化的線性或三臂星形PLA顆?？捎米魉幬镝尫诺妮d體，并且通過調(diào)控PLA的端基修飾和PLA的結(jié)晶形式控制載藥顆粒的釋放行為。

最后，需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有很多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容中直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。