本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種利用生物酶催化技術(shù)制備熊去氧膽酸的方法及其制備用7β-類固醇脫氫酶。
背景技術(shù)：
：熊去氧膽酸是名貴中藥熊膽的主要有效成分，具有增加膽汁酸分泌、并使膽汁成分改變、有利于膽結(jié)石中的膽固醇逐漸溶解、降低膽汁中膽固醇及膽固醇脂等功效，主要用于治療膽石疾病。眾所周知，熊膽是一種非常稀缺的資源，原因在于其獲取的傳統(tǒng)途徑主要是依賴于人工養(yǎng)殖活熊取膽的方法。目前，這種周期長、收率低且不人道的傳統(tǒng)途徑逐漸被人工合成方法所取代。起初，熊去氧膽酸的人工合成方法多為化學(xué)法，并且被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。但是化學(xué)法存在操作條件苛刻、選擇性低、污染環(huán)境、使用大量有機(jī)溶劑、存在有機(jī)溶劑殘留、有毒有害等缺點(diǎn)。為了解決化學(xué)法存在的諸多缺點(diǎn)，人們另辟蹊徑，尋找更好的生產(chǎn)途徑。中國發(fā)明專利申請CN105368828A公開了一種采用全細(xì)胞催化制備3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸熊去氧膽酸的方法，但是此種方法需進(jìn)行細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)，存在反應(yīng)時(shí)間長、操作繁瑣、產(chǎn)物復(fù)雜等缺點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種熊去氧膽酸的新的制備方法，以解決上述
背景技術(shù)：
中提到的現(xiàn)有制備方法所存在的有機(jī)溶劑殘留、條件苛刻、反應(yīng)時(shí)間長、操作繁瑣、污染環(huán)境等缺點(diǎn)，本發(fā)明同時(shí)提供了該新制備方法適用的生物酶。為實(shí)現(xiàn)上述目的，發(fā)明人經(jīng)過長期大量的實(shí)驗(yàn)摸索，在經(jīng)歷上百次的失敗嘗試之后，終于篩選出適用于細(xì)胞外生物催化制備熊去氧膽酸的生物酶，并在此序列基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，獲得了活性提高和去除底物抑制的突變體酶，從而開發(fā)出一種新的制備熊去氧膽酸的方法，其特征在于：以3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸為底物，在NADP、葡萄糖、葡萄糖脫氫酶以及緩沖溶液存在的條件下，用7β-類固醇脫氫酶催化3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸制備熊去氧膽酸，所述7β-類固醇脫氫酶來源于Turneriellaparva，所述葡萄糖脫氫酶來源于巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium，其基因序列如SEQIDNO：3所示，在整個(gè)催化反應(yīng)體系中，所述底物的濃度為50～100mg/mL，所述NADP的濃度為0.1～0.25mg/mL，所述葡萄糖的濃度為30～50mg/mL。上述方法中所使用的兩種酶的具體存在形式包括液態(tài)酶液、固態(tài)以及各種固定化酶，可以是未經(jīng)純化的粗酶形式，也可以是經(jīng)部分純化或完全純化的形式。優(yōu)選地，控制所述催化過程在溫度為25～35℃，pH值為7.5～8.5的條件下進(jìn)行。優(yōu)選地，所述緩沖溶液為50～100mM磷酸鉀緩沖液。優(yōu)選地，上述制備方法還包括如下提純步驟：待所述催化過程反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)節(jié)pH值為10.5～12.5，除去不溶物，再調(diào)節(jié)pH值為1.0～2.0，水浴50-60℃，攪拌20～30min，待冷卻后過濾、經(jīng)水洗三次后真空干燥即得熊去氧膽酸的成品。更優(yōu)選地，上述制備方法還包括如下精制步驟：將獲得的熊去氧膽酸的成品用10-20倍無水乙醇50-60℃水浴條件下攪拌回流0.5-1h，熱過濾，取濾液進(jìn)行真空減壓濃縮至1/4-1/5體積，再加入5-10倍純水?dāng)嚢?h進(jìn)行結(jié)晶，過濾，將濾餅真空干燥，即得熊去氧膽酸的精制品。優(yōu)選地，上述制備方法中所使用的7β-類固醇脫氫酶為如下（a）或（b）的蛋白質(zhì)：（a）其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的蛋白質(zhì)，（b）在（a）限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸并且在NADP存在下以3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸為底物具有比氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的親本高的7β-類固醇脫氫酶催化活性的由（a）衍生的蛋白質(zhì)。更優(yōu)選地，所述7β-類固醇脫氫酶與如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列相比在選自至少一個(gè)下述位點(diǎn)處具有至少一個(gè)突變：第15位、第16位、第38位、第39位、第154位、第158位、第193位、以及第195位。更優(yōu)選地，所述7β-類固醇脫氫酶具有至少一個(gè)下述突變：G15A、S16K、V38R、V39R、Y154W、K158E、R193Q以及A195I。本發(fā)明還提供了一種7β-類固醇脫氫酶，其特征在于：所述7β-類固醇脫氫酶來源于Turneriellaparva，用于催化3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸制備熊去氧膽酸，所述7β-類固醇脫氫酶為如下（a）或（b）的蛋白質(zhì)：（a）其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的蛋白質(zhì)，（b）在（a）限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸并且在NADP存在下以3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸為底物具有比氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的親本高的7β-類固醇脫氫酶催化活性的由（a）衍生的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述7β-類固醇脫氫酶與如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列相比在選自至少一個(gè)下述位點(diǎn)處具有至少一個(gè)突變：第15位、第16位、第38位、第39位、第154位、第158位、第193位、以及第195位。優(yōu)選地，所述7β-類固醇脫氫酶具有至少一個(gè)下述突變：G15A、S16K、V38R、V39R、Y154W、K158E、R193Q以及A195I。有益效果：1、與現(xiàn)有的熊去氧膽酸的制備方法相比，本發(fā)明提供的方法具有操作簡單、反應(yīng)條件溫和易控、反應(yīng)時(shí)間短、不使用有機(jī)溶劑、無毒無污染且成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)實(shí)踐證明，本發(fā)明提供的方法的反應(yīng)時(shí)長僅需8～15小時(shí)，其對底物的轉(zhuǎn)化率高達(dá)99.8%以上，所獲得的產(chǎn)品的含量在98.5%以上。2、本發(fā)明篩選出了適用于細(xì)胞外生物催化制備熊去氧膽酸的7β-類固醇脫氫酶基因，并在此序列基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，獲得了活性提高和去除底物抑制的突變體酶，這些突變體酶表現(xiàn)出高的選擇性使得該方法不會(huì)形成副產(chǎn)物，這些突變體酶的高催化活性和高專一性使得熊去氧膽酸酶法大規(guī)模生產(chǎn)的成本更低，具有較高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以下實(shí)施例是對本發(fā)明的解釋，本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例，實(shí)施例中未注明具體條件者，按常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。本發(fā)明提供的熊去氧膽酸的制備方法的具體實(shí)施過程如下：將3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸懸浮于50～100mM磷酸鉀緩沖液（pH8.0）中，用10M的NaOH調(diào)節(jié)pH到8.0，再加入終濃度為30～50mg/mL的葡萄糖并用10M的NaOH調(diào)節(jié)pH到7.8～8.0，加入7β-類固醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶，最后加入終濃度為0.1～0.25mg/mL的NADP，底物終濃度為50～100mg/mL，反應(yīng)在溫度25～35℃、200～400rpm和pH7.5～8.5進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為8～15h。每隔一定時(shí)間取反應(yīng)液用流動(dòng)相稀釋50～100倍，微孔過濾后進(jìn)樣進(jìn)行液相分析。液相檢測使用PhenomenxGemini5μmNX-C18110A250×4.6mm為分析柱，流動(dòng)相為乙腈:緩沖溶液（取磷酸二氫鈉0.78g,溶解1L水中，用磷酸調(diào)pH值為3，即可）:甲醇=30:37:40，用0.45um濾膜過濾后備用。柱溫為40℃，示差檢測器（RID），流速為0.8mL/min。待催化過程反應(yīng)結(jié)束后，在快速攪拌的情況下加入5～10M的NaOH調(diào)整反應(yīng)液的pH值為10.5～12.5，過濾取濾液，濾液滴加鹽酸至pH值為1.0～2.0，水浴50-60℃，攪拌20～30min，待冷卻后過濾、經(jīng)水洗三次后真空干燥即得熊去氧膽酸的成品。再將成品用10-20倍無水乙醇50-60℃水浴條件下攪拌回流0.5-1h，熱過濾，取濾液進(jìn)行真空減壓濃縮至1/4-1/5體積，再加入5-10倍純水?dāng)嚢?h進(jìn)行結(jié)晶，過濾，將濾餅真空干燥過夜，即得熊去氧膽酸的精制品。上述方法中所使用的兩種酶的具體存在形式包括液態(tài)酶、固態(tài)酶以及各種固定化酶，可以是未經(jīng)純化的粗酶形式，也可以是經(jīng)部分純化或完全純化的形式。實(shí)施例1含有親本基因的共表達(dá)重組質(zhì)粒pET22b-BH1-GDH的制備將來源于Turneriellaparva的7β-類固醇脫氫酶基因BH1和來源于巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）的葡萄糖脫氫酶基因GDH分別利用引物對5'CGCCATATGATGAAAGACCTCAGAAACAAAG3'和5'CCGGAATTCTTAACCAACCCTTTGCGTCA3'以及引物對5'CCGGAATTCAAGGAGATATACATATGAAGATCTTCGCGTACGGTA3'和5'CCGCTCGAGTTAATATTCCACCGCAATGC3'通過PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得PCR產(chǎn)物后經(jīng)過酶切處理，同時(shí)插入到表達(dá)載體pET22b（+）的NdeI和EcoRI位點(diǎn)以及EcoRI位點(diǎn)和XhoI位點(diǎn)，得到共表達(dá)重組質(zhì)粒pET22b-BH1-GDH。經(jīng)DNA測序，確定該被克隆的親本7β-類固醇脫氫酶的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；確定該被克隆的親本葡萄糖脫氫酶的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，其氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。實(shí)施例2含有7β-類固醇脫氫酶突變體的共表達(dá)重組質(zhì)粒的制備通過反向PCR技術(shù)對7β-類固醇脫氫酶親本進(jìn)行定點(diǎn)突變，在突變位置通過設(shè)計(jì)反向引物，利用上下游突變引物擴(kuò)增目的片段，并在引物上引入相應(yīng)突變，以重組質(zhì)粒pET22b-BH1-GDH作為模板進(jìn)行反向PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI酶消化模板處理后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta(de3)，經(jīng)過Amp的篩選后挑取菌落送測序。突變位點(diǎn)及引物設(shè)計(jì)如表1所示。PCR體系為：TaKaRaEXTaqHS0.25ul；10×ExTaqBuffer5ul；模板質(zhì)粒1ul；dNTP（2.5mMeach）4ul；上游引物1ul;下游引物1ul；無菌水upto50ul。PCR程序?yàn)椋菏紫?8℃2min；然后98℃10s，50-65℃30s，72℃7min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。表1引物名稱引物序列（5′至3′）G15A+S16K上游GCAGCGAAGGGCATCGGCG15A+S16K下游GCCGATGCCCTTCGCTGCV38R+V39R上游GCCGATAGGAGGCAAAAAV38R+V39R下游TTTTTGCCTCCTATCGGCY154W上游GGTGTCGTGTGGGGTACACTGY154W下游CAGTGTACCCCACACGACACCK158E上游AACTGCTCAGAATATGCAGTCK158E下游GACTGCATATTCTGAGCAGTTR193Q+A195I上游ATCATACAGAATATCAAGGTGR193Q+A195I下游CACCTTGATATTCTGTATGAT實(shí)施例3酶液的制備將實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的親本和突變體共表達(dá)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta(de3)，再將獲得的重組大腸桿菌接種在小體積的LB培養(yǎng)基（含有100μg/mL的Amp），30～37℃過夜培養(yǎng)后，以1～5%的接種量轉(zhuǎn)接到一定體積的LB培養(yǎng)基中（含有100μg/mL的Amp），在30～37℃繼續(xù)培養(yǎng)OD600達(dá)到0.6～1.0加入終濃度為0.1mM～1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在20～37℃誘導(dǎo)表達(dá)8～20h后離心收集菌體。發(fā)酵菌體懸浮于一定體積的50～100mM的磷酸鉀緩沖液（pH8.0）中并超聲波破胞，離心即得含有葡萄糖脫氫酶與7β-類固醇脫氫酶親本或者與7β-類固醇脫氫酶突變體的粗酶液，可用于酶活力的測定以及熊去氧膽酸的生物催化制備。實(shí)施例4酶活力的測定7β-類固醇脫氫酶的酶活測定方法：以3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸為底物，在一個(gè)3mL的反應(yīng)體系中加入10uL的150mM3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸，100uL的稀釋酶液，NADP+終濃度為0.2mM，在pH8.0和25℃反應(yīng)一定時(shí)間，在340nm處測定吸光值增加。葡萄糖脫氫酶的酶活測定方法：以葡萄糖為底物，在一個(gè)3mL的反應(yīng)體系中加入100uL的50mM葡萄糖，100uL的稀釋酶液，NADPH終濃度為0.2mM，在pH8.0和25℃反應(yīng)一定時(shí)間，在340nm處測定吸光值減少。酶活力的測定結(jié)果如表2所示，其中GDH為葡萄糖脫氫酶，7β-HSDH為7β-類固醇脫氫酶。表2類型酶活力U/ml溫度穩(wěn)定性pH穩(wěn)定性GDH286.5±25.34-45℃6.0-9.07β-HSDH親本254.8±15.24-50℃6.0-9.0G15A+S16K352.6±12.24-45℃6.0-9.0V38R+V39R412.8±14.54-45℃6.0-9.0Y154W268.7±18.74-50℃6.5-9.0K158E355.6±21.44-50℃6.5-9.5R193Q+A195I298.7±25.44-50℃6.0-9.0實(shí)施例5熊去氧膽酸的制備參照前述熊去氧膽酸的制備方法的具體實(shí)施過程，使用實(shí)施例3制備的粗酶液，酶液的投入量以酶液的重量占整個(gè)反應(yīng)體系的體積計(jì)，控制底物3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸的終濃度為100mg/mL，其余各具體參數(shù)如表3所示。反應(yīng)8～15h后測得，底物轉(zhuǎn)化率在99.8%以上，成品含量在98.5%以上，收率為85～95%。表3類型酶液投入量（W/V）葡萄糖投入量NADP+投入量反應(yīng)溫度反應(yīng)pH親本30%50mg/ml0.15mg/ml25℃8.0G15A+S16K22%45mg/ml0.12mg/ml30℃8.0V38R+V39R20%40mg/ml0.1mg/ml30℃8.5Y154W30%50mg/ml0.15mg/ml25℃8.0K158E30%45mg/ml0.125mg/ml30℃7.5R193Q+A195I30%45mg/ml0.125mg/ml30℃8.0實(shí)施例6熊去氧膽酸的制備總體系1L，取50g含量為99%的3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸，懸浮于100mM的磷酸鉀緩沖液（pH8.0）,用10MNaOH的調(diào)節(jié)pH到8.0后加入終濃度50g/L的葡萄糖，并依次加入0.1g7β-類固醇脫氫酶凍干粉（K158E突變體酶）和0.07g葡萄糖脫氫酶凍干粉，最后加入終濃度為0.15g/L的NADP，底物終濃度為50g/L。在25℃、250rpm和pH8.0左右進(jìn)行反應(yīng)10h，轉(zhuǎn)化率達(dá)99.8%。反應(yīng)結(jié)束后，在快速攪拌的情況下加入10MNaOH至pH為12.5，過濾取濾液，濾液滴加鹽酸至pH值為1.0，水浴55℃，攪拌30min，待冷卻后過濾、經(jīng)水洗三次后真空干燥得到熊去氧膽酸的成品56.2g。再將得到的熊去氧膽酸的成品用800ml無水乙醇溶解，60℃水浴條件下攪拌1h，熱過濾，并用少量乙醇洗滌濾餅，取濾液進(jìn)行減壓濃縮至200ml，再加入2L純水?dāng)嚢?h，過濾，并用水洗濾餅三次，所得濾餅通過真空干燥后得到熊去氧膽酸的精制品50.9g。SEQUENCELISTING<110>眉山市新功生物科技有限公司、邦泰生物工程（深圳）有限公司<120>一種熊去氧膽酸的制備方法及其制備用酶3<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>816<212>DNA<213>Turneriellaparva<400>1atgaaagacctcagaaacaaagtcgccgttgtgacgggtgcaggctcgggcatcggccgg60cagctcgcgcaccagcttgcaaaagctggcgctgagctggtgctcgccgatgtggtgcaa120aaaaatcttgaagccactgtcggtgaactctacgggcagacgaagatcacatcgcacgtt180gtcgacgtcgcgaaacgcgatcaggtctatgcgctcgccgacgctgcggtcaaggcacat240ggtcaggtcgatattgttatcaacaatgcgggcgttaccgtactgcagccactcgaccag300gtgagctacgaagacttcgagtgggtgatgaacgtgaacttctggggtgtcgtgtacggt360acactggcgtttctgccacacctcaagacccggccagaggcgtcggttgtcaacatcagt420agcgtgaatggcttcgtgcctttcccgaataacgggccgtacaactgctcaaaatatgca480gtctatggtttcaacgaaacactacaccaggaactcgcaggctcgcctgttgtcgtgact540tcggtgcatcccggtggcatcaagacgaatatcatacgcaatgccaaggtgcacgcatcg600cccggtggcaatgacaaggcgcacatcacctcgcgcttcgacagcatcgcgagcacatcg660gccgaagacgcagcgaaggcaattctcggcgcagtaaagaagaaacagaagaagctgctg720atcggtctcgatgcgcacgcgatggatcttgccaaaagactcatgccagaagaattcacg780agcctggtcggcatgctgacgcaaagggttggttaa816<210>2<211>271<212>PRT<213>Turneriellaparva<400>2MetLysAspLeuArgAsnLysValAlaValValThrGlyAlaGlySer151015GlyIleGlyArgGlnLeuAlaHisGlnLeuAlaLysAlaGlyAlaGlu202530LeuValLeuAlaAspValValGlnLysAsnLeuGluAlaThrValGly354045GluLeuTyrGlyGlnThrLysIleThrSerHisValValAspValAla505560LysArgAspGlnValTyrAlaLeuAlaAspAlaAlaValLysAlaHis65707580GlyGlnValAspIleValIleAsnAsnAlaGlyValThrValLeuGln859095ProLeuAspGlnValSerTyrGluAspPheGluTrpValMetAsnVal100105110AsnPheTrpGlyValValTyrGlyThrLeuAlaPheLeuProHisLeu115120125LysThrArgProGluAlaSerValValAsnIleSerSerValAsnGly130135140PheValProPheProAsnAsnGlyProTyrAsnCysSerLysTyrAla145150155160ValTyrGlyPheAsnGluThrLeuHisGlnGluLeuAlaGlySerPro165170175ValValValThrSerValHisProGlyGlyIleLysThrAsnIleIle180185190ArgAsnAlaLysValHisAlaSerProGlyGlyAsnAspLysAlaHis195200205IleThrSerArgPheAspSerIleAlaSerThrSerAlaGluAspAla210215220AlaLysAlaIleLeuGlyAlaValLysLysLysGlnLysLysLeuLeu225230235240IleGlyLeuAspAlaHisAlaMetAspLeuAlaLysArgLeuMetPro245250255GluGluPheThrSerLeuValGlyMetLeuThrGlnArgValGly260265270<210>3<211>786<212>DNA<213>巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）<400>3atgtatacagatttaaaagataaagtagtagttgtaacaggcggatcaaaaggattgggt60cgcgcaatggccgttcgttttggtcaagagcagtcaaaagtggttgtaaactaccgcagc120aatgaagaagaagcgctagaagtaaaaaaagaaattgaacaagctggcggccaagcaatt180attgttcgaggcgacgtaacaaaagaggaagacgttgtgaatcttgtagagacagctgtt240aaagagtttggcacattagacgttatgattaacaatgctggtgttgaaaacccggttcct300tcacatgaattatcgttagaaaactggaatcaagtaatcgatacaaacttaacaggcgcg360tttttaggaagccgcgaagcgattaaatattttgttgaaaatgatattaaaggaaacgtt420attaacatgtccagcgttcacgagatgattccttggccactatttgttcactatgcagca480agtaaaggcggtatgaaactaatgacagaaacattggctcttgaatatgcgccaaaaggt540atccgcgtaaataacattggaccaggcgcgatcgatacgccaatcaacgctgaaaaattc600gcagatccggaacagcgtgcagacgtagaaagcatgattccaatgggctacatcggcaac660ccggaagaaattgcatcagttgcagcattcttagcatcgtcacaagcaagctacgtaaca720ggtattacactatttgctgatggcggtatgacaaaatatccttctttccaaacgggaaga780ggctaa786<210>4<211>261<212>PRT<213>巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）<400>4MetTyrThrAspLeuLysAspLysValValValValThrGlyGlySer151015LysGlyLeuGlyArgAlaMetAlaValArgPheGlyGlnGluGlnSer202530LysValValValAsnTyrArgSerAsnGluGluGluAlaLeuGluVal354045LysLysGluIleGluGlnAlaGlyGlyGlnAlaIleIleValArgGly505560AspValThrLysGluGluAspValValAsnLeuValGluThrAlaVal65707580LysGluPheGlyThrLeuAspValMetIleAsnAsnAlaGlyValGlu859095AsnProValProSerHisGluLeuSerLeuGluAsnTrpAsnGlnVal100105110IleAspThrAsnLeuThrGlyAlaPheLeuGlySerArgGluAlaIle115120125LysTyrPheValGluAsnAspIleLysGlyAsnValIleAsnMetSer130135140SerValHisGluMetIleProTrpProLeuPheValHisTyrAlaAla145150155160SerLysGlyGlyMetLysLeuMetThrGluThrLeuAlaLeuGluTyr165170175AlaProLysGlyIleArgValAsnAsnIleGlyProGlyAlaIleAsp180185190ThrProIleAsnAlaGluLysPheAlaAspProGluGlnArgAlaAsp195200205ValGluSerMetIleProMetGlyTyrIleGlyAsnProGluGluIle210215220AlaSerValAlaAlaPheLeuAlaSerSerGlnAlaSerTyrValThr225230235240GlyIleThrLeuPheAlaAspGlyGlyMetThrLysTyrProSerPhe245250255GlnThrGlyArgGly260當(dāng)前第1頁1 2 3