本發(fā)明涉及免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種呋喃妥因代謝物ahd衍生化半抗原、人工抗原的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

呋喃類是人工合成的一類共有5-硝基呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的抗生素，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、部分真菌都具有抗菌效果。因價(jià)格低廉，被廣泛地應(yīng)用在畜禽和魚類養(yǎng)殖中，用于治療由沙門氏桿菌、大腸桿菌引起的腸炎，球蟲病等，并且常作為畜牧動物以及水產(chǎn)魚蝦類的生長促進(jìn)劑被添入飼料中。硝基呋喃類主要包括：呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮。但在食品安全中，呋喃妥因的大量或連續(xù)使用不僅對養(yǎng)殖動物有毒性作用，而且具有致癌、致畸、致突變作用，其代謝物還對人類健康有惡性影響。因此，許多國家已經(jīng)明令禁止在飼養(yǎng)動物源性食品過程中使用呋喃妥因，并規(guī)定了在動物源性食品中的檢驗(yàn)檢疫標(biāo)準(zhǔn)。

目前用于檢測呋喃妥因及其代謝物的方法主要有傳統(tǒng)的檢測方法，如分光光度法、高效液相色譜法及其聯(lián)用技術(shù)等，以上方法雖然可以精確定量，但由于設(shè)備儀器昂貴，檢測時(shí)間長，且需專業(yè)人員操作，因此無法實(shí)現(xiàn)真正意義上的現(xiàn)場檢測；以及免疫學(xué)檢測技術(shù)，此方法具有高特異性和高選擇性的特點(diǎn)，非常適用于復(fù)雜基質(zhì)痕量組分的分離或檢測，隨著學(xué)科間的相互滲透，其檢測方法層出不窮，應(yīng)用范圍亦日益擴(kuò)大。與傳統(tǒng)檢測方法相比，免疫學(xué)檢測技術(shù)具有經(jīng)濟(jì)、快速、技術(shù)要點(diǎn)低、操作簡便等特點(diǎn)。免疫分析檢測技術(shù)是近年來在環(huán)境及食品檢測等領(lǐng)域開發(fā)出來的一種新型快速準(zhǔn)確檢測方法，現(xiàn)已逐漸成為世界各國有毒有害殘留物快速篩選檢測的主要方法之一，也為呋喃妥因的檢測提供了新的途徑。

雖然呋喃妥因代謝物本身具有活性基團(tuán)，但由于其分子量較小，空間結(jié)構(gòu)不突出，直接制備的人工抗原存在靈敏度低的重大不足，無法滿足現(xiàn)有市場的需求。因此需先通過化學(xué)方法設(shè)計(jì)出其半抗原，再進(jìn)一步與載體蛋白結(jié)合獲得具有免疫原性的完全抗原。

在專利公告號為“cn200910085648.2”的專利文件中，其檢測的目標(biāo)物為呋喃唑酮原料藥，但由于呋喃唑酮進(jìn)入動物體內(nèi)后會代謝為ahd，而ahd又對人體有巨大的傷害，因此只檢測呋喃唑酮原料藥存在重大缺陷，無法滿足市場要求。

在專利公告號為“cn200810019047.7，cn201210049810.7，cn201210098138.0”的專利文件中，其設(shè)計(jì)的半抗原結(jié)構(gòu)為傳統(tǒng)的4-cp衍生物結(jié)構(gòu)，均無法保留其待測目標(biāo)物的硝基端，使得半抗原、抗原制備獲得的抗體均存在特異性差、親和力低等不足。

在專利公告號為“cn201410593519.5”的專利文件中，其設(shè)計(jì)的半抗原結(jié)構(gòu)無法保留硝基端，而且半抗原與ahd之間是通過磺酰胺鍵連接，與苯環(huán)不共軛，使半抗原的電子云密度與檢測的目標(biāo)物差異大，降低了靈敏度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服傳統(tǒng)的ahd半抗原無法完整保留競爭物特征結(jié)構(gòu)的缺陷，提供一種呋喃妥因代謝物ahd衍生化半抗原、人工抗原的制備方法及其應(yīng)用，其可保留競爭物硝基端的半抗原，人工抗原，提高競爭物的特異性。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供技術(shù)如下：一種呋喃妥因代謝物的半抗原，為如下結(jié)構(gòu)式ⅲ：

本發(fā)明解決該技術(shù)問題所采用的另一技術(shù)方案是，一種呋喃妥因代謝物的半抗原的制作方法，步驟如下：

(a)將化合物ⅰ溶解于乙醇中，所得溶液通過添加6mol/l的氫氧化鋰溶液將ph值調(diào)至10-11，反應(yīng)獲得化合物ⅱ；

所述化合物ⅰ的結(jié)構(gòu)式如下：

所述化合物ⅱ的結(jié)構(gòu)式如下：

(b)將所述化合物ⅱ與呋喃妥因代謝物在甲醇條件下反應(yīng)，既得所述呋喃妥因代謝物的半抗原；其為如下結(jié)構(gòu)式ⅲ：

本發(fā)明解決該技術(shù)問題所采用的另一技術(shù)方案是，一種呋喃妥因代謝物的半抗原的制作方法，步驟如下：

(a’)將化合物ⅰ溶于乙醇中，所得溶液通過加入6mol/l的氫氧化鋰溶液將ph值調(diào)至10-12，室溫反應(yīng)15～26h，加入純化水，所得溶液通過1m的稀鹽酸調(diào)將ph值調(diào)至4-5，過濾得到化合物ⅱ，所述化合物ⅰ反應(yīng)生成所述化合物ⅱ的過程如下：

(b’)將所述化合物ⅱ溶解于甲醇中，加1.2-1.5摩爾當(dāng)量的呋喃妥因代謝物ahd，于60～70℃反應(yīng)2h，反應(yīng)完畢，過濾，既得所述呋喃妥因代謝物的半抗原，所述半抗原的結(jié)構(gòu)式ⅲ及合成路線如下：

本發(fā)明解決該技術(shù)問題所采用的另一技術(shù)方案是，一種呋喃妥因代謝物的人工抗原，是載體蛋白和所述的呋喃妥因代謝物的半抗原偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)式iv為：

本發(fā)明解決該技術(shù)問題所采用的另一技術(shù)方案是，一種呋喃妥因代謝物的人工抗原的制備方法，步驟如下：

(1)取所述呋喃妥因代謝物的半抗原，溶解于二甲基甲酰胺(dmf)中，攪拌充分后，加入碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，所述半抗原、碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺的重量比為5：4：3，室溫下攪拌4-8h，即得半抗原活化酯；

(2)稱取載體蛋白，所述載體蛋白與所述半抗原的摩爾當(dāng)量比為30：1，使所述載體蛋白充分溶解在0.01mol/l的pbs溶液中，形成載體蛋白溶液，在攪拌下將所述半抗原活化酯逐滴緩慢滴加至所述載蛋白溶液中，并在室溫下攪拌16-24h；

(3)將步驟(2)所得溶液在0.01mol/l的pbs溶液室溫透析3天，每天換3次透析液；

(4)分裝，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

其中，所述載體蛋白為牛血清白蛋白(bsa)，卵清蛋白(ova)，人血清白蛋白(has)或血藍(lán)蛋白(klh)中的任意一種。

本發(fā)明解決該技術(shù)問題所采用的另一技術(shù)方案是，一致呋喃妥因代謝物的單克隆抗體的制備方法，步驟如下：

(i)以呋喃妥因代謝物的人工抗原為免疫原，與等體積弗氏佐劑乳化后，免疫balb/c小鼠，每只鼠免疫劑量為50～100μg，免疫間隔3周，免疫3次；

(ii)采步驟(i)處理后的小鼠尾部靜脈血檢測血清效價(jià)，如抗體效價(jià)不達(dá)60000，需加強(qiáng)免疫，待抗體效價(jià)不再升高后，以100μg免疫原進(jìn)行皮下加強(qiáng)免疫，5天后取小鼠的脾細(xì)胞與sp20細(xì)胞融合；

(iii)融合后的細(xì)胞在hat培養(yǎng)基中篩選，5天后以完全培養(yǎng)基替換成hat培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；

(iv)用elisa對步驟(iii)處理后的細(xì)胞上清進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果為強(qiáng)陽性的孔內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋法克隆培養(yǎng)，經(jīng)3次克隆培養(yǎng)檢測后，均呈陽性的孔內(nèi)細(xì)胞即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；

(v)將所述雜交瘤細(xì)胞放大培養(yǎng)后，接種至小鼠腹腔，產(chǎn)生含抗體的腹水，用辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水，即得。

所述制備方法可得到高純度、高特異性的單克隆抗體，所述單克隆抗體在檢測水產(chǎn)品中呋喃妥因代謝物殘留分析中應(yīng)用。

本發(fā)明解決該技術(shù)問題所采用的另一技術(shù)方案是，呋喃妥因代謝物的人工抗原和呋喃妥因代謝物的單克隆抗體在檢測呋喃妥因代謝物ahd中的應(yīng)用，將所述的呋喃妥因代謝物的人工抗原作為包被原包被在酶標(biāo)板上，將所述的呋喃妥因代謝物的單克隆抗體加入微孔板中；采用競爭法檢測待檢樣本中呋喃妥因代謝物ahd的含量。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下積極效果：傳統(tǒng)方案的ahd半抗原結(jié)構(gòu)均無法保留待測物的硝基端，使得半抗原、抗原制備獲得的抗體均存在特異性差、親和力低等不足。本發(fā)明中提供了一種新型ahd衍生物半抗原，以及基于該半抗原制備的一種人工抗原，闡述了兩者的制備方法與應(yīng)用。其思路是將ahd衍生化，獲得具有活性基團(tuán)和雙鍵剛性支撐手臂的衍生物，同時(shí)還完整的保留了ahd衍生物的特征結(jié)構(gòu)，對其電子云密度無影響，同時(shí)為了增強(qiáng)半抗原的免疫原性制備出高質(zhì)量的抗體，該抗體可以特異性識別ahd衍生物。

該思路的有益效果體現(xiàn)在：(1)引入具有剛性支撐作用的雙鍵手臂，使得ahd的結(jié)構(gòu)特征明顯增強(qiáng)，利于決定簇的良好呈現(xiàn)；(2)制備的半抗原完整的保留了ahd衍生物的特征結(jié)構(gòu)，對其電子云密度無影響，使得小分子半抗原的免疫原性明顯增強(qiáng)，有利于刺激動物免疫應(yīng)答產(chǎn)生特異性更強(qiáng)、靈敏度更高的抗體；(3)本發(fā)明提供的ahd的快速檢測方法最低檢測限可達(dá)0.05ng/g。

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的呋喃妥因代謝物的半抗原的合成路線。

圖2是本實(shí)施例1中化合物ⅱ的esi-ms圖譜。

圖3是本實(shí)施例1中化合物ⅱ的核磁共振氫譜圖譜。

圖4是本實(shí)施例1中呋喃妥因代謝物的半抗原的esi-ms圖譜。

圖5是本實(shí)施例1中呋喃妥因代謝物的半抗原的核磁共振氫譜圖譜。

圖6是本實(shí)施例4中呋喃妥因代謝物的人工抗原為免疫原制備的抗體建立的對ahd衍生物的抑制曲線。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

如圖1-5所示，本實(shí)施例1的呋喃妥因代謝物ahd衍生化半抗原通過以下方法制備，步驟如下：

(a’)將2.0g(即7.1mmol)的化合物ⅰ溶于10ml的乙醇中，加入6mol/l的氫氧化鋰溶液，將化合物ⅰ的乙醇溶液調(diào)至ph值為10-12，室溫反應(yīng)15～26h，加入40ml純化水，所得溶液用1m的稀鹽酸調(diào)ph值至4～5，過濾，烘干得到1.1g的化合物ⅱ。

esi-ms：167[m-ch2ch2ch2cooh-1]，252[m-1]，288[m+2h2o-1]，315[2×167-h2o-1]，505[2m-1]，537[2m+meoh-1]；

1hnmr(600mhz，cdcl3，tms)：δ10.50(s，1h)，8.20(d，1h)，7.35(d，1h)，7.15-7.19(dd，1h)，4.23(t，2h)，2.66(t，2h)，2.26(m，2h)。

(b’)將0.5g(即2.0mmol)的化合物ⅱ溶解于10ml甲醇中，加入0.27g(即2.4mmol)的呋喃妥因代謝物ahd，于60～70℃反應(yīng)2h，反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，過濾，得0.26g的呋喃妥因代謝物的半抗原，所述半抗原的結(jié)構(gòu)式ⅲ及其合成路線見圖1。

esi-ms：351[m+1]；

1hnmr(600mhz，dmso，tms)：δ11.39(s，1h)，8.16(t，2h)，7.40(d，1h)，7.22(dd，1h)，4.37(s，2h)，4.19(t，2h)，2.42(t，2h)，2.04(m，2h)。

實(shí)施例2

本實(shí)施例2是呋喃妥因代謝物的人工抗原，所述人工抗原包括免疫原與包被原，兩者的不同之處在于制備過程中偶聯(lián)的載體蛋白種類不同，所述免疫原采用實(shí)施例1制備的半抗原，載體蛋白采用牛血清蛋白(bsa)；所述包被原采用實(shí)施例1制備的半抗原，載體蛋白采用卵清蛋白(ova)。

本實(shí)施例2的呋喃妥因代謝物的包被原，通過以下方法制備，其步驟依次如下：

(1)取10.0mg實(shí)施例1的半抗原，溶解于0.5ml二甲基甲酰胺(dmf)中，攪拌充分后，加入8.0mg碳二亞胺(edc)和6.0mg的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，室溫下攪拌4h，即可得到半抗原活化酯；

(2)稱取38.1mg的卵清蛋白(ova)，使其充分溶解在4ml的濃度為0.01mol/l的pbs溶液中，形成載體蛋白溶液，在攪拌下將半抗原活化酯逐滴緩慢滴加至載體蛋白溶液中，并在室溫下攪拌24h；

(3)步驟(2)制得的溶液用0.01mol/l的pbs溶液室溫透析3天，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；

(4)分裝，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

其中，實(shí)施例1的半抗原與卵清蛋白(ova)的摩爾比為30：1。

本實(shí)施例2的呋喃妥因代謝物的免疫原，通過以下方法制備，其步驟依次如下：

(1’)取10.0mg實(shí)施例1的半抗原，溶解于0.5ml二甲基甲酰胺(dmf)中，攪拌充分后，加入8.0mg碳二亞胺(edc)和6.0mg的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，室溫下攪拌4h，即可得到半抗原活化酯；

(2’)稱取62.8mg的牛血清白蛋白(bsa)，使其充分溶解在4ml的濃度為0.01mol/l的pbs溶液中，形成載體蛋白溶液，在攪拌下將半抗原活化酯逐滴緩慢滴加至載體蛋白溶液中，并在室溫下攪拌24h；

(3’)步驟(2’)制得的溶液用0.01mol/l的pbs溶液室溫透析3天，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；

(4’)分裝，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

其中，實(shí)施例1的半抗原與牛血清白蛋白(bsa)的摩爾比為30：1。

其中，以下提及的免疫原式(ⅲ)-bsa即為本實(shí)施例2的呋喃妥因代謝物，包被原式(ⅲ)-ova即為本實(shí)施例2的呋喃妥因代謝物。

實(shí)施例3

本實(shí)施例3的呋喃妥因代謝物的單克隆抗體，通過以下方法制備，其步驟為：

將實(shí)施例2制備的免疫原式(ⅲ)-bsa，與等體積弗氏佐劑乳化后，免疫balb/c小鼠。每只鼠免疫劑量為50～100μg，免疫間隔3周，免疫3次后，采小鼠尾部靜脈血檢測血清效價(jià)。如抗體效價(jià)不達(dá)60000，需加強(qiáng)免疫，待抗體效價(jià)不再升高后，以100μg免疫原進(jìn)行皮下加強(qiáng)免疫，5天后取小鼠的脾細(xì)胞與sp20細(xì)胞融合。融合后的細(xì)胞在hat培養(yǎng)基中篩選，5天后以完全培養(yǎng)基替換成hat培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。用elisa對細(xì)胞上清進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果為強(qiáng)陽性的孔內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋法克隆培養(yǎng)，經(jīng)3次克隆培養(yǎng)檢測后，均呈陽性的孔內(nèi)細(xì)胞即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。將雜交瘤細(xì)胞放大培養(yǎng)后，接種至小鼠腹腔，產(chǎn)生含抗體的腹水。用辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水，即可得到高純度、高特異性的單克隆抗體。

elisa間接競爭法測定抗體陽性滴度以3倍于陰性血清的測定值為準(zhǔn)，結(jié)果表明包被原式(ⅲ)-ova對應(yīng)的抗血清(ab-式(ⅲ))效價(jià)為1：72000。

實(shí)施例4

單克隆抗體的特異性及靈敏度。

4.1酶標(biāo)板的制備方法

用ph9.6的碳酸鹽緩沖液作包被稀釋液，將實(shí)施例2制備的式(ⅲ)-ova稀釋至0.2μg/ml，按100μl/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被過夜，甩干，按250μl/孔加入含1％bsa，磷酸鹽緩沖液中37℃封閉1h，甩干，干燥后真空包裝保存。

4.2抗體的配制

用含0.05％疊氮鈉，ph7.4的磷酸鹽緩沖液，將實(shí)施例3制備的單克隆抗體稀釋至0.05μg/ml，4℃保存。

4.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

呋喃妥因代謝物ahd的衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液為精確稱量呋喃妥因代謝物ahd的衍生物標(biāo)準(zhǔn)品10mg，先用dmf和純化水各1ml溶解，再用ph7.4的磷酸鹽緩沖液配制系列濃度為0μg/l，0.05μg/l，0.15μg/l，0.45μg/l，1.35μg/l，以及4.05μg/l的呋喃妥因代謝物ahd的衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液。

4.4評價(jià)結(jié)果

向包被有(ⅲ)-ova的微孔酶標(biāo)板中加入呋喃妥因代謝物ahd的衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液50μl/孔，再加入配制好的單克隆抗體溶液50μl/孔，37℃反應(yīng)0.5h；甩干后，加入洗液300μl/孔，洗滌3次后拍干；再加入酶標(biāo)二抗100μl/孔，37℃反應(yīng)0.5h；再次洗滌3次后拍干，分別加入50μl/孔的顯色液a和顯色液b，37℃反應(yīng)15min；加入2m硫酸50μl/孔終止，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm波長測定每孔的od值。結(jié)果如表1和圖6。

表1：elisa測試不同濃度呋喃妥因代謝物ahd的衍生物標(biāo)準(zhǔn)品od值

其中，b/b0是指不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品測試孔o(hù)d值與含量為0的標(biāo)準(zhǔn)品測試孔o(hù)d值的比值。從表1中可看出，當(dāng)呋喃妥因代謝物ahd的衍生物含量為0.05μg/l時(shí)，其b/b0值為74.54％，說明其檢測od與含0μg/l濃度的呋喃妥因代謝物ahd的衍生物測試孔o(hù)d值有明顯差異，故elisa對呋喃妥因代謝物ahd的衍生物檢測靈敏度均可達(dá)0.05μg/l。

本發(fā)明采用的試劑和儀器及其它術(shù)語參見現(xiàn)有技術(shù)及公知常識。

本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施方式，如果對本發(fā)明的各種改動或變型不脫離本發(fā)明的精神和范圍，倘若這些改動和變型屬于本發(fā)明的權(quán)利要求和等同技術(shù)范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型。