本發(fā)明涉及一個新的16,17開環(huán)孕甾烷糖苷化合物及其在制備免疫抑制藥物中的應(yīng)用，特別是在制備治療器官移植抗排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病的免疫藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
免疫應(yīng)答反應(yīng)本是機體自我保護、自身穩(wěn)定的一種防御反應(yīng)，長期抑制這種反應(yīng)會帶來感染和誘發(fā)腫瘤等一些嚴重的后果,這也是目前免疫抑制劑所遇到的一些問題。免疫抑制劑在臨床為自身免疫病和器官移植后的排斥反應(yīng)提供了有效的治療藥物，通常用來抑制器官移植后出現(xiàn)的排異反應(yīng)，治療骨髓移植后出現(xiàn)的移植物抗宿主病，或治療類風濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏癥等自身免疫性疾病，一般會通過藥物進行免疫抑制。自身免疫性疾病大多為慢性或進行性疾病需要長期用藥，而現(xiàn)有的糖皮質(zhì)激素(如地塞米松)和免疫抑制劑長期用藥普遍存在毒副作用大、使用不方便等缺點，如地塞米松等糖皮質(zhì)激素類藥物、氯霉素類藥物、四環(huán)素類藥物和磺胺類藥物等?？蓪?dǎo)致機體免疫抑制。因此，迫切需要研制一類高效低毒的新型免疫抑制劑，相比于化學治療，中藥作為一種天然產(chǎn)物，具有與人組織相容性質(zhì)好、副作用小等優(yōu)點，在免疫抑制劑的研究中越來越受到人們的重視。
思茅藤(epigynumauritum)是夾竹桃科思茅藤族思茅藤屬的一個種，產(chǎn)于云南南部，根據(jù)我們前期的研究結(jié)果，思茅藤中含有較多結(jié)構(gòu)新穎雄甾烷、c21甾體及其糖苷類化合物。在發(fā)現(xiàn)新藥先導(dǎo)化合物的興趣驅(qū)動下，我們對這些新化合物進行了大量的生物活性篩選實驗，本發(fā)明提供的16,17開環(huán)孕甾烷糖苷化合物及其作為免疫抑制藥物目前尚未見報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供式ⅰ所示的孕甾烷糖苷化合物，其為具有藥用價值的16,17開環(huán)孕甾烷糖苷化合物：
式ⅰ：16-acetylpregn-5-ene-20-one-17-ol-3-o-2′-methoxy-6-deoxy-β-d-idopyranose；
epigynosided，中文名為16-乙酰基-17-羥基-孕甾烷-5(6)-烯-20-酮3-o-2′-甲氧基-6′-去氧-β-d-艾杜糖苷，俗名為思茅藤苷丁。
本發(fā)明的另一目的是將上述思茅藤孕甾烷糖苷類化合物應(yīng)用在制備免疫抑制藥物中。
具體是免疫抑制藥物應(yīng)用在制備自身免疫性疾病的治療藥物中，或應(yīng)用在制備器官移植抗排斥反應(yīng)的治療藥物中。
本發(fā)明所述應(yīng)用中還可以加入一種或多種藥物上可接受的輔料，所述輔料包括藥學領(lǐng)域常規(guī)的填充劑、稀釋劑、粘合劑、賦形劑、吸收促進劑、填充劑、表面活性劑和穩(wěn)定劑等，必要時還可加入香味劑、色素和甜味劑等。
本發(fā)明所述應(yīng)用除制成膠囊外，還可以制成丸劑、粉劑、片劑、粒劑、口服液和注射液等多種形式。
本發(fā)明中用健康的balb/c小鼠來制備脾細胞用于試驗。脾細胞制備完成后，通過cona或者lps進行誘導(dǎo)，同時在試驗組加入不同濃度供試化合物，培養(yǎng)72h后，通過cck-8試劑法分別測定試驗組、誘導(dǎo)對照組和未誘導(dǎo)對照組的吸光值，從而評價化合物刺激t細胞或者b細胞增殖的能力；實驗結(jié)果表明本發(fā)明中涉及的孕甾烷糖苷化合物，思茅藤苷丁(epigynosided)對cona(伴刀豆蛋白)刺激的balb/c小鼠脾淋巴細胞增殖有明顯的抑制作用，與不加該化合物的對照組相比有顯著性差異(p<0.05)。
具體實施方式
下面通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此，本實施例中方法如無特殊說明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規(guī)市售試劑或按常規(guī)方法配置的試劑。
實施例1：思茅藤苷丁的制備
取風干后的11kg思茅藤莖樣品，粉碎后用甲醇回流提取3次，回收溶劑，濃縮至小體積，再用乙酸乙酯萃取3次，濃縮乙酸乙酯層，稱重得110g；將乙酸乙酯層部分用大孔吸附樹脂d101進行粗分，分別用體積百分比40％、60％、80％、100％的甲醇水溶液進行洗脫總共得到4個部分(fr.a、fr.b、fr.c、fr.d)。fr.c(25.7g)通過c18中壓柱以體積百分比20％-70％甲醇水溶液進行梯度洗脫得到四個部分fr.c1-c4。fr.c2(1.2g)通過sephadexlh-20(流動相為氯仿：甲醇＝1:1)洗脫，緊接著再通過c18中壓柱和半制備液相制備得到式ⅰ的思茅藤苷丁(9.6mg)。經(jīng)鑒定，式ⅰ中的化合物為新化合物。
鑒定結(jié)果如下：
思茅藤苷丁(epigynosided)為白色粉末，溶于氯仿甲醇混合液(氯仿：甲醇＝1:1)、吡啶等。
以上所述1個16,17開環(huán)孕甾烷糖苷化合物為新的天然有機化合物。
表1：思茅藤苷丁(epigynosided)的1hnmr和13cnmr數(shù)據(jù)
實施例2：免疫抑制檢測試驗
(1)脾細胞懸液的制備
取18～22g的健康babl/c小鼠放血處死，置于75％酒精中浸泡消毒5分鐘，取出，置于無菌托盤中，左側(cè)朝上，在超凈臺中，用消毒過的鑷子夾起腹中部皮毛，作一切口，用另外一套器械剪開腹壁各層，用第三套器械將脾取出，去除脂肪和結(jié)締組織，放入pbs(磷酸鹽緩沖液)中，洗去浮血。然后將脾組織移至盛有rpmi1640不完全培養(yǎng)液的平皿中，用剪刀剪成小塊，用無菌注射器芯在200目不銹鋼篩網(wǎng)中將脾研碎，用pbs少量多次沖洗，將懸液用移液器轉(zhuǎn)移至15ml離心管中。1000r/min轉(zhuǎn)速離心5min。吸棄上清液，加入3ml紅細胞裂解液(tris-nh4cl)混勻，靜置2min后加入10mlpbs終止反應(yīng)，離心(1200rpm,5min)，去上清，沉淀用5mlpbs洗滌兩次，同樣條件下離心。沉淀用5ml含10％胎牛血清的rpmi1640完全培養(yǎng)液懸浮；以0.8％臺盼蘭活細胞拒染法計數(shù)，活細胞數(shù)不少于95％，加rpmi1640完全培養(yǎng)液稀釋，調(diào)整細胞濃度至1×106個/ml左右。
(2)供試液的制備
精密稱取單體化合物2mg，加入適量的dmso溶解，上樣前用pbs稀釋至所需濃度，并使得上樣后的dmso終濃度不超過0.1％。
(3)實驗分組
正常對照組：100μl脾細胞懸液+10μlrpmi1640完全培養(yǎng)基+10μlpbs
模型組：100μl脾細胞懸液+10μlcona(終濃度為10μg/ml)+10μlpbs
樣品組：100μl脾細胞懸液+10μlcona(終濃度為10μg/ml)+10μl樣品
96孔板中，每孔加入淋巴細胞懸液(1×106個/ml)100μl，cona10μl(終濃度為10μg/ml)，不同濃度試藥化合物稀釋液10μl(終濃度分別為12.5、25、50μg/ml)，地塞米松也做三個對應(yīng)的濃度組，正常對照組孔分別用10μl的1640完全培養(yǎng)液(含10％胎牛血清)和10μl的pbs補齊，每個濃度組設(shè)4個平行。
(4)培養(yǎng)：置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72小時。
(5)cck-8法測定細胞od值
培養(yǎng)72小時后，每孔中加入10μl的cck-8試劑(碧云天)，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，在450nm處測定每孔的吸光值以計算細胞增殖情況，并按下式計算刺激指數(shù)(si)：
si(刺激指數(shù))＝加有絲分裂原培養(yǎng)物的od值/不加有絲分裂原培養(yǎng)物的od值
(6)數(shù)據(jù)處理
實驗數(shù)據(jù)od值采用“平均數(shù)±標準差”來表示，數(shù)理統(tǒng)計及方差分析工作采用origin軟件完成。
(7)實驗結(jié)果
表2：思茅藤苷丁對cona刺激的balb/c小鼠脾淋巴細胞增殖的刺激指數(shù)
本發(fā)明式ⅰ中思茅藤苷丁(epigynosided)在濃度為12.5、25、50μm時的刺激指數(shù)分別為2.93，2.34，2.02；顯著性分析表明，中濃度和高濃度組與模型組相比有顯著性差異(p<0.05)
陽性對照結(jié)果為：
表3：地塞米松對cona刺激的balb/c小鼠脾淋巴細胞增殖的刺激指數(shù)
地塞米松在濃度為12.5、25、50μm時的刺激指數(shù)分別為1.62，1.41，1.21；
顯著性分析表明，各濃度組與模型組相比有顯著性差異(p<0.05)。
實驗結(jié)果表明，思茅藤苷丁(epigynosided)在濃度為25μm時具有免疫抑制活性。